CN114277173A - 一种与玉米抗南方锈病主效qtl紧密连锁的分子标记及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种与玉米抗南方锈病主效QTL紧密连锁的分子标记，所述玉米抗南方锈病主效QTL位点，是位于玉米第6号染色体上bin 6.01区域内的qSCR6.01，与其紧密连锁的分子标记包括2个InDel标记—SCR01和SCR02；InDel标记SCR01和SCR02的InDel物理位置分别为88159962和88561362。本发明中玉米抗南方锈病的主效QTL位点位置明确，贡献率较高，能显著改善玉米自交系材料的抗南方锈病性状，检测方法方便快速，不受环境影响，为玉米抗病分子育种提供了一条可行的技术途径。

Description

一种与玉米抗南方锈病主效QTL紧密连锁的分子标记及其 应用

技术领域

本发明涉及基因工程及分子生物学领域，具体地说，涉及与玉米抗南方锈病主效QTL紧密连锁的分子标记及其应用。

背景技术

玉米(Zea mays L.)是我国种植面积最大，产量最高的粮食和经济作物。玉米南方锈病是由多堆柄锈菌(Puccinia polysora Underw.)引起的气传性真菌病害，最早作为热带病害在非洲首次被发现和鉴定(Stanton et al.,1953；Rhind et al.,1952；Stoery etal.,1954)；1972年，该病害在我国海南省首次发现(段定仁等，1984)。近年来，随着全球气候的变化、主栽培品种更迭、感病品种大面积推广和病原菌数量增多，玉米南方锈病已经成为我国海南、广西、广东、江苏、浙江等热带、亚热带玉米产区和黄淮海玉米产区的重要病害。抗病品种的推广是控制玉米南方锈病最为有效的方法。因此，筛选抗性种质资源，确保玉米生产持续稳定发展是当前玉米育种的迫切任务。

近年来，国内外学者对玉米南方锈病抗性QTL定位的研究报道很多，利用不同群体检测到多个抗性QTL，这些研究对阐明玉米南方锈病的遗传机制起到了一定作用，但由于不同研究所用的群体类型和大小、遗传背景、遗传图谱密度及统计分析方法的不同，同一性状定位的QTL存在着数目、位置及效应方面的差别；而且通常检测出的QTL分布在不同的染色体上，单个QTL的效应值较小，从而限制了研究结果在育种中的应用。

育种家多利用少数抗性较为明显的抗性基因进行育种，抗病背景日益狭窄，在生产实践中，新的生理小种的出现致使已有抗病品种被克服，导致病害继续流行，造成经济损失(王晓鸣等，2000)。因此筛选新的抗病种质并在育种材料中尽量聚合多个抗病基因和广谱抗病基因能够对病害起到广谱的抗性，满足抗病育种和生产实践的要求。筛选抗病资源，发掘和定位新的广谱抗病基因或QTL是选育抗病品种的前提和基础。

发明内容

本发明的目的是提供与玉米抗南方锈病主效QTL紧密连锁的分子标记。

本发明的另一目的是提供所述分子标记在筛选或鉴定玉米抗南方锈病种质资源中的应用。

本发明的还一目的是提供所述分子标记在筛选或鉴定玉米抗南方锈病种质资源中的应用。

本发明的再一目的是提供一种培育对玉米南方锈病种质资源提高的方法。

为了实现本发明目的，本发明首先提供了一种与玉米抗南方锈病主效QTL紧密连锁的分子标记，所述玉米抗南方锈病主效QTL是位于玉米第6号染色体bin 6.01区域内的qSCR6.01，与其紧密连锁的分子标记包括2个InDel标记--标记SCR01-SCR02之间，物理距离88.16-88.56Mb(Zm-B73-REFERENCE-NAM-5.0)；各分子标记的引物如下：

SCR01的正向引物和反向引物序列分别为SEQ ID NO.1和2；

SCR02的正向引物和反向引物序列分别为SEQ ID NO.5和6。

其中，利用SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的引物在玉米高抗南方锈病自交系齐319中可扩增出大小为157bp的条带，核苷酸序列如SEQ ID NO.3；在高感南方锈病自交系掖478中可扩增出大小为179bp的条带，核苷酸序列如SEQ ID NO.4；

利用SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示的引物在玉米高抗南方锈病自交系齐319中可扩增出大小为89bp的条带，核苷酸序列如SEQ ID NO.7；在高感南方锈病自交系掖478可扩增出大小为79bp的条带，核苷酸序列如SEQ ID NO.8。

进一步地，本发明还提供所述分子标记在鉴定玉米抗南方锈病的主效QTL位点qSCR6.01中的应用。

进一步地，本发明还提供所述分子标记在筛选或鉴定玉米抗南方锈病种质资源中的应用。

所述应用包括如下步骤：

1)提取待测植株的基因组DNA；

2)以待测植株的基因组DNA为模板，利用扩增权利要求1或2所述分子标记的引物，进行PCR扩增反应；

3)检测PCR扩增产物；

在一优选实施例中采用8％聚丙烯酰胺凝胶电泳检测标记SCR01-SCR02之间的PCR扩增产物。

进一步地，本发明还提供用于鉴定或辅助鉴定玉米抗南方锈病性状的试剂盒，所述试剂盒包含扩增分子标记SCR01和SCR02的引物；其中，分子标记的引物如下：SCR01的正向引物和反向引物序列分别为SEQ ID NO.1和2；SCR02的正向引物和反向引物序列分别为SEQ ID NO.5和6。

更进一步地，本发明还提供一种培育对玉米南方锈病种质资源提高的方法，其方法如下：

1)提取待测植株的基因组DNA；

2)以基因组DNA为模板，采用SEQ ID NO.1-2，SEQ ID NO.5-6所示的引物进行PCR扩增，将所得PCR产物进行电泳，比对电泳条带的带型与参照带型；

3)所述参照带型为以玉米高抗南方锈病自交系齐319的基因组DNA为模板，采用SEQ IDNO.1-SEQ ID NO.2所示的引物对以及SEQ ID NO.5-SEQ ID NO.6所示的引物对进行PCR扩增，电泳所得的带型；

4)对待测植株进行评估，筛选与参照带型的相同或80％以上相近的带型的植株作为亲本进行育种。

本研究的有益效果：

本发明首次在玉米6号染色体上定位到玉米抗南方锈病的主效QTL位点qSCR6.01点。在常规育种方法当中，玉米南方锈病抗性的鉴定要等到玉米乳熟期后，费时费力且选择效率低下，通过对玉米抗南方锈病的主效QTL位点的检测，可以在苗期或利用种子的小部分胚乳对感病单株进行淘汰，不仅节约生产成本而且大大提高选择效率。

本发明中玉米抗南方锈病的主效QTL点位置明确，贡献率较高，能显著改善玉米自交系材料的抗南方病性状，检测方法方便快速，不受环境影响。

附图说明

图1为玉米自交系材料齐319(抗病亲本)和掖478(感病亲本)人工接种后对南方锈病的植株表现及病情指数。

图2为本发明实施例2中利用染色体片段代换系(CSSL)群体验证主效抗病QTLqSCR6.01的结果。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

实施例1：玉米抗南方锈病主效位点qSCR6.01的筛选过程

1.1材料与方法

1.1.1试验材料

由齐319和掖478为亲本，通过单粒传法，构建了300株F₁₁ RILs群体，进行抗病QTL检测。

1.1.2抗病性鉴定

为保证菌源统一，在广西南宁采集锈病孢子，经实验室纯化，人工接种在温室内易感自交系黄早四上进行培养、增殖。待发病后，采集新鲜的携带有多堆柄锈菌(Pucciniapolysora Underw.)孢子的感病叶片，人工搓洗或用小刷子刷洗，过滤，加入0.02％的吐温(v/v)，充分混匀，配成浓度为6×10⁴个孢子/mL的夏孢子悬浮液作为人工接种的材料。

人工接种鉴定和自然发病鉴定都采用相同的病害调查方法。在玉米生长至8～9叶期进行喷雾器喷洒菌液接种，每株玉米的接种量为7～8mL菌液。同时，保证田间湿度条件满足病菌的入侵和植株发病需求。在玉米进入乳熟期进行表型鉴定。调查时目测每份鉴定材料群体的发病面积。调查重点部位为玉米果穗的上下部3叶，根据病害症状，逐份材料进行调查并记录病情级别(王晓鸣，2005)，再根据病情级别进行抗病性综合评价(表1)。

表1玉米南方锈病病情级别

病情级别	症状描述	抗性
			1	叶片上无病斑或仅有过敏性反应	高抗(HR)
3	叶片上有少量孢子堆，占叶面积少于25％	抗(R)
			5	叶片上有中量孢子堆，占叶面积26～50％	中抗(MR)
7	叶片上有大量孢子堆，占叶面积51～75％	感(S)
			9	叶片上有大量孢子堆，占叶面积76～100％，叶片枯死	高感(HS)

1.1.3基因型分析与QTL定位

本实验室前期已完成对抗病亲本齐319、感病亲本掖478的314个RIL群体的重测序，相关数据及基因型已发表(Zhou，2016)。

分子标记连锁图谱通过QTL Icimapping软件构建，按照软件要求整理基因型数据，在LOD大于3.5的条件下进行分组，采用nntwoOpt进行排序，采用SaRF进行整理。分子标记连锁图谱构建后，采用IcIM加性作图方法进行QTL定位，定位过程中去掉缺失的表型，作图步长为0.20cM，通过1000次的置换检验确定在P＝0.05水平下QT；显著的LOD水平。

1.2结果

1.2.1连锁图谱构建

对RILs群体和亲本(齐319、掖478)进行基因分型。共筛选到137,699,000reads，平均每个个体有357,376reads。共开发88,268个SNPs，最终筛选出4183个在亲本间有特异性的SNPs锚定在遗传连锁图谱上。构建覆盖玉米10条染色体，覆盖染色体总长度为1545.65cM的高密度图谱，分子标记间平均遗传距离为0.37cM，物理距离为0.51Mb(B73_v3,Mb)(Zhou，2016)。

1.2.2RILs群体抗南方锈病QTL初步定位结果

结合田间表型数据和群体基因型数据，利用QTL IciMapping V4.1软件的混合线性模型对2017、2018年广西南宁两个点的RILs群体表型数据和相应的基因型数据进行分析，1000次迭代之后，在P＝0.05水平下，得到的QTL的定位结果如表2所示。

表2重组自交系抗南方锈病QTL检测

实例2：基于CSSL群体对qSCR6.01的验证分析

2.1材料与方法

2.1.1试验材料

为了有效验证RIL群体的定位结果及后续的精细定位，选用优良玉米自交系齐319为非轮回亲本，掖478为轮回亲本，构建覆盖全染色体的BC₅F₃的CSSLs群体。从中挑选出以掖478基因型为遗传背景，齐319基因片段为导入片段，覆盖第6号染色体的6个染色体片段置换系用于抗病QTL的鉴定。其中导入系CL183在第6号染色体bin6.01区域存在抗南方锈病QTL导入片段，CL183×掖478的F₂分离群体用于精细定位。

2.1.2表型鉴定

人工接种鉴定和自然发病鉴定都采用相同的病害调查方法。在玉米生长至8～9叶期进行喷雾器喷洒菌液接种，每株玉米的接种量为7～8mL菌液。同时，保证田间湿度条件满足病菌的入侵和植株发病需求。在玉米进入乳熟期进行表型鉴定。调查时目测每份鉴定材料群体的发病面积。调查重点部位为玉米果穗的上下部3叶，根据病害症状，逐份材料进行调查并记录病情级别(王晓鸣，2005)，再根据病情级别进行抗病性综合评价。

2.2结果

根据重组自交家系QTL定位的结果，初步将抗南方锈病基因定位在第6号染色体上，因此从覆盖第6号染色体的18个置换系中挑选出携带抗南方锈病基因的置换系，消除遗传背景干扰、进行精细定位。通过基因型检测，筛选出基本覆盖第6号染色体的6株染色体片段置换系(图1)，这6个片段置换系(BC₅F₃)的平均背景回复率为98.3％～99.8％(表3)。对6个染色体片段置换系进行表型鉴定，表3为6个置换系基因型和表型分析。

利用齐319和掖478衍生的CSSLs群体开展qSCR6.01的精细定位。基因型和表型数据表明CL183携带抗南方锈病基因，抗病基因位于umc1133～umc1887之间，抗病等级为4.5。在RIL群体中，第6号染色体上的QTL定位在75.30～78.25Mb之间如表3，(B73_RefGen_v3)，与CL183导入片段区间相印证(图2)。

表3染色体片段置换系与掖478抗性比对

表中，“+/+”，目标区段与齐319带型保持一致；“-/-”，目标区段与掖478带型保持一致。

实例3：CSSLs群体抗南方锈病基因精细定位

3.1材料与方法

3.1.1试验材料

选取CL183与披478杂交组配F₁，组配的F₁群体自交得到F₂群体，利用两端SSR标记及筛选出的在亲本间有特异性的引物10对，对目标片段进行加密(表4)。经过基因型验证，挑选出6个纯合重组体，6种非纯合重组体，纯合重组体自交留种用于田间表型标定，非纯合重组体自交产生F₃，用于子代家系验证。

表4 11对InDel引物信息

注:表中的物理位置参考(Zm-B73-REFERENCE-NAM-5.0)

3.1.2多态性标记开发

结合亲本齐319和掖478重测序的数据开发设计Indel标记。

2.1.2表型鉴定

在北京对筛选到的重组单株进行自交。采用重组单株的自交后代进行验证，在广西南宁、海南三亚进行人工发病鉴定，每个地点3次重复，每重复1个材料种植100-200个单株。在玉米乳熟期调查抗病性，采用0-9级的分级标准。利用定位区间Indel标记分析鉴定单株的基因型，结合抗病性开展精细定位。

当玉米生长至5叶期时，每株取少量新鲜叶片，采用CTAB法提取基因组DNA。SSR标记来源于数据库MaizeGDB(http://www.maizegdb.org/)，Indel标记的开发源于齐319和掖478重测序的数据，引物序列由华大基因生物科技有限公司合成。PCR反应采用降落式的扩增程序，扩增产物用8％的聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，银染显色。

PCR扩增反应采用15μL体系，体系组分如下：ddH₂0 11.30ΜL；PCR反应缓冲液1.50uL；dNTP Mixture(各l0mM)0.80μL；taq DNA聚合酶(5U/μL)0.10μL；正、反向引物(l.0μM)各0.30μL；DNA模板(50ng/μL)1.00μL。将各反应组分混匀后，加20.00μL矿物油覆盖，在Ptc200型PCR仪上进行扩增，扩增程序如下：94℃5min；94℃40s，67℃30s(每个循环降l℃)，72℃40s，共10个循环；94℃40s，55℃30s，72℃40s，共30个循环；7℃8min。

3.2结果

3.2.1多态性标记

利用CL183和掖478杂交F₂代群体对qSCR6.01进行进一步精细定位。根据亲本测序结果设计InDel引物，在第6号染色体定位区间挑选在亲本间有特异性的InDel引物对目标区段进行加密。根据设计的InDel引物，对F₂群体进行基因型验证，及对其后代进行表型鉴定。经过基因型和表型鉴定将区间缩小到标记SCR01-SCR02之间，物理距离88.16-88.56Mb(Zm-B73-REFERENCE-NAM-5.0)。

InDel引物如下：

SCR01的正向引物和反向引物序列分别为SEQ ID NO.1和2；

SCR02的正向引物和反向引物序列分别为SEQ ID NO.5和6。

利用SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的引物在玉米高抗南方锈病自交系齐319中可扩增出大小为157bp的条带，核苷酸序列如SEQ ID NO.3；在高感南方锈病自交系掖478中可扩增出大小为179bp的条带，核苷酸序列如SEQ ID NO.4；

利用SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示的引物在玉米高抗南方锈病自交系齐319中可扩增出大小为89bp的条带，核苷酸序列如SEQ ID NO.7；在高感南方锈病自交系掖478可扩增出大小为79bp的条带，核苷酸序列如SEQ ID NO.8。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，运对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做一些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

参考文献

(1)段定仁,何宏珍,1984.海南岛玉米上的多堆柄锈菌.真菌学报,(02):125-126.DOI:10.13346/j.mycosystema.1984.02.011.

(2)王晓鸣,金达生,戴法超,梁克恭,2000.作物遗传资源的抗病虫多样性与农业可持续发展.中国农业科技导报,(05):67-70.DOI:CNKI:SUN:NKDB.0.2000-05-021.

(3)王晓鸣,2005.玉米病虫害知识系列讲座(Ⅲ)玉米抗病虫性鉴定与调查技术.作物杂志,(06):53-55.DOI:10.16035/j.issn.1001-7283.2005.06.026.

(4)RHIND D,WATERSTON J M,DEIGHTON F C,1952.Occurrence of Pucciniapolysora Underw.in west Africa.Nature.169:631-634.DOI:10.1038/169631a0.

(5)STANTON W R,CAMMACK R H,1953.Resistance to the maize rust,Pucciniapolysora Underw.Nature,172(4376):505-506.DOI:10.1038/172505b0.

(6)STOREY H H,HOWLAND A K,1954.Resistance to the maize rust,Pucciniapolysora.Nature,173(4408):778-779.DOI:10.1038/173778a0.

(7)ZHOU Z Q,ZHANG C S,ZHOU Y,HAO Z F,WANG Z H,ZENG X,DI H,LI M S,ZHANG DG,YONG H J,ZHANG S H,WENG J F,LI X H,2016.Genetic dissection of maizeplant architecture with an ultra-high density bin map based on recombinantinbred lines.BMC Genomics,17(1):178.DOI:10.1186/s12864-016-2555-z.

序列表

<110> 中国农业科学院作物科学研究所

<120> 一种与玉米抗南方锈病主效QTL紧密连锁的分子标记及其应用

<130> P202102

<160> 8

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 1

atggctaggg attcaggtgg 20

<210> 2

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 2

ctaatcagta ggtggcttgc ac 22

<210> 3

<211> 157

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 3

atggctaggg attcaggtgg gccattgaca acaacatgtg gctggctagg gtgaatagca 60

taaggccttt atttgaaggt ggggttcgtt ctatgctctc tctctctctc tctctctctc 120

ttaagggaac aggaggtgca agccacctac tgattag 157

<210> 4

<211> 179

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 4

atggctaggg attcaggtgg gccattgaca acaacatgtg gctggctagg gtgaatagca 60

taaggccttt atttgaaggt ggggttcgtt ctatgatctc tctctctctc tccccctctc 120

tctctctctc tctctctctc tcttaaggga acaggaggtg caagccacct actgattag 179

<210> 5

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 5

tgtttcaggt gtttcttgga cg 22

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 6

tagaaccgtc cgtgaggcta 20

<210> 7

<211> 89

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 7

tttgtttcag gtgtttcttg gacgctgttt catgtttaat gttttcgaaa tcgttttctc 60

gtgaaatcca agcctcacgg acggttcta 89

<210> 8

<211> 79

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 8

tttgtttcag gtgtttcttg gacgttttgt tcatctttaa tcatttttca cctgtctatt 60

agcctcacgg acggttcta 79

Claims (8)

1.一种与玉米抗南方锈病主效QTL紧密连锁的分子标记，所述玉米抗南方锈病主效QTL位点，是位于玉米第6号染色体上bin 6.01区域内的qSCR6.01，与其紧密连锁的分子标记包括2个InDel标记—SCR01和SCR02；InDel标记SCR01和SCR02的InDel物理位置分别为88159962和88561362；各分子标记的引物如下：

SCR01的正向引物和反向引物序列分别为SEQ ID NO.1和2；

SCR02的正向引物和反向引物序列分别为SEQ ID NO.5和6。

2.根据权利要求1所述的分子标记，其特征在于，利用SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的引物在玉米高抗南方锈病自交系齐319中可扩增出大小为157bp的条带，核苷酸序列如SEQ ID NO.3；在高感南方锈病自交系掖478中可扩增出大小为179bp的条带，核苷酸序列如SEQ ID NO.4；

利用SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示的引物在玉米高抗南方锈病自交系齐319中可扩增出大小为89bp的条带，核苷酸序列如SEQ ID NO.7；在高感南方锈病自交系掖478可扩增出大小为79bp的条带，核苷酸序列如SEQ ID NO.8。

3.根据权利要求1或2所述分子标记在鉴定玉米抗南方锈病的主效QTL位点qSCR6.01中的应用。

4.根据权利要求1或2所述分子标记在筛选或鉴定玉米抗南方锈病种质资源中的应用。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，包括如下步骤：

1)提取待测植株的基因组DNA；

2)以待测植株的基因组DNA为模板，利用扩增所述分子标记的引物，进行PCR扩增反应；

3)检测PCR扩增产物；其中，所述分子标记的引物如下：

SCR01的正向引物和反向引物序列分别为SEQ ID NO.1和2；

SCR02的正向引物和反向引物序列分别为SEQ ID NO.5和6。

6.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，步骤3)中采用8％聚丙烯酰胺凝胶电泳检测标记SCR01和SCR02的PCR扩增产物。

7.用于鉴定或辅助鉴定玉米抗南方锈病性状的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含扩增分子标记SCR01和SCR02的引物；其中，分子标记的引物如下：SCR01的正向引物和反向引物序列分别为SEQ ID NO.1和2；SCR02的正向引物和反向引物序列分别为SEQ ID NO.5和6。

8.一种培育对玉米南方锈病种质资源提高的方法，其特征在于，方法如下：

1)提取待测植株的基因组DNA；

2)以基因组DNA为模板，采用SEQ ID NO.1-2，SEQ ID NO.5-6所示的引物进行PCR扩增，将所得PCR产物进行电泳，比对电泳条带的带型与参照带型；

3)所述参照带型为以玉米高抗南方锈病自交系齐319的基因组DNA为模板，采用SEQ IDNO.1-SEQ ID NO.2所示的引物对以及SEQ ID NO.5-SEQ ID NO.6所示的引物对进行PCR扩增，电泳所得的带型；

4)对待测植株进行评估，筛选与参照带型的相同或80％以上相近的带型的植株作为亲本进行育种。

Images