CN113475392B - 一种抗赤霉病多结实小穗数小麦的分子标记辅助选育方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了抗赤霉病多结实小穗数小麦的分子标记辅助选育方法，包括选择携带抗赤霉病基因Fhb1+位点QFhb‑2D和每穗结实小穗数增效位点QSN‑Y12的基因/位点互补的亲本，将选择出的亲本进行杂交配组。F₂世代主要采取赤霉病土表接种选择压筛选抗赤霉病单株；F₃世代利用分子标记辅助选择；F₄世代利用分子标记辅助选择，同时对综合农艺性状进行鉴定和选择；F₅及以后根据育种目标，全面考察品系的综合农艺性状和综合抗病性、抗倒性等，收获后进行产量和品质鉴定。利用本发明方法选育的抗赤霉病绿色多结实小穗数小麦品种(系)每穗结实小穗数多，综合抗病抗倒性好，绿色健康，可降低生产成本，减肥减药，有利于保护环境资源。

Description

一种抗赤霉病多结实小穗数小麦的分子标记辅助选育方法

技术领域

本发明属于小麦分子育种技术领域，涉及一种抗赤霉病多结实小穗数小麦的分子标记辅助选育方法。

背景技术

小麦是世界上最重要的粮食作物，其总面积、总产量及总贸易额均居粮食作物之首。增加单位面积产量是小麦育种的重要目标之一。小麦产量与穗部性状高度相关，穗部性状的选择是小麦产量育种的重要指标，小麦穗部性状主要有每穗结实小穗数、穗长和穗粒数等，大多是由主基因与微效多基因共同控制，各性状间关系错综复杂，其中每穗结实小穗数是穗部性状的基础，多花多结实小穗无疑是选育小麦品种的重要目标，也是小麦产量育种的重要选择指标。以往依赖于人工在田间待小麦灌浆后期至成熟时调查各小麦育种材料的每穗结实小穗数，方法是每株行或者株系随机调查10～20个单株，每个单株取主茎穗调查每穗结实小穗数，10～20个单株取平均值为此次重复的每穗结实小穗数，最终取2次及以上重复的平均值为该株行或者株系的每穗结实小穗数。因为每穗结实小穗数是一个典型的数量性状，环境等对其影响很大，所以人工调查表型的结果与田间种植方式、水肥管理水平和灌浆期温度湿度等相关性很大，往往造成多年或者多点数据结果不一致，给育种选择带来困境。因此加大对结实小穗数的遗传基础研究，挖掘与之相关的稳定主效的QTL位点，并且开发出紧密连锁的育种可用分子标记，更有助于在小麦产量育种中高效、准确地筛选此性状。

江苏省淮南麦区小麦生长期间雨水多，抗病育种始终是重要目标。小麦赤霉病是世界性病害，江苏年均小麦赤霉病发生约1800万亩，严重影响产量和品质，而且感病籽粒中的DON毒素威胁人畜健康和食品安全，2017年农业农村部在江苏扬州成立了小麦赤霉病综合防控协同创新联盟，旨在提高全国小麦的赤霉病协同防控能力。培育抗赤霉病小麦品种是解决小麦赤霉病危害最经济、安全和有效的途径。此外，原先生产中推广的优质弱筋小麦品种扬麦13和扬麦15均中感赤霉病和感黄花叶病，宁麦9号、宁麦13虽然中抗赤霉病和抗黄花叶病，但是高感白粉病和锈病，由于近年来粳稻面积增加导致小麦迟播面积相应增加，生育进程延迟，就会增加了小麦在扬花期遇到高温多湿的气候环境几率，加大赤霉病、白粉病、黄花叶病等发生的风险和危害程度，加上在小麦灌浆末期，该地区经常连续阴雨，伴随阵风或大风，可使小麦大面积发生倒伏，倒伏后的麦田容易白粉病、赤霉病等大流行，丰产性极差。依赖化学药剂的“一喷三防”生产措施，既增加投入，又污染环境，难以满足国家对农业生产“双减”的需求。因此在丰产的基础上，首先将赤霉病抗性等级提升至R级，兼抗白粉病和黄花叶病，培育绿色小麦新品种，对于实现小麦整个产业链条的绿色安全和可持续发展尤为重要，是小麦产业可持续发展的必然趋势。小麦的抗病抗逆和产量等重要性状多为复杂的数量性状，与环境存在互作，常规育种单纯依靠表型选择因受环境影响大、选择周期长、育种效率低。分子标记辅助选择(MAS)等技术日趋成熟，为聚合抗病抗逆和产量等性状提供了新的途径和方法。国内外进行抗赤霉病分子标记辅助育种应用普遍的是在苏麦3号和望水白中发掘的主效抗赤霉病基因，其中以Fhb1的应用最广泛。我国的周淼平等利用苏麦3号为抗源，以济麦22为受体，结合Fhb1连锁标记的分子辅助选择，创制出赤霉病达中感以上的材料18份，但是多数品系的株高较济麦22增加，说明通过杂交结合分子标记辅助选择等手段，对选育出适合黄该麦区的抗赤霉病品种有一定帮助，但是能否真正实现育成品种的抗性突破还未有实例。已有研究表明扬麦158等扬麦系列大所数品种不携有Fhb1，但是赤霉病抗性优异，经过遗传学研究证实其携有抗赤霉病位点QFhb-2D。

据统计，近五年来小麦品种近422余个通过国审，但是能真正达到公认高抗赤霉病的仅1个。胡文静等(参考文献：胡文静,张春梅,吴迪,等.长江中下游小麦抗赤霉病品种筛选与部分农艺性状分析[J].中国农业科学,2020,53(21):4313～4321)选取历年来我国长江中下游广泛种植的小麦改良品种和地方品种共93个进行赤霉病抗扩展鉴定，筛选出67个抗性达到中感及以上水平的品种，占供试品种的72.0％，发现除对照品种苏麦3号和望水白外，没有其他高抗赤霉病品种，赤霉病抗性与综合农艺性状结合较好的品种中也仅有扬辐麦4号携带Fhb1基因。以往有研究表明，小麦赤霉病的抗性水平与产量相关的农艺性状存在一定程度的负相关。例如赤霉病的严重度与每穗结实小穗数正相关，赤霉病抗性好的，每穗结实小穗数低，赤霉病抗性差的，每穗结实小穗数高(陈士强,张容,王建华,等.小麦赤霉病抗性与株高及穗部性状的相关性研究[J].江西农业学报,2020,32(6):23～29；Yi X,ChengJ Y,Jiang Z N,et al.Genetic Analysis of Fusarium Head Blight Resistance inCIMMYT Bread Wheat Line C615 Using Traditional and Conditional QTL Mapping[J].Frontiers in plant science,2019,9:573)。这也就加大了在小麦育种中将抗赤霉病水平与产量同时提高的难度。

因此，小麦育种中急需一种能够同时取得抗性和产量突破的品种选育方法。

发明内容

为了克服上述技术问题，本发明提供了一种抗赤霉病多结实小穗数小麦的分子标记辅助选育方法，采用分别含有抗赤霉病基因Fhb1、抗赤霉病位点QFhb-2D和每穗结实小穗数增效位点QSN-Y12的亲本进行杂交选育，并结合抗病性的鉴定，可以有效获得抗性和产量具有明显突破的小麦品种。

本发明提供了一种抗赤霉病多结实小穗数小麦的分子标记辅助选育方法，所述方法包括以下步骤：

步骤S1，选择携带抗赤霉病基因Fhb1、抗赤霉病位点QFhb-2D和每穗结实小穗数增效位点QSN-Y12的基因/位点互补的亲本；

步骤S2，将选择出的亲本进行杂交配组，收获F₁代杂交种；

步骤S3，种植F₁代杂交种，收获自交种F₂；

步骤S4，种植F₂代，采取赤霉病土表接种选择压筛选抗赤霉病单株，同时考察单株的株高、有效分蘖和每穗结实小穗数，筛选符合选择指标的单株收获种子得到F₃；

步骤S5，种植中选F₃，利用分子标记检测苗期单株叶片的抗赤霉病基因Fhb1、抗赤霉病位点QFhb-2D和每穗结实小穗数增效位点QSN-Y12，选择检测均呈阳性(包含杂合)的按照单株收获，考察单株的株高、有效分蘖和每穗结实小穗数，筛选符合选择指标的单株收获种子得到F₄；

步骤S6，种植中选F₄，利用分子标记检测抗赤霉病基因Fhb1、抗赤霉病位点QFhb-2D和每穗结实小穗数增效位点QSN-Y12，选择均呈阳性(纯合)的株行标记，同时进行大田赤霉病、黄花叶病的鉴定，按中选株行混合收获脱粒，进行产量鉴定，亩产量比对照高6％以上的为中选F₅。

步骤S7，将中选F₅种植成鉴定圃，以扬麦20为农艺性状参照，全面考察品系的综合农艺性状和综合抗病性、抗倒性等。收获后分别利用硬度仪和近红外仪测定硬度和蛋白质筛选籽粒优质弱筋和利用吹泡仪筛选面粉吸水率、韧性、延展性和烘焙力等饼干品质优异的品系，产量鉴定后选择亩产量比对照扬麦20高6％以上的进入下一级多点产量鉴定试验。

在某些实施例中，所述每穗结实小穗数增效位点QSN-Y12的特异性检测引物序列为SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示。

在某些实施例中，所述抗赤霉病基因Fhb1的特异性检测引物序列为SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示。

在某些实施例中，所述抗赤霉病位点QFhb-2D的特异性检测引物序列为SEQ IDNO.7、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10所示。

在某些实施例中，所述步骤S4中采取赤霉病土表接种选择压筛选抗赤霉病单株具体为：在小麦孕穗期撒施病麦粒，5.5斤/亩，并每天每隔半小时自动喷一次水，均匀喷到小麦穗部，每次喷10分钟，小麦开花20天后立即停止喷水。

在某些实施例中，所述步骤S4中采取赤霉病土表接种选择压筛选抗赤霉病单株时，设安农8455为感病对照，苏麦3号为抗赤霉病对照，病穗率＝每单株的发病穗数/总穗数，病小穗率＝每穗发病小穗数/每穗总小穗数，当调查的感病对照安农8455病穗率和病小穗率有1项或者2项均未达到75％的时候继续喷水，直到二者均达到75％及以上的时候，确定为此次试验的赤霉病充分发病时间，开始调查F₂世代及抗病对照的单株的病穗率和平均病小穗率，均小于或者等于抗赤霉病对照苏麦3号病穗率和平均病小穗率的挂牌按照单株收获。

在某些实施例中，所述步骤S4、S5中筛选符合选择指标具体为：选择株高小于90cm、单株分蘖大于或者等于5个、每穗结实小穗数大于22的单株收获种子。

在某些实施例中，所述步骤S6中大田赤霉病、黄花叶病的鉴定具体为：赤霉病鉴定采用抗扩展鉴定，制备赤霉菌孢子悬浮液4×10⁵～5×10⁵孢子/mL，采用单花滴注法接种；黄花叶病的鉴定采用自然发病鉴定；选择赤霉病和黄花叶病的抗病鉴定结果均呈R级的株行挂牌标记。

在某些实施例中，单花接种具体为于小麦开花初期，用注射器吸取10μL孢子液注入麦穗自顶部小穗开始自上而下第6个小穗的任意一个小花中，每标记株行接种30个穗子。接种后采用人工弥雾保湿(每半小时喷弥雾5min)。接种28～30天后调查接种穗的病小穗数，计算病小穗率。病小穗率＝发病小穗数/总小穗数×100％，根据发病平均情况转化成平均严重度。

在某些实施例中，抗病调查和鉴定标准按照《中华人民共和国农业行业标准NY/T2954-2016：小麦区域试验品种抗赤霉病鉴定技术规程》，病小穗率小于25％的即严重度小于2级的视为R级。

在某些实施例中，所述步骤S6中大田赤霉病、黄花叶病的鉴定中还包括种植苏麦3号和安农8455各5行为赤霉病抗(R)和感(S)对照；镇麦9号和苏麦3号为白粉病抗(R)和感(S)的对照；宁麦13和扬麦158为黄花叶病抗(R)和感(S)的对照。

在某些实施例中，所述步骤S6中对照为扬麦20。

在某些实施例中，所述方法还包括将F₅种植成鉴定圃，以扬麦20为农艺性状参照，全面考察品系的综合农艺性状和综合抗病性、抗倒性，产量鉴定后选择亩产量比对照扬麦20高6％以上的进入下一级多点产量鉴定试验，确定最终选育品种。

本发明相对于现有技术，具有以下技术效果：

1)本发明首次提出在亲本选择中利用抗赤霉病基因Fhb1+抗赤霉病位点QFhb-2D的连锁标记作为筛选赤霉病兼抗侵染和抗扩展小麦材料的分子手段，经过分子标记鉴定和抗赤霉病表型鉴定，在同时携带这两个基因/位点的后代品系中，其接种鉴定赤霉病严重度和自然发病病穗率均与对照品种扬麦20相比降低，达到R级，接近苏麦3号水平；在不携带这两个基因/位点的后代品系或者仅携带1个基因/位点的后代品系中，其接种鉴定赤霉病严重度和自然发病病穗率的综合结果均与同时聚合两个抗赤霉病基因/位点的后代品系相比显著增加，抗性等级降低至MR和MS，达不到推荐审定抗赤霉病小麦品种的要求，可见在选育高产小麦品种中同时利用抗赤霉病基因Fhb1+抗赤霉病位点QFhb-2D进行筛选可以明显提高小麦品种赤霉病抗性选择的效率。

2)本发明首次提出在亲本选择中以每穗结实小穗数增效位点QSN-Y12作为筛选每穗结实小穗数的分子标记，经过分子标记鉴定和每穗结实小穗数的表型鉴定，在携带该位点的后代品系中，其产量与对照品种相比显著增产，达到510.4Kg～544.1Kg，在不携带该位点的后代品系中，其产量与对照品种相比减产或者增产不显著，产量值范围是442.8Kg～497.7Kg，且达不到推荐审定抗赤霉病小麦品种的要求，可见在选育高产小麦品种中利用每穗结实小穗数增效位点QSN-Y12进行筛选可以明显提高小麦品种产量选择的效率。

3)本发明在小麦品种选育中以特定的基因/位点组合品种分别作为亲本杂交，即选择携带抗赤霉病基因Fhb1、抗赤霉病位点QFhb-2D和每穗结实小穗数增效位点QSN-Y12的基因/位点互补的亲本，并在高世代中结合田间赤霉病抗侵染及抗扩展的抗病性鉴定，能够快速及有效的选育出既抗赤霉病又高产的小麦品种，利用本发明方法选育的抗赤霉病多结实小穗数小麦品种(系)每穗结实小穗数多，综合抗病抗倒性好，绿色健康，可降低生产成本，减肥减药，有利于保护环境资源。

附图说明

为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式描述中所需要使用的附图作简单地介绍。

图1为本发明选育方法的流程图。

图2为实施例2中每穗结实小穗数增效位点QSN-Y12在RIL群体中扩增检测结果示意图。

图3为实施例3中每穗结实小穗数增效位点QSN-Y12在部分验证群体中扩增检测结果示意图。

图4为实施例4中每穗结实小穗数增效位点QSN-Y12在F₃和F₄世代中分子标记辅助选择的扩增检测结果示意图。

图5为实施例1中步骤7的中选后代品系(左)和感病品种(右)的对比。

具体实施方式

下面将结合附图对本发明技术方案的实施例进行详细的描述。以下实施例仅用于更加清楚地说明本发明的技术方案，因此只是作为示例，而不能以此来限制本发明的保护范围。需要注意的是，除非另有说明，本申请使用的技术术语或者科学术语应当为本发明所属领域技术人员所理解的通常意义。

实施例1一种抗赤霉病多结实小穗数小麦的分子标记辅助选育方法按照图1所示流程，包括以下步骤，

1)步骤S1，亲本选择：用CTAB法提取综合抗病性和综合农艺性状好、产量高的长江中下游主推品种或者其衍生品种(系)136个苗期的混合叶片DNA，结合多年对赤霉病、黄花叶病的表型鉴定和抗赤霉病主效基因Fhb1、抗赤霉病位点QFhb-2D和每穗结实小穗数增效位点QSN-Y12的分子标记检测筛选出亲本目标品种为宁麦9号衍生品种扬辐麦4号和扬97G59。扬辐麦4号系宁麦9号和宁麦8号杂交选育的品种，携带抗赤霉病主效基因Fhb1，每穗结实小穗数是18.93。扬97G59是累计种植面积达到5922.48万亩的小麦品种扬麦158与抗白粉病材中间料回交后的高代品系，扬97G59全生育期200～201天，株高81～83厘米，每亩有效穗30～31万穗，每穗结实小穗数是20.64，携带抗赤霉病位点QFhb-2D和每穗结实小穗数增效位点QSN-Y12，千粒重44～46克，赤霉病、白粉病、锈病等综合抗病性好；

2)步骤S2，2016年8月在温室种植扬97G59和扬辐麦4号，10月以二者为父母本配组杂交，第一年12月收获F₁杂交种。

3)步骤S3，2017年1月，温室种植F₁，自交，6月收获自交种F₂；

4)步骤S4，2017年8月，温室种植F₂，在小麦孕穗期撒施病麦粒，5.5斤/亩，并每天每隔半小时自动喷一次水，均匀喷到小麦穗部，每次喷10分钟，小麦开花20天后立即停止喷水，设安农8455为感病对照，苏麦3号为抗赤霉病对照，病穗率＝每单株的发病穗数/总穗数，病小穗率＝每穗发病小穗数/每穗总小穗数，当调查的感病对照安农8455病穗率和病小穗率有1项或者2项均未达到75％的时候继续喷水，直到二者均达到75％及以上的时候，确定为此次试验的赤霉病充分发病时间，开始调查F₂世代及抗病对照的单株的病穗率和平均病小穗率，均小于或者等于抗赤霉病对照苏麦3号病穗率和平均病小穗率的挂牌按照单株收获。，考察单株的株高、有效分蘖和每穗结实小穗数，选择株高小于90cm、单株分蘖大于或者等于5个、每穗结实小穗数大于22的单株收获种子得到F₃。

5)步骤S5，2018年1月，大棚种植中选F₃，每个单株的种子种成3行，行长2m，行距20cm，株距4.2cm，对每株行随机混合10个单株的苗期叶片，提取DNA，利用分子标记检测苗期单株叶片的抗赤霉病基因Fhb1、抗赤霉病位点QFhb-2D和每穗结实小穗数增效位点QSN-Y12，选择检测均呈阳性(包含杂合)的按照单株收获，考察单株的株高、有效分蘖和每穗结实小穗数，选择株高小于90cm、单株分蘖大于或者等于5个、每穗结实小穗数大于22的单株收获种子得到F₄；

6)步骤S6，2018年10月，在大田将中选F₄种植成株行，3行区，行长2m，行距20cm，株距4.2cm，每株行随机混合10个单株的苗期叶片，提取DNA，用分子标记检测抗赤霉病基因Fhb1、抗赤霉病位点QFhb-2D和每穗结实小穗数增效位点QSN-Y12，选择均呈阳性(纯合)的株行标记。种植苏麦3号和安农8455各5行为赤霉病抗(R)和感(S)对照；宁麦13和扬麦158为黄花叶病抗(R)和感(S)的对照。

其中赤霉病鉴定采用抗扩展鉴定，制备赤霉菌孢子悬浮液(4×10⁵--5×10⁵孢子/mL)，采用单花滴注法接种，于小麦开花初期，用注射器吸取10μL孢子液注入麦穗自顶部小穗开始自上而下第6个小穗的任意一个小花中，每标记株行接种30个穗子。接种后采用人工弥雾保湿(每半小时喷弥雾5min)。接种28～30天后调查接种穗的病小穗数，计算病小穗率。病小穗率＝发病小穗数/总小穗数×100％，根据发病平均情况转化成平均严重度。抗病调查和鉴定标准按照《中华人民共和国农业行业标准NY/T 2954-2016：小麦区域试验品种抗赤霉病鉴定技术规程》，病小穗率小于25％的即严重度小于2级的视为R级。黄花叶病的鉴定采用自然发病鉴定，抗性水平接近抗病对照的视为R级。选择赤霉病和黄花叶病的抗病鉴定结果均呈R级的株行挂牌标记。根据育种目标，以扬麦20为农艺性状和抗倒对照，对符合选择指标的株行进行鉴定、筛选，按中选株行混合收获脱粒，进行产量鉴定，亩产量比对照扬麦20高6％以上的为中选F₅；

7)步骤S7，2019年10月将F₅种植成鉴定圃，以扬麦20为农艺性状参照，全面考察品系的综合农艺性状和综合抗病性、抗倒性等。收获后分别利用硬度仪和近红外仪测定硬度和蛋白质筛选籽粒优质弱筋和利用吹泡仪筛选面粉吸水率、韧性、延展性和烘焙力等饼干品质优异的品系，产量鉴定后选择亩产量比对照扬麦20高6％以上的进入下一级多点产量鉴定试验。最终，筛选出抗赤霉病绿色多结实小穗数的品系扬GL16，抗赤霉病、白粉病和黄花叶病，平均亩穗数31.9万，穗粒数40.4粒，千粒重45.3克，每穗结实小穗数排数达到23.5，亩产量达到544.5Kg，此年此点扬麦20的平均亩产量是480.0Kg，因此扬GL16比对照扬麦20增产13.35％；全生育期200.3天，比对照扬麦20早2.3天；平均株高86.3厘米，株型紧凑，抗倒性强，整齐度好，穗层整齐，熟相好。

2020年推荐该品系参加多点产量试验，表现如表1，扬GL16的8点平均亩产量534.1Kg，比对照品种扬麦20平均亩产量487.5Kg增幅9.6％，增产点率100％。

表1 2020—2021年长江中下游组部分试验点扬GL16产量表现

扬GL16两年品质检测结果：蛋白质含量11.1％、11.3％，湿面筋含量22.6％、19.8％，稳定时间2.5分钟、4.2分钟，吸水率42.1％、41.4％，最大拉伸阻力448.5Rm.E.U.、515Rm.E.U.，拉伸面积53.5平方厘米、65.5平方厘米，符合国家优质弱筋小麦品种指标。

可见，通过本发明的方法能够通过抗病、产量相关性状等表型选择+分子标记辅助和品质相关指标测试，大幅度提高育种效率和性状改良精准性。

实施例2挖掘和筛选稳定的显著与小麦每穗结实小穗数相关的SNP位点QSN-Y12并且验证

以205份来源于“扬麦12号×偃展1号”的重组自交系(F₁₂)为材料，2013年和2014年连续2个生长季将该重组自交系及其亲本种植于江苏里下河地区农业科学研究所万福试验基地产量鉴定圃(江苏扬州)和泗洪试验基地，试验当年扬州的小麦播期设为10月20日，试验采用随机区组设计，2行区，2次重复，每行30粒，行长1.33m，行距0.23m。田间施肥及管理参照当地大田栽培生产，及时防治病虫草害，2014年和2015年的5月—6月待小麦灌浆后期至成熟时调查各家系每穗小穗数，每家系随机调查10个单株，每个单株取主茎穗调查每穗结实小穗数，10个单株取平均值为此次重复的每穗结实小穗数，最终取2次重复的平均值为该家系每穗结实小穗数。

采用CTAB法提取基因组DNA，利用Wheat55K芯片获取基因型，并构建遗传图谱。利用IciMapping v4.1软件(http://www.isbreeding.net)过滤和去冗余基因型数据。利用JoinMap v4.0构建和校正遗传图谱，利用Map Chart2.3(https://www.wur.nl/en/show/Mapchart.htm)绘制遗传图谱。利用完备区间作图法(Inclusive composite intervalmapping，ICIM)应用IciMapping v4.1软件检测与每穗结实小穗数显著相关的QTL，LOD阈值设为3.5。为了与前人结果比较，将连锁标记或者基因序列与中国春参考基因组序列的EnsemblPlants数据库(http://plants.ensembl.org/)进行比对。

实验获得1个在两年两个环境下均与每穗结实小穗数相关的位点QSN-Y12，增效基因来源于扬麦12号，即增加每穗结实小穗数的基因来源于扬麦12号，QTL峰值位置在3D染色体上57.00cM～60.70cM，对应标记区间为AX108746383—AX111126228，表型贡献率达到12.34％～16.38％(表2)，属于主效的QTL。

表2QSN-Y12对每穗结实小穗数的遗传效应及其侧翼标记

经过查阅文献和与小麦参考基因组比对发现该位置位于3D染色体长臂583.23Mb～586.63Mb，经过与以往研究比对，未见相同或者相近QTL/基因的相关报道，申请人进一步从QTL区间中依据标记同源性初步筛选SNP标记，选择区间中特异性高、与每穗结实小穗数相关性最高的SNP标记进行KASP标记转化，确定AX108746383标记在基因组特异性最好、与每穗结实小穗数相关性最显著，其侧翼序列是5’-GTGGC AAACT CATCT GCACG AGGGT GTCTTGGTTG[G/T]TGTTT GCTGG TCATT CACTT CATCG CATGT TCCAG-3’(SEQ ID NO.1)，其中突变位点R为[G/T]，利用Polymarker(http://polymarker.tgac.ac.uk/)进行KASP引物设计，引物由北京嘉程生物科技有限公司合成。最终成功将AX108746383标记转化为KASP标记QSN-Y12，其对应的变异位点是G/T，即核苷酸序列SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4，小麦育种来说，每穗结实小穗数高是优势等位变异，扬麦12号携有优势等位变异T(互补碱基是A)，携有等位基因A的小麦材料每穗结实小穗数高于含有等位基因G(互补碱基是C)的小麦材料。

本实施例针对该SNP位点设计QSN-Y12引物组，因为根据原始侧翼序列设计引物发现用互补链设计引物更不易导致错配或者形成二聚体、发卡结构等，因此设计的特异引物位于互补链上，引物2和引物3的3’末端为原始标记的等位变异碱基的互补碱基。如表3所示，上游引物(引物1)保证了PCR扩增的3D染色体特异性，下游引物(引物2和引物3)的3’末端为标记AX108746383的等位变异碱基G/T的互补碱基C/A。

表3QSN-Y12连锁标记引物序列信息

KASP标记引物工作液的制备：分别取上游引物(核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示)30μL(100μM)，取下游引物(核苷酸序列如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示)各12μL(100μM)，用无菌超纯水补充至100μL，充分混匀，作为KASP标记的引物工作液，备用。

PCR扩增反应体系：待测小麦DNA模板2.2μL(约30ng/μL)、引物工作液0.06μL、KASPMaster Mix 2.5μL(LGC公司，KBS-1016-002)，用无菌超纯水补充至5μL；

PCR反应程序：(1)95℃预变性10min；(2)95℃变性20s、61–55℃(每个循环下降0.6℃)45s，共10个循环；(3)95℃变性20s、55℃复性45s，34个循环；20℃保存。实验同时设置反应体系中不添加模板DNA的空白对照(NTC)，每个板设置1个或多个空白对照。

取小麦幼苗，采用CTAB法提取待测小麦基因组DNA。

以待测小麦基因组DNA为模板，采用如上KASP引物组、PCR试剂进行PCR扩增，获得PCR扩增产物。PCR反应在ABI Veriti 384PCR仪(Thermo Fisher)上进行，用Omega F SNP分型检测仪(LGC Genomics Ltd，KBS-0024-002)对PCR扩增产物进行扫描读取荧光值。FAM激发波长为485nm，发射波长为520nm；VIC激发波长为535nm，发射波长为556nm，系统参比荧光ROX激发波长为575nm，发射波长为610nm。采用Kluster CallerTM(KBioscience)进行基因分型，根据分析结果确定QSN-Y12位点的基因型。

将部分“扬麦12号×偃展1号的重组自交系”连同两个亲本按照如上方法进行扩增，检测结果如附图2所示。扩增产物的荧光信号数据经Kluster Caller软件分析聚集在分型结果荧光信号坐标系中靠近X轴的位置(蓝色)，与扬麦12号相同，即证明这些小麦在分子标记AX108746383侧翼核苷酸序列(如SEQ ID NO.1)的第36位碱基(SNP位点)的基因型为T；而扩增产物的荧光信号数据经Kluster Caller软件分析聚集在坐标系中靠近Y轴的位置(红色)，与扬麦12号分型不同，则证明这些小麦在该SNP位点的基因型为G。205个家系连同两个亲本的KASP检测结果、2014年和2015年大田试验中测定的每穗结实小穗数两年的平均结果如表4所示。

表4携带AX108746383不同基因型的RIL家系的两年每穗结实小穗数平均值T测验结果

由表4可见，含有等位基因T的小麦每穗结实小穗数平均值显著高于含有等位基因G的小麦。表4所示利用Excel 2019的双样本T测验205个RIL家系的基因型和表型，结果表明：101个家系与扬麦12号基因型相同为T，104个家系与偃展1号基因型相同为G，205个家系中基因型为T的家系比基因型为G的家系2015年和2016年两年每穗结实小穗数平均值分别高5.36％和4.82％，在p<0.01水平上有显著差异，说明上述KASP标记QSN-Y12的引物组及基因型检测体系可以应用于小麦每穗结实小穗数分子标记辅助育种中。附图2显示材料分型结果良好，说明KASP标记开发成功，可进一步用于育种材料检测和筛选。

实施例3QSN-Y12的KASP引物组育种应用

田间试验：本实施例以于2014年种植于湾头实验基地的小麦品种(系)共118份为材料，试验当年扬州的小麦播期设为10月20日，试验采用随机区组设计，3行区，2次重复，每行30粒，行长1.33m，行距0.23m。田间施肥及管理参照当地大田栽培生产，及时防治病虫草害，2015年的5月～6月待小麦灌浆后期至成熟时调查各品种(系)每穗小穗数，各品种(系)随机调查10个单株，每个单株取主茎穗调查每穗结实小穗数，10个单株取平均值为此次重复的每穗结实小穗数，最终取2次重复的平均值为各品种(系)每穗结实小穗数。

利用实施例2获得的KASP引物组对上述118份材料进行基因分型，2015年大田试验中测定的每穗结实小穗数平均值以及KASP检测结果如表5和附图3所示。扩增产物的荧光信号数据经Kluster Caller软件分析聚集在分型结果荧光信号数据经Kluster Caller软件分析聚集与扬麦12号相同，即证明这些小麦品系在分子标记AX108746383的基因型为T；若小麦品系的扩增产物的荧光信号数据经Kluster Caller软件分析聚集与扬麦12号分型不同，则证明这些小麦品系在该SNP位点的基因型为G(表5)。

表5 118份品种(系)的每穗结实小穗数平均值和基因型检测结果

表6携带不同基因型的供试品种(系)的每穗结实小穗数平均值T测验结果

双样本T测验结果表明：基因型为T的品种比基因型为G的品种粒重平均值高4.02％，T测验结果t＝4.18，在p<0.01水平上有极显著差异，表明含有等位基因T的小麦材料每穗结实小穗数平均值高于含有等位基因G的小麦材料。同时说明上述KASP标记引物组及基因型检测体系可以应用于小麦每穗结实小穗数品种(系)的分子标记辅助选择育种中。

实施例4分子标记辅助选择每穗结实小穗数增效位点QSN-Y12方法的建立

用分子标记QSN-Y12的引物组检测实施例1中亲本、F₃株行混合叶片和F₄株行混合叶片材料是否携带每穗结实小穗数增效位点QSN-Y12。

1、以提取的亲本基因组DNA为模板，采用实施例1所述用于检测小麦的每穗结实小穗数增效位点的连锁KASP标记QSN-Y12进行PCR扩增，得到扩增产物，确定QSN-Y12位点与扬麦12号基因型相同的目标材料有扬辐麦4号。

2、采用CTAB法提取扬麦12号、扬97G59、F₃单株、F₄株行混合叶片的基因组DNA，经稀释得到DNA浓度为约30ng/μL的模板溶液。

将实施例1中步骤5)和6)中的材料连同两个亲本按照如上方法进行扩增，检测结果如附图4所示。扩增产物的荧光信号数据经Kluster Caller软件分析聚集在分型结果荧光信号坐标系中靠近X轴的位置(蓝色)，与扬麦12号相同，即证明这些小麦在分子标记QSN-Y12侧翼核苷酸序列(如SEQ ID NO.1)的第36位碱基(SNP位点)的基因型为T，是中选材料；而扩增产物的荧光信号数据经Kluster Caller软件分析聚集在坐标系中靠近Y轴的位置(红色)，与扬麦12号分型不同，则证明这些小麦在该SNP位点的基因型为G；若扩增产物的荧光信号数据经Kluster Caller软件分析聚集在坐标系中部(绿色)，附图4中左下角显示为黑色的样本为空白对照。

实施例5分子标记辅助选择抗赤霉病基因Fhb1方法的建立

采用CTAB法提取实施例1涉及的候选亲本材料、F₃株行混合叶片、F₄株行混合叶片的基因组DNA，经稀释得到DNA浓度为约30ng/μL的模板溶液，检测小麦的抗赤霉病基因Fhb1的连锁GSM标记。

分子标记检测抗赤霉病基因Fhb1的连锁GSM标记的特异性引物组的序列见表7：

表7抗赤霉病基因Fhb1连锁标记引物序列信息

采用PCR扩增的方法检测抗赤霉病主效基因Fhb1的对应连锁标记TaHRC-GSM，所述PCR扩增的方法为：所述PCR扩增的体系为10μL，包含30ng/μL小麦基因组DNA 1.0μL、10×PCR buffer 1.0μL、10Mm dNTP 0.2μL、10Mm MgCl₂ 1.0μL、5U Taq聚合酶0.2μL、5μM的上游引物0.4μL、5μM的下游引物0.4μL和无菌去离子水5.8μL；所述PCR扩增程序为：(1)94℃预变性5min；94℃变性30s，62℃退火20s，68℃延伸2～3.5min；(2)94℃变性20s，57℃退火20s，72℃延伸1min，32个循环；(3)72℃延伸5分钟；4℃保存。

采用TaHRC-GSM引物在1％琼脂糖电泳液中检测实施例1涉及小麦材料，目标基因型与扬麦18相同，为中选材料。

实施例6分子标记检测抗赤霉病位点QFhb-2D方法的建立

采用CTAB法提取实施例1涉及的候选亲本材料、F₃单株叶片、F₄株行混合叶片的基因组DNA，经稀释得到DNA浓度为约30ng/μL的模板溶液，检测小麦的抗赤霉病SSR标记Xgwm539和Wmc41进行PCR扩增，得到扩增产物。

分子标记检测抗赤霉病位点QFhb-2D的连锁SSR标记Xgwm539和Wmc41的特异性引物组的序列见表8：

表8抗赤霉病位点QFhb-2D连锁标记引物序列信息

采用PCR扩增的方法检测抗赤霉病位点QFhb-2D的对应连锁标记Xgwm539和Wmc41，所述PCR扩增的方法为：所述PCR扩增的体系为10μL，包含30ng/μL小麦基因组DNA 1.0μL、10×PCR buffer 1.0μL、10Mm dNTP 0.2μL、10Mm MgCl₂ 1.0μL、5U Taq聚合酶0.2μL、5μM的上游引物0.4μL、5μM的下游引物0.4μL和无菌去离子水5.8μL；所述PCR扩增程序为：94℃预变性8min；94℃变性30s，55℃退火40s，延伸30s，36个循环；72℃延伸10分钟；4℃保存。

采用上述引物在8％非变性聚丙乙烯酰胺凝胶电泳液中检测实施例1所涉及小麦材料，分型结果显示目标基因型与扬麦158相同即为携带抗赤霉病位点QFhb-2D。

实施例7亲本选择的有效性验证

国家抗赤霉病小麦品种审定的标准是接种鉴定和自然鉴定(土表撒病麦粒)抗性均到达R级，产量比对照减产小于5％。表9所示，在2020～2021年的终极鉴定圃所有的19个即将升入产量比较试验的品系的赤霉病和产量情况。

表9 19个的终极鉴定圃供试品种(系)的赤霉病和产量情况一览表

表9中所示，赤霉病抗性达到R级的是7个，赤霉病严重度范围是1.54～1.99，自然发病病穗率范围是2.82～10.01，均携有抗赤霉病基因Fhb1和抗赤霉病位点QFhb-2D，其中产量与对照品种扬麦20相比增产的有5个，分别是扬GL16、扬21-44、扬21-21、扬21品33和扬21-47的产量水平与对照扬麦20相比高出7.48％～13.35％，均携有每穗结实小穗数增效位点QSN-Y12。扬GL16的产量达到所有品系中最高值544.1Kg，达到推荐审定抗赤霉病小麦品种的标准(《江苏省农作物品种审定标准》中抗赤霉病小麦品种审定标准：淮南麦区抗性达到抗、淮北麦区抗性达到中抗及以上的品种。淮南麦区春性品种接种鉴定和自然鉴定抗性均达到抗，产量比对照减产≤5.0％，可以被推荐进入下一轮抗赤霉病鉴定和多点产量试验。其他有2个不携有每穗结实小穗数增效位点QSN-Y12的品系，分别是扬20-56、扬20-43，产量水平范围442.8Kg-508.6Kg，与对照扬麦20相比减产6.06％～6.42％，达不到推荐审定抗赤霉病小麦品种的要求。剩下12个品系产量水平442.8Kg～521.3Kg，其中扬19-59和扬19-13仅携有抗赤霉病基因Fhb1，扬21-28和扬21-67仅携有抗赤霉病位点QFhb-2D，赤霉病抗性未达到R级，赤霉病严重度2.09～3.15，自然发病病穗率达到11.35～20.03％，比聚合两个抗赤霉病基因/位点的后代品系显著高很多，抗性等级MR和MS，均不属于抗赤霉病小麦审定的范畴。可见，利用本申请的抗赤霉病基因Fhb1+抗赤霉病位点QFhb-2D和每穗结实小穗数增效位点QSN-Y12筛选出来的后代品系无论是在产量上还是赤霉病抗性上都具有明显的优势。图5为实施例1中步骤7的中选后代品系(左)和感病品种(右)的对比。

除非另外具体说明，否则在这些实施例中阐述的数值并不限制本发明的范围。在这里示出和描述的所有示例中，除非另有规定，任何具体值应被解释为仅仅是示例性的，而不是作为限制，因此，示例性实施例的其他示例可以具有不同的值。

SEQUENCE LISTING

<110> 江苏里下河地区农业科学研究所

<120> 一种抗赤霉病多结实小穗数小麦的分子标记辅助选育方法

<130> 2021

<160> 10

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 71

<212> DNA

<213> Triticum aestivum

<220>

<221> misc_feature

<222> (36)..(36)

<223> r 为 G或T

<400> 1

gtggcaaact catctgcacg agggtgtctt ggttgrtgtt tgctggtcat tcacttcatc 60

gcatgttcca g 71

<210> 2

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列（artificial sequence）

<400> 2

cagccgtgtc ttagttgtta gtgg 24

<210> 3

<211> 46

<212> DNA

<213> 人工序列（artificial sequence）

<400> 3

gaaggtgacc aagttcatgc tgatgaagtg aatgaccagc aaacaa 46

<210> 4

<211> 46

<212> DNA

<213> 人工序列（artificial sequence）

<400> 4

gaaggtcgga gtcaacggat tgatgaagtg aatgaccagc aaacac 46

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列（artificial sequence）

<400> 5

attcctacta gccgcctggt 20

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列（artificial sequence）

<400> 6

actggggcaa gcaaacattg 20

<210> 7

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列（artificial sequence）

<400> 7

ctgctctaag attcatgcaa cc 22

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列（artificial sequence）

<400> 8

gaggcttgtg ccctctgtag 20

<210> 9

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列（artificial sequence）

<400> 9

tccctcttcc aagcgcggat ag 22

<210> 10

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列（artificial sequence）

<400> 10

ggaggaagat ctcccggagc ag 22

Claims (7)

1.一种抗赤霉病多结实小穗数小麦的分子标记辅助选育方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

步骤S1，选择携带抗赤霉病基因Fhb1、抗赤霉病位点QFhb-2D和每穗结实小穗数增效位点QSN-Y12的基因/位点互补的亲本；

步骤S2，将选择出的亲本进行杂交配组，收获F₁代杂交种；

步骤S3，种植F₁代杂交种，收获自交种F₂；

步骤S4，种植F₂代，采取赤霉病土表接种选择压筛选抗赤霉病单株，同时考察单株的株高、有效分蘖和每穗结实小穗数，筛选符合选择指标的单株收获种子得到F₃；

步骤S5，种植中选F₃，利用分子标记检测苗期单株叶片的抗赤霉病基因Fhb1、抗赤霉病位点QFhb-2D和每穗结实小穗数增效位点QSN-Y12，选择检测包含杂合的均呈阳性的按照单株收获，考察单株的株高、有效分蘖和每穗结实小穗数，筛选符合选择指标的单株收获种子得到F₄；

步骤S6，种植中选F₄，利用分子标记检测抗赤霉病基因Fhb1、抗赤霉病位点QFhb-2D和每穗结实小穗数增效位点QSN-Y12，选择纯合的均呈阳性的株行标记，同时进行大田赤霉病、黄花叶病的鉴定，按中选株行混合收获脱粒，进行产量鉴定，亩产量比对照高6%以上的为中选F₅；

步骤S7，将中选F₅种植成鉴定圃，以扬麦20为农艺性状参照，全面考察品系的综合农艺性状和综合抗病性、抗倒性，收获后分别利用硬度仪和近红外测定硬度和蛋白质筛选优质弱筋和利用吹泡仪筛选面粉吸水率、韧性、延展性和烘焙力等饼干品质优异的品系，产量鉴定后选择亩产量比对照扬麦20高6%以上的进入下一级多点产量鉴定试验；

所述每穗结实小穗数增效位点QSN-Y12的特异性检测引物序列如SEQ ID NO.2、SEQ IDNO.3和SEQ ID NO.4所示，所述抗赤霉病基因Fhb1的特异性检测引物序列如SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示，所述抗赤霉病位点QFhb-2D的特异性检测引物序列如SEQ ID NO.7、SEQID NO.8、SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10所示。

2.根据权利要求1所述的一种抗赤霉病多结实小穗数小麦的分子标记辅助选育方法，其特征在于，所述步骤S4中采取赤霉病土表接种选择压筛选抗赤霉病单株具体为：在小麦孕穗期撒施病麦粒，5.5斤/亩，并每天每隔半小时自动喷一次水，均匀喷到小麦穗部，每次喷10分钟，小麦开花20天后立即停止喷水。

3.根据权利要求1所述的一种抗赤霉病多结实小穗数小麦的分子标记辅助选育方法，其特征在于，所述步骤S4、S5中筛选符合选择指标具体为：选择株高小于90cm、单株分蘖大于或者等于5个、每穗结实小穗数大于22的单株收获种子。

4.根据权利要求1所述的一种抗赤霉病多结实小穗数小麦的分子标记辅助选育方法，其特征在于，所述步骤S6中大田赤霉病、黄花叶病的鉴定具体为：赤霉病鉴定采用抗扩展鉴定，制备赤霉菌孢子悬浮液4×10⁵-5×10⁵孢子/mL，采用单花滴注法接种；黄花叶病的鉴定采用自然发病鉴定；选择赤霉病和黄花叶病的抗病鉴定结果均呈R级的株行挂牌标记。

5.根据权利要求4所述的一种抗赤霉病多结实小穗数小麦的分子标记辅助选育方法，其特征在于，所述步骤S6中大田赤霉病、黄花叶病的鉴定中还包括种植苏麦3号和安农8455各5行为赤霉病抗（R）和感(S)对照；镇麦9号和苏麦3号为白粉病抗（R）和感（S）的对照；宁麦13和扬麦158为黄花叶病抗（R）和感（S）的对照。

6.根据权利要求1所述的一种抗赤霉病多结实小穗数小麦的分子标记辅助选育方法，其特征在于，所述步骤S6中对照为指扬麦20。

7.根据权利要求1所述的一种抗赤霉病多结实小穗数小麦的分子标记辅助选育方法，其特征在于，所述方法还包括将F5种植成鉴定圃，以扬麦20为农艺性状参照，全面考察品系的综合农艺性状和综合抗病性、抗倒性，产量鉴定后选择亩产量比对照扬麦20高6%以上的进入下一级多点产量鉴定试验，确定最终选育品种。

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