CN117887890A - 一种与小麦籽粒蛋白质含量相关的snp分子标记、kasp引物对及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于小麦分子遗传育种技术领域，具体涉及一种与小麦籽粒蛋白质含量相关的SNP分子标记、KASP引物对及其应用。所述的与小麦籽粒蛋白质含量相关的SNP分子标记的SNP位点对应于中国春小麦参考基因组RefSeq v1.1版本参考序列6A染色体上第77098019bp处G>A突变或第77097875bp处T>G突变。该分子标记与小麦籽粒蛋白质含量相关主效QTL簇C6A.2和TaGPC‑A1基因紧密连锁。本发明还开发出紧密连锁、便于检测的KASP引物对，为小麦籽粒蛋白质含量性状的品质遗传改良和利用分子标记辅助选择育种提供了标记，对加速小麦新种质创制、缩短育种进程和提高育种效率具有重要的实践意义。
Description
技术领域
本发明属于小麦分子遗传育种技术领域，具体涉及一种与小麦籽粒蛋白质含量相关的SNP分子标记、KASP引物对及其应用。
背景技术
小麦品质相关性状是小麦中的重要营养成分，对人类健康和饮食均衡起着至关重要的作用。蛋白质是小麦籽粒中重要的营养成分，与营养和品质密切相关。研究发现，小麦籽粒蛋白质含量(Grain Protein Content，GPC)、湿面筋含量(Wet Gluten Content，WGC)和沉降值(Sedimentation Value，SV)等品质相关性状属于数量性状，受多基因控制。不同品种的小麦中蛋白质含量及其各组分的含量也各有不同，一般来说，小麦籽粒蛋白质含量范围为10％-18％【LIU J,FENG B,XU Z,et al.Agenome-wide association study ofwheat yield and quality-related traits in southwest China[J].Mol Breeding,2017,38(1):1-11.】。
我国对小麦品质的研究起步较晚，优质强筋、弱筋、高蛋白含量等专用品种仍然较少，小麦品质仍处于中低水平，不能完全满足育种与消费需求。但随着分子生物学、生物技术以及基因组学的快速发展，小麦的基因研究进入了一个快速发展和广泛应用的时代，这得益于小麦高通量分子标记技术和多功能基因组学的革命性进展(Mao et al,Wheatfunctional genomics research in China:a decade of development[J].The CropJournal,2018,6(1):1-6.)。特别是KASP(Kompetitive Allele-Specific PCR，竞争性等位基因特异性PCR)技术在标记类型中的突出表现，以其高通量、准确便捷和低成本等优势，在小麦、水稻和玉米等作物的SNP位点检测方面得到广泛应用，进而使得研究人员可以更加高效地发掘和开发小麦相关的基因，为粮食产量和作物改良做出更大贡献。
发掘小麦籽粒中蛋白质相关的基因位点并开发相关分子标记，不仅能为深入了解小麦的营养成分特性，为提高小麦品质和人类饮食提供科学依据，同时能够为更深刻地解读小麦籽粒中品质相关性状表达的分子遗传机制提供理论依据，为分子标记用于小麦品种品质改良，帮助选育出专用型的小麦新品种，促进小麦育种和生产等提供理论基础。
发明内容
为了克服现有技术的不足和缺点，本发明的首要目的在于提供一种与小麦籽粒蛋白质含量相关的SNP分子标记。
本发明的另一目的在于提供一种鉴定上述SNP分子标记的KASP引物对，该引物对不仅可用于检测小麦籽粒蛋白质含量相关的主效QTL簇C6A.2和TaGPC-A1基因的基因型，还可用于检测小麦杂交后代中该位点的基因型，以及应用于小麦育种中对小麦籽粒蛋白质含量相关性状的辅助选择等。
本发明的再一目的在于提供一种鉴定上述SNP分子标记的试剂盒，该试剂盒包含上述KASP引物对。
本发明的第四个目的在于提供上述SNP分子标记、KASP引物对或试剂盒的应用。
本发明的第五个目的在于提供一种检测或辅助检测小麦籽粒蛋白质含量的主效QTL簇C6A.2、TaGPC-A1基因或上述SNP分子标记的方法。
本发明的目的通过下述技术方案实现：
一种与小麦籽粒蛋白质含量相关的SNP分子标记，其SNP位点对应于中国春小麦参考基因组RefSeq v1.1版本参考序列6A染色体上第77098019bp处G>A突变或6A染色体上第77097875bp处T>G突变；该位点碱基的多态性影响小麦籽粒蛋白质含量；
所述的SNP分子标记的核苷酸序列优选如下所示(SEQ ID NO:1)：
AACGCATGGTAATTGCATACACGGGTATGATTCATCTACATGGACCTACATTGTATAACTTTTTTTTCGCGAATGAAGTTTTGTGAACTACTATGTTGCAGTGGTTTAGTTATTAMTTATGTGAGTGGCCCTTATGCGCCAATCTTTTATACATAGATTGGAATTTATATGCTAAATATGTTTGAAAATTGTGTGTTATCTCCTTAATTTCACTTTTCAAAGGAAAACTTCATCTTGACAGTTATCACATGTATAAGCTTTCCACGGACGCCTCCCTAATCACCGCGCTCATGTAA
其中，M为G或A，M的不同导致小麦籽粒蛋白质含量的差异；
或所述的SNP分子标记的核苷酸序列优选如下所示(SEQ ID NO:2)：
AACGCATGGTAATTGCATACACGGGTATGATTCATCTACATGGACCTACATTGTATAACTTTTTTTTCGCGAATGAAGTTTTGTGAACTACTATGTTGCAGTGGTTTAGTTATTAATTATGTGAGTGGCCCTTATGCGCCAATCTTTTATACATAGATTGGAATTTATATGCTAAATATGTTTGAAAATTGTGTGTTATCTCCTTAATTTCACTTTTCAAAGGAAAACTTCATCTTGACAGTTATCACATGTATAAGCTYTCCACGGACGCCTCCCTAATCACCGCGCTCATGTAA
其中，Y为T或G，Y的不同导致小麦籽粒蛋白质含量的差异；
所述的SNP分子标记与小麦籽粒蛋白质含量相关的主效QTL簇C6A.2和TaGPC-A1基因紧密连锁；所述的主效QTL簇C6A.2位于小麦6A染色体短臂上，对应于中国春小麦RefSeqv1.1基因组版本的38.47-82.95Mb的物理区间内；
一种用于鉴定上述SNP分子标记的KASP引物对，包含引物对一和引物对二中的至少一种，其中，引物对一包含引物1、引物2和引物3(用于检测SNP位点对应于中国春小麦参考基因组RefSeq v1.1版本参考序列6A染色体上第77098019bp处G>A突变的分子标记)，其核苷酸序列如下所示：
引物1：5’-GCATAAGGGCCACTCACATAAC-3’；
引物2：5’-GCATAAGGGCCACTCACATAAT-3’；
引物3：5’-GCATGGTAATTGCATACACGGG-3’；
引物对二包含引物4、引物5和引物6(用于检测SNP位点对应于中国春小麦参考基因组RefSeq v1.1版本参考序列6A染色体上第77097875bp处T>G突变的分子标记)，其核苷酸序列如下所示：
引物4：5’-TAGGGAGGCGTCCGTGGAA-3’；
引物5：5’-TAGGGAGGCGTCCGTGGAC-3’；
引物6：5’-CCTTATGCGCCAATCTTTTATACA-3’；
所述的引物1和引物2、引物4和引物5的5’端优选分别添加荧光标签序列；
所述的荧光标签序列可以为荧光标签序列FAM和荧光标签序列HEX中的至少一种，但引物1和引物2的荧光标签序列不能相同，引物4和引物5的荧光标签序列不能相同；
所述的引物1的核苷酸序列优选为：
5’-GAAGGTGACCAAGTTCATGCTGCATAAGGGCCACTCACATAAC-3’；其中，横线下划线部分为荧光标签序列FAM；
所述的引物2的核苷酸序列优选为：
其中，波浪下划线部分为荧光标签序列HEX；
所述的引物4的核苷酸序列优选为：
5’-GAAGGTGACCAAGTTCATGCTTAGGGAGGCGTCCGTGGAA-3’；其中，横线下划线部分为荧光标签序列FAM；
所述的引物5的核苷酸序列优选为：
其中，波浪下划线部分为荧光标签序列HEX；
一种用于鉴定上述SNP分子标记的试剂盒，包含上述KASP引物对；
所述的SNP分子标记、KASP引物对或试剂盒在检测小麦籽粒蛋白质含量性状中的应用；
一种检测或辅助检测小麦籽粒蛋白质含量相关的主效QTL簇C6A.2、TaGPC-A1基因或上述SNP分子标记的方法，包含如下步骤：
(1)提取待测小麦样本基因组DNA；
(2)以小麦样本基因组DNA为模板，采用上述KASP引物对或上述试剂盒中的KASP引物对进行PCR扩增，获得扩增产物；
(3)将步骤(2)中获得的扩增产物进行荧光信号扫描、数据分析和基因分型；
步骤(2)中所述的扩增体系(4μL)优选为：
2μL小麦样本基因组DNA，2μL的2×KASP master Mix和0.045μL的KASP引物工作液；
所述的小麦样本基因组DNA浓度优选为30ng/μL；
所用的KASP引物工作液中引物1、引物2和引物3的浓度分别优选为12μM、12μM和30μM；
所用的KASP引物工作液中引物4、引物5和引物6的浓度分别优选为12μM、12μM和30μM；
所述的2×KASP master Mix中含有FAM荧光探针、HEX荧光探针和淬灭探针等；
步骤(3)中所述的基因分型的具体方法为：
将步骤(2)获得的扩增产物进行荧光信号扫描，然后采用Bio-Rad CFX384TMMaestro软件对扫描后的结果进行数据分析，根据分析的结果对不同小麦品种进行基因分型；
对于突变位点M，若待测小麦DNA扩增产物的荧光信号数据经Bio-Rad CFX384TMMaestro软件分析呈蓝色，则小麦基因型为TT；若待测小麦DNA扩增产物的荧光信号数据经Bio-Rad CFX384TM Maestro软件分析呈桔黄色，则小麦基因型为CC；若待测小麦DNA扩增产物的荧光信号数据经Bio-Rad CFX384TM Maestro软件分析呈绿色，则小麦基因型为CT；
对于突变位点Y，若待测小麦DNA扩增产物的荧光信号数据经Bio-Rad CFX384TMMaestro软件分析呈蓝色，则小麦基因型为CC；若待测小麦DNA扩增产物的荧光信号数据经Bio-Rad CFX384TM Maestro软件分析呈桔黄色，则小麦基因型为AA；若待测小麦DNA扩增产物的荧光信号数据经Bio-Rad CFX384TM Maestro软件分析呈绿色，则小麦基因型为CA；
所述的SNP分子标记、KASP引物、试剂盒或上述方法在以下(A)-(F)任意一种中的应用：
(A)用于检测小麦或小麦杂交后代的籽粒蛋白质含量相关的主效QTL簇C6A.2或TaGPC-A1基因的基因型；
(B)用于鉴定或辅助鉴定小麦籽粒蛋白质含量性状；
(C)用于培育、筛选或辅助筛选具有高或低的籽粒蛋白质含量性状的小麦单株、株系、品系或品种；
(D)制备用于检测小麦或小麦杂交后代的籽粒蛋白质含量的主效QTL簇C6A.2或TaGPC-A1基因的基因型的产品；
(E)制备用于鉴定或辅助鉴定小麦籽粒蛋白质含量性状的产品；
(F)制备用于培育、筛选或辅助筛选具有高或低的籽粒蛋白质含量性状的小麦单株、株系、品系或品种的产品；
本发明相对于现有技术具如下的优点及效果：
(1)本发明利用Avocet/Chilero F6和Avocet/Huites F6两个重组自交系(Recombinant inbred lines，RIL)群体，简称AC群体和AH群体，基于55K SNP芯片构建的AC群体的高密度遗传连锁图谱和基于DArT(Diversity Arrays Technology，DArT)标记构建的AH群体的高密度遗传连锁图谱进行了QTL定位分析，在小麦的6A染色体短臂上定位到了1个控制小麦籽粒蛋白质含量相关的主效QTL簇C6A.2。结果表明，主效QTL簇C6A.2的LOD值范围为2.97-9.33，可解释5.72％-21.97％的表型变异，可在多个不同的环境下被重复检测到，是一个稳定的主效QTL簇。该位点位于小麦6A染色体短臂上，对应于中国春小麦RefSeqv1.1基因组版本的38.47-82.95Mb的物理区间内。在该候选区段内，筛选到一个与小麦籽粒蛋白质含量性状相关候选基因TaGPC-A1(TraesCS6A02G108300)，在该基因第三外显子区的77098019bp(突变位点M)和77097875bp(突变位点Y)位置上，鉴定到两个单碱基突变位点，即M和Y，其中M为G/A突变，Y为T/G突变。对于M突变位点，当采用引物1-3鉴定时，若扩增引物碱基表现为C时，小麦籽粒蛋白质含量增加，碱基表现为T时，小麦籽粒中的蛋白质含量降低。对于Y突变位点，当采用引物4-6鉴定时，若扩增引物碱基表现为C时，小麦籽粒蛋白质含量增加，碱基表现为A时，小麦籽粒中的蛋白质含量降低。
(2)本发明针对于位于小麦6A染色体短臂的77098019bp(突变位点M)和77097875bp(突变位点Y)处的两个SNP分子标记位点，设计了两套KASP引物对，在166份来自于全球各地的小麦品种或优异品系中进行了效应验证，证实了这两套标记可用于对小麦籽粒蛋白质含量的分子标记辅助选择育种。
综上，本发明在小麦的6A染色体短臂上定位到了1个控制小麦籽粒蛋白质含量性状相关的主效稳定QTL簇C6A.2，并筛选到一个候选基因TaGPC-A1(TraesCS6A02G108300)，根据候选基因第三外显子区的77098019bp(突变位点M)和77097875bp(突变位点Y)位置上设计了两套KASP引物，为小麦籽粒蛋白质含量性状的遗传改良提供了目标位点和筛选标记。本发明基于与蛋白质性状相关的QTL簇C6A.2中筛选到的候选基因，开发出与该候选基因紧密连锁的、便于检测的KASP标记，为小麦籽粒蛋白质含量性状的遗传改良和分子标记辅助选择育种提供了可用标记，能大大提高检测的效率，缩短育种进程和提高育种效率。
附图说明
图1是QTL簇C6A.2在遗传连锁图谱中的示意图。
图2是针对于M突变位点的KASP引物对一对166份国际小麦品种基因分型的结果图，其中，A：基因分型结果，B：基因型和表型关联统计分析，GPC：蛋白质含量，E8：2020-2021年种植于河南科技大学农学院试验田，E9：2021-2022年种植于河南科技大学农学院试验田，*代表P<0.05，**代表P<0.01。
图3是针对于Y突变位点的KASP引物对二对166份国际小麦品种基因分型的结果图，其中，A：基因分型结果，B：基因型和表型关联统计分析，GPC：蛋白质含量，E8：2020-2021年种植于河南科技大学农学院试验田，E9：2021-2022年种植于河南科技大学农学院试验田，*代表P<0.05，**代表P<0.01。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
1.本发明提供一个控制小麦籽粒蛋白质性状的稳定主效QTL簇C6A.2，具体为：
利用Avocet/Chilero F6和Avocet/Huites F6两个重组自交系群体(Yuying Wang,Zhankui Zeng,Jiachuang Li,Dehui Zhao,Yue Zhao,Peng Chen,Caixia Lan,ChunpingWang.Identification and validation of new quantitative trait loci for spike-related traits in two RIL populations[J].Molecular Breeding,2023,43,64.https://doi.org/10.1007/s11032-023-01401-4)，分别基于55K SNP芯片构建的AC群体的高密度遗传连锁图谱和基于DArT(Diversity Arrays Technology，DArT)标记构建的AH群体的高密度遗传连锁图谱进行了QTL定位分析，结果表明，主效QTL簇C6A.2的LOD值范围为2.97-9.33，可解释5.72％-21.97％的表型变异，可在多个不同的环境下被重复检测到，是一个稳定的主效QTL簇。该位点位于小麦6A染色体短臂上，对应于中国春小麦RefSeqv1.1基因组版本的38.47-82.95Mb的物理区间内。在该候选区段内，筛选到一个与小麦籽粒蛋白质性状相关候选基因TaGPC-A1(TraesCS6A02G108300)，在该基因第三外显子区的77098019bp(突变位点M)和77097875bp(突变位点Y)位置上，鉴定到两SNP突变位点，即M和Y，其中M为G>A突变，Y为T>G突变。对于Y突变位点，当采用下述引物1-3鉴定时，若扩增引物碱基表现为C时，小麦籽粒蛋白质含量增加，当碱基表现为T时，小麦籽粒中的蛋白质含量降低。对于Y突变位点，当采用引物4-6鉴定时，若扩增引物碱基表现为C时，小麦籽粒蛋白质含量增加，当碱基表现为A时，小麦籽粒中的蛋白质含量降低。
2.在本发明提供的控制小麦籽粒蛋白质含量性状相关的稳定主效QTL簇C6A.2的基础上，根据此位点候选物理区间内的注释基因，筛选到一个与小麦籽粒蛋白质含量相关的候选基因TaGPC-A1(TraesCS6A02G108300)，并在该基因第三外显子区的77098019bp(突变位点M)和77097875bp(突变位点Y)位置上，鉴定到两个单碱基突变位点，即M和Y，其中M为G>A突变，Y为T>G突变。
3.本发明针对于上述SNP分子标记，提供了一套KASP引物对，每套KASP引物对包含三条序列，具体包括针对突变位点M设计的引物1、引物2和引物3，针对突变位点Y设计的引物4、引物5和引物6(见表1)，其中，引物3针对突变位点M设计的长度为22bp的共同引物，引物6是针对突变位点Y设计的长度为24bp的共同引物。
4.本发明还提供了一种检测上述SNP分子标记的试剂盒，该试剂盒包含上述KASP引物对；
所述的试剂盒还包含2×KASP master Mix，为英国LGC公司产品，可用于96/384孔板；
所述的2×KASP master Mix包含FAM荧光探针、HEX荧光探针和淬灭探针等；
所述的引物或试剂盒用于检测或辅助检测小麦籽粒蛋白质含量性状相关主效QTL簇C6A.2或TaGPC-A1基因的基因型，具体方法为：
以待测小麦样品DNA为模板，采用上述KASP引物对或上述试剂盒的KASP引物对进行PCR扩增，然后将扩增产物进行荧光信号扫描、数据分析和基因分型；根据分析结果确定主效QTL簇C6A.2或TaGPC-A1基因的基因型：
针对M突变位点：
若待测小麦DNA扩增产物的荧光信号数据经Bio-Rad CFX384TM Maestro软件分析呈蓝色，则小麦主效QTL簇C6A.2的基因型为TT；
若待测小麦DNA扩增产物的荧光信号数据经Bio-Rad CFX384TM Maestro软件分析呈桔黄色，则小麦主效QTL簇C6A.2的基因型为CC；
若待测小麦DNA扩增产物的荧光信号数据经Bio-Rad CFX384TM Maestro软件分析呈绿色，则小麦主效QTL簇C6A.2的基因型为CT。
针对Y突变位点：
若待测小麦DNA扩增产物的荧光信号数据经Bio-Rad CFX384TM Maestro软件分析呈蓝色，则小麦主效QTL簇C6A.2的基因型为CC；
若待测小麦DNA扩增产物的荧光信号数据经Bio-Rad CFX384TM Maestro软件分析呈桔黄色，则小麦主效QTL簇C6A.2的基因型为AA；
若待测小麦DNA扩增产物的荧光信号数据经Bio-Rad CFX384TM Maestro软件分析呈绿色，则小麦主效QTL簇C6A.2的基因型为AC。
实施例中，与主效QTL簇C6A.2紧密连锁的分子标记的序列如下所示(下述分子标记中的N为单碱基突变)：
AX-94591230：GACGTTGATGGCTTTCATCCAGTGAACATTGGACGANGCTTGCGATGCAAGGTCGGGATCCATTCTTTGTTCC
AX-111504079：TCGTCCGCCGCAACACCATCACCATCGTCGTGGACANGGGCACACGAGATTTTATGCCGATCATTTCCCCAGG
AX-109974361：CTTGAATCCGCCCTTGCCCTTCCCTTCGGCCAGATANGCCTACTCAAGAACGGAATCCAACAACACATAAGAG
AX-109042664：CGTGACAAGTCTGAATGAGGAGGCGGAAGTGATCCANGGCGGGAGAAGGCCGGCTTGCGGTGGTTGTGTGAGC
AX-108939533：AACAAGATGGTCAACAAAGGGAACGAGATCCAACCANGACATGTGGTTGGCTGGTTAGGAGGACATTGGTACC
AX-111122628：ATCTCTGTATGGTTAGGTTTTATTTTATTAGATCGANGATTTTAGTGCGCTTTATTTACGGTTAGTTCGGTTT
SNP4910893：TGCAGCTCCTGGTCGAGGCGCTGGATGGCGGCGGAGAGGCGGTGCTTCCCCACGTACCCCACGCTCCTN
SNP1096119：TGCAGCGGCGAGACAACGGAAGATAGGAGGAGGAGGAGGGGCGGCGGCGAGGCGGCGGCTCACGTACCN
DArT3026247：TGCAGCAATGATTCCCGCATATCCCTCCCATTATCACCCAACCGAGATCGGAAGAGCGGTTCAGCAGGN
DArT100000998：TGCAGCTGCGGACGGCGGTGGAAGGGGGATCGCCGAGATCGGAAGAGCGGTTCAGCAGGAATGCCGAG
实施例中的籽粒蛋白质含量的测定方法参照参考文献(Jiang P,Zhang P,Wu L,He Y,Li C,Ma H,Zhang X.Linkage and association mapping and Kompetitiveallele-specific PCR marker development for improving grain protein content inwheat[J].Theor Appl Genet,2021,134:3563-3575.)进行；
实施例中的小麦品种Avocet和Chilero已在参考文献(Ponce-Molina et al,Characterization of leaf rust and stripe rust resistance in spring wheat“Chilero”[J].Plant Disease,2018,102(2):1-35.)中公开；
实施例中的小麦品种Huites已在参考文献(Wang Y,Zeng Z,Li J,Zhao D,ZhaoY,Peng C,Lan C,Wang C.Identification and validation of new quantitative traitloci for spike-related traits in two RIL populations.Mol Breed.2023Jul 31；43(8):64.doi:10.1007/s11032-023-01401-4.PMID:37533603；PMCID:PMC10390419.)中公开；
实施例中，KASP引物的设计采用在线设计工具Polymarker(http://www.polymarker.info/)进行，其基本原理是利用BLAST工具检索小麦的参考基因组，获得同源性最高的序列，然后进行多序列的比对，根据比对结果中的特异性碱基设计染色体特异的KASP引物。设计好的引物交由生工生物科技(上海)有限公司进行合成。
实施例1小麦籽粒蛋白质性状相关主效QTL位点簇C6A.2的获得
(1)利用小麦品种Avocet为母本，小麦品种Chilero为父本进行杂交，通过单粒传法，获得含有164份家系的Avocet/Chilero F6重组自交系群体(AC群体)；以Avocet为母本，小麦品种Huites为父本进行杂交，通过单粒传法，获得含有175份家系的Avocet/Huites F6RIL群体(AH群体)，构成两个遗传作图群体。
(2)Avocet/Chilero F6重组自交系群体(AC群体)和Avocet/Huites F6重组自交系群体(AH群体)的小麦籽粒蛋白质含量等性状的表型鉴定：AC群体在2019-2020年种植于河南洛宁(E1,34°38'N,111°65'E)和河南孟津(E2,34°49'N,112°26'E)，2020-2021年种植于河南科技大学农学院试验田(E3,34°62'N,112°45'E)和河南孟津(E4,34°49'N,112°26'E)。AH群体在2019-2020年种植于河南科技大学农学院试验田(E5,34°62'N,112°45'E)，2020-2021年种植于河南科技大学农学院试验田(E6,34°62'N,112°45'E)和河南孟津(E7,34°49'N,112°26'E)。166份自然群体(实施例2中的166份国际圃小麦品种(系))在2020-2021年和2021-2022种植于河南科技大学农学院试验田(E8和E9,34°62'N,112°45'E)，其中，E1-E9是指种植环境的代号。
(3)分子检测：对上述两个RIL群体的标记分型详见参考文献(Wang Y,Zeng Z,LiJ,Zhao D,Zhao Y,Peng C,Lan C,Wang,C.Identification and validation of newquantitative trait loci for spike-related traits in two RIL populations[J].Mol Breed,2023,43:64.)，其中，分别采用覆盖全基因组的小麦55K SNP芯片(中玉金标记生物技术股份有限公司)(AC群体)和DArT标记(澳大利亚Triticarte股份有限公司)(AH群体)对两个群体进行基因分型，质控去除冗余标记，AC群体剩余1029个SNP标记，AH群体剩余6435个DArT标记用于后续构建遗传图谱及连锁分析。
(4)构建遗传图谱及连锁分析：利用QTL IciMapping v4.2中的完备区间作图法(Inclusive Composite Interval Mapping，ICIM)进行QTL定位，LOD阈值设置为2.5，将间距小于10cM或共用侧翼标记的QTL视为同一个位点，表型贡献率>10％的为主效QTL。QTL命名方法为“Q+性状名称缩写+研究机构名称缩写+染色体编号+染色体上的次序”的国际通用命名方式，QTL簇的命名方法参照Luo等(Luo Q,Zheng Q,Hu P,Liu L,Yang G,Li H,Li B,Li Z.Mapping QTL for agronomic traits under two levels of salt stress in anew constructed RIL wheat population[J].Theor Appl Genet,2021,134:171-189.)。使用MapChart2.3(https://www.wur.nl/en/show/Mapchart.htm)绘制遗传连锁图谱。
(5)小麦籽粒蛋白质含量相关QTL簇的定位结果，请参阅图1，在6A染色体短臂上定位到一个与小麦籽粒蛋白质含量相关的主效位点簇，暂命名为C6A.2，LOD值范围为2.97-9.33，可解释5.72％-21.97％的表型变异，可在多个不同的环境下被重复检测到，是一个稳定的主效QTL簇。该位点位于小麦6A染色体短臂上，对应于中国春小麦RefSeq v1.1基因组版本的38.47-82.95Mb的物理区间内。
实施例2KASP引物的设计、验证及利用
一、KASP引物的设计
利用实施例1中在6A染色体上定位到与小麦籽粒蛋白质含量相关的稳定性主效QTL位点簇C6A.2，在其候选物理区间内筛选到一个候选基因TaGPC-A1(TraesCS6A02G108300)，在该基因第三外显子区的77098019bp(突变位点M)和77097875bp(突变位点Y)位置上利用小麦基因组变异联合数据库(http://wheat.cau.edu.cn/WheatUnion/b_4/)查询查询到的两个变异位点和KASP标记在线设计工具Polymarker(http://www.polymarker.info/)设计了两套KASP引物。将设计好的引物交由生工生物科技(上海)有限公司进行合成。
在该基因TaGPC-A1第三外显子区的77098019bp(突变位点M)和77097875bp(突变位点Y)位置上分别存在一个SNP位点，即Y突变位点M和突变位点，其中突变M为G/A突变，突变位点Y为T/G突变，对应的SNP分子标记的核苷酸序列如下所示：
AACGCATGGTAATTGCATACACGGGTATGATTCATCTACATGGACCTACATTGTATAACTTTTTTTTCGCGAATGAAGTTTTGTGAACTACTATGTTGCAGTGGTTTAGTTATTAM GCCAATCTTTTATACA]TAGATTGGAATTTATATGCTAAATATGTTTGAAAATTGTGTGTTATCTCCTTAATTTCACTTTTCAAAGGAAAACTTCATCTTGACAGTTATCACATGTATAAGCTY[TCCACGGACGCCTCCCTA]ATCACCGCGCTCATGTAA
其中，M为G或A，Y为T或G；双下划线部分为突变位点M对应的上下游引物，中括号部分为突变位点Y对应的上下游引物；
根据该SNP设计的KASP引物见表1。
表1检测小麦籽粒蛋白质含量的两套KASP引物序列表
注：下划线部分为FAM荧光基团，波浪线部分为HEX荧光基团；上述引物是在SEQ IDNO:1的反向互补序列基础上设计得到的。
二、KASP引物的验证及利用
(1)实验材料为166份国际圃小麦品种(系)，具体信息见表2。该试验材料分别2020-2021年和2021-2022种植于河南科技大学农学院试验田(E8和E9)两个环境中，所有群体均采用随机区组设计，单行种植，行长2m，行距25cm，株距8cm，单粒点播，3次重复。试验田四周设50cm保护行，按照当地常规栽培措施进行田间管理。整个生育期无严重病虫害及倒伏现象。
(2)对166份国际圃小麦品种(系)材料提取DNA，然后使用表1中的两套引物分别进行PCR扩增，PCR反应体系(4μL)如下：2μL小麦样本基因组DNA，2μL的2×KASP master Mix和0.045μL的KASP引物工作液；其中在2×KASP master Mix中含有FAM荧光探针、HEX荧光探针和淬灭探针等，小麦样本基因组DNA浓度为30ng/μL，KASP引物工作液中引物1、引物2和引物3的浓度分别为12μM、12μM和30μM，引物4、引物5和引物6的浓度分别为12μM、12μM和30μM；PCR扩增程序为：首先，在95℃下预变性15min；然后在95℃下变性20s，65℃下退火并延伸1min(从第二个循环开始，每个循环降低1℃，共设置了9个循环)；其次在95℃变性10s；最后65℃下退火并延伸1min。
(3)然后将扩增产物进行荧光信号扫描、数据分析和基因分型；根据分析结果：
对于突变位点M：
若待测小麦DNA扩增产物的荧光信号数据经Bio-Rad CFX384TM Maestro软件分析呈蓝色，则小麦主效QTL簇C6A.2或TaGPC-A1基因的基因型为TT；若待测小麦DNA扩增产物的荧光信号数据经Bio-Rad CFX384TM Maestro软件分析呈桔黄色，则小麦主效QTL簇C6A.2或TaGPC-A1的基因型为CC；若待测小麦DNA扩增产物的荧光信号数据经Bio-Rad CFX384TMMaestro软件分析呈绿色，则小麦主效QTL簇C6A.2或TaGPC-A1的基因型为CT；
对于突变位点Y：
若待测小麦DNA扩增产物的荧光信号数据经Bio-Rad CFX384TM Maestro软件分析呈蓝色，则小麦TaGPC-A1的基因型为CC；若待测小麦DNA扩增产物的荧光信号数据经Bio-Rad CFX384TM Maestro软件分析呈桔黄色，则小麦TaGPC-A1的基因型为AA；若待测小麦DNA扩增产物的荧光信号数据经Bio-Rad CFX384TM Maestro软件分析呈绿色，则小麦TaGPC-A1的基因型为AC。
结果见表2和图2-3所示。
针对突变位点M：其中携带CC型(对应于中国春小麦参考基因组RefSeq v1.1版本参考序列6A染色体上第77098019bp处的GG型)和TT型的材料分别为93份(56.02％)和56份(33.73％)，并且携带CC基因型蛋白质含量显著(P<0.05)或极显著(P<0.01)高于TT基因型，统计分析(t-检验)结果表明KASP标记的效应在两个环境中均达到显著(P<0.05)或极显著(P<0.01)差异。
针对突变位点Y：其中携带AA型(对应于中国春小麦参考基因组RefSeq v1.1版本参考序列6A染色体上第77097875bp处TT基因型)和CC型的材料分别为58份(34.94％)和100份(60.24％)，并且携带CC基因型蛋白质含量显著(P<0.05)或极显著(P<0.01)高于AA基因型，统计分析(t-检验)结果表明KASP标记的效应在两个环境中均达到显著(P<0.05)或极显著(P<0.01)差异。
以上结果表明，本发明开发的两套KASP引物及其对应的SNP分子标记、小麦籽粒蛋白质含量相关主效QTL簇C6A.2可以作为检测和筛选小麦品种(系)籽粒蛋白质含量性状的特异性标记。
表2 166份小麦品种中的基因型检测和籽粒蛋白质含量结果
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/>
注：-为数据缺失，即存在一些杂合和缺失的情况，为了真实表现出结果，未进行修缮
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种与小麦籽粒蛋白质含量相关的SNP分子标记，其特征在于其SNP位点对应于中国春小麦参考基因组RefSeq v1.1版本参考序列6A染色体上第77098019bp处G>A突变或6A染色体上第77097875bp处T>G突变；该位点碱基的多态性影响小麦籽粒蛋白质含量。
2.一种用于鉴定权利要求1所述的SNP分子标记的KASP引物对，其特征在于包含引物对一和引物对二中的至少一种，其中，引物对一包含引物1、引物2和引物3，其核苷酸序列如下所示：
引物1：5’-GCATAAGGGCCACTCACATAAC-3’；
引物2：5’-GCATAAGGGCCACTCACATAAT-3’；
引物3：5’-GCATGGTAATTGCATACACGGG-3’；
引物对二包含引物4、引物5和引物6，其核苷酸序列如下所示：
引物4：5’-TAGGGAGGCGTCCGTGGAA-3’；
引物5：5’-TAGGGAGGCGTCCGTGGAC-3’；
引物6：5’-CCTTATGCGCCAATCTTTTATACA-3’。
3.根据权利要求2所述的KASP引物对，其特征在于：
所述的引物1和引物2、引物4和引物5的5’端分别添加荧光标签序列。
4.根据权利要求2或3所述的KASP引物对，其特征在于：
所述的引物1的核苷酸序列为：
5’-GAAGGTGACCAAGTTCATGCTGCATAAGGGCCACTCACATAAC-3’；其中，横线下划线部分为荧光标签序列FAM；
所述的引物2的核苷酸序列为：
5’-GAAGGTCGGAGTCAACGGATTGCATAAGGGCCACTCACATAAT-3’；其中，波浪下划线部分为荧光标签序列HEX；
所述的引物4的核苷酸序列为：
5’-GAAGGTGACCAAGTTCATGCTTAGGGAGGCGTCCGTGGAA-3’；其中，横线下划线部分为荧光标签序列FAM；
所述的引物5的核苷酸序列为：
5’-GAAGGTCGGAGTCAACGGATTTAGGGAGGCGTCCGTGGAC-3’；其中，波浪下划线部分为荧光标签序列HEX。
5.一种用于鉴定权利要求1所述的SNP分子标记的试剂盒，其特征在于包含权利要求4所述的KASP引物对。
6.一种检测或辅助检测小麦籽粒蛋白质含量相关的主效QTL簇C6A.2、TaGPC-A1基因或权利要求1所述的SNP分子标记的方法，其特征在于包含如下步骤：
(1)提取待测小麦样本基因组DNA；
(2)以小麦样本基因组DNA为模板，采用权利要求4所述的KASP引物对或权利要求5所述的试剂盒中的KASP引物对进行PCR扩增，获得扩增产物；
(3)将步骤(2)中获得的扩增产物进行荧光信号扫描、数据分析和基因分型。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：
步骤(2)中所述的扩增体系为：2μL小麦样本基因组DNA，2μL的2×KASP master Mix和0.045μL的KASP引物工作液。
8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：
所用的KASP引物工作液中引物1、引物2和引物3的浓度分别优选为12μM、12μM和30μM；所用的KASP引物工作液中引物4、引物5和引物6的浓度分别优选为12μM、12μM和30μM。
9.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：
步骤(3)中所述的基因分型的具体方法为：
将步骤(2)获得的扩增产物进行荧光信号扫描，然后采用Bio-Rad CFX384TM Maestro软件对扫描后的结果进行数据分析，根据分析的结果对不同小麦品种进行基因分型。
10.权利要求1所述的SNP分子标记、权利要求2-4任一项所述的KASP引物、权利要求5所述的试剂盒或权利要求6-9任一项所述的方法在以下(A)-(F)任意一种中的应用：
(A)用于检测小麦或小麦杂交后代的籽粒蛋白质含量相关的主效QTL簇C6A.2或TaGPC-A1基因的基因型；
(B)用于鉴定或辅助鉴定小麦籽粒蛋白质含量性状；
(C)用于培育、筛选或辅助筛选具有高或低的籽粒蛋白质含量性状的小麦单株、株系、品系或品种；
(D)制备用于检测小麦或小麦杂交后代的籽粒蛋白质含量的主效QTL簇C6A.2或TaGPC-A1基因的基因型的产品；
(E)制备用于鉴定或辅助鉴定小麦籽粒蛋白质含量性状的产品；
(F)制备用于培育、筛选或辅助筛选具有高或低的籽粒蛋白质含量性状的小麦单株、株系、品系或品种的产品。
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| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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