CN105349684A - 与玉米抗粗缩病主效qtl紧密连锁的分子标记 - Google Patents

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Abstract

本发明提供与玉米抗粗缩病主效QTL紧密连锁的分子标记，所述玉米抗粗缩病主效QTL是位于玉米第8号染色体Bin8.03区域内的qMrdd8，与其紧密连锁的分子标记包括2个InDel标记-IDP25K和IDP27K，以及1个SNP标记；InDel标记IDP25K和IDP27K的InDel物理位置分别为103537713和103634975，SNP标记的SNP物理位置为103446448；上述物理位置均参考玉米自交系B73AGPv3。本发明通过精细定位玉米抗粗缩病的主效QTL位点qMrdd8，发现了与玉米抗粗缩病基因紧密连锁的3个分子标记，为玉米抗病分子育种提供了一条可行的技术途径。

Description

与玉米抗粗缩病主效QTL紧密连锁的分子标记
技术领域
本发明涉及基因工程及分子生物学领域，具体地说，涉及与玉米抗粗缩病主效QTL紧密连锁的分子标记。
背景技术
玉米(ZeamaysL.)是重要的粮食和饲料作物，也是现代食品和化学工业的原料。我国是仅次于美国的世界第二大玉米生产国，特别是近30年来，我国玉米生产发展迅速，种植面积扩大、生产总量增加的速度均超过水稻、小麦等其它作物。玉米生产在我国农业生产和经济发展中占有日益重要的地位，但其面临多重逆境影响，特别是随着气候变暖、耕作制度改变和单一品种大面积种植，病虫害发生流行严重影响了玉米的稳产性(陈建军等,2009；陈永坤,2006；苗洪芹等,1997)。玉米粗缩病(MaizeRoughDwarfDisease,MRDD)是全球玉米种植区广泛发生的病毒性病害，玉米感病后呈现系统侵染，生长发育受阻，主要由灰飞虱(LaodelphaxstriatellusFallen)以持久性方式传播的玉米粗缩病毒或者水稻黑条矮缩病毒引起。20世纪70年代中期，曾导致河北、北京大面积的玉米减产或绝产。目前，该病害已成为我国黄淮海玉米主产区的主要病害之一。在玉米抗粗缩病资源鉴定筛选基础上，部分学者对粗缩病的抗性遗传规律进行了研究。多数研究结果表明，玉米对粗缩病的抗性呈数量性状(王飞,2007；Shietal.,2012；Luanetal.,2012)。大面积种植感病品种、病毒和寄主之间失去平衡是导致粗缩病发生的主要原因。玉米生产上采取的农业防治措施存在易造成环境污染且防治效果差等缺点，因此，培育和种植抗病品种是防控粗缩病的有效途径。
分子标记基于DNA水平的差异，常用的分子标记包括简单串联重复标记(simplesequencerepeat，SSR)与单核苷酸多态性(SingleNucleotidePolymorphisms,SNP)。SSR序列由于核心序列重复数目不同，形成了丰富的长度多态性，而SSR两侧序列一般是相对保守的单拷贝序列(任敬雯,2011)。SNP是指同一物种不同个体间在相同染色体座位上存在变化，SNP变化形式包括单个碱基的转换、颠倒、插入或缺失，发生转换和颠换的频率比发生插入和缺失的频率高。由于分子标记具有数量庞大，检测不受环境条件、发育时期和表达等因素影响，共显性分子标记能提供完整丰富的遗传信息等优点，已被广泛应用于种质资源鉴定、群体遗传多样性分析、转基因阳性植株筛选、QTL定位及基因克隆、分子标记辅助选择等方面。分子标记辅助选择就是利用分子标记与目标性状基因紧密连锁的特点，通过检测分子标记，即可检测目的基因，达到选择目标性状的目的，具有快速、准确、不受环境条件干扰的优点。利用抗病自交系CL1165衍生的近等基因系在Bin8.03定位到1个主效抗病QTL，利用与抗病QTL紧密连锁的分子标记，对来源于PB类群的沈137进行分子标记辅助选择，有效地提高了选择材料的抗病性(张彦军,2012)。
发明内容
本发明的目的是提供与玉米抗粗缩病主效QTL紧密连锁的分子标记。
为了实现本发明目的，本发明的与玉米抗粗缩病主效QTL紧密连锁的分子标记，所述玉米抗粗缩病主效QTL是位于玉米第8号染色体Bin8.03区域内的qMrdd8，与其紧密连锁的分子标记包括2个InDel标记--IDP25K和IDP27K，以及1个SNP标记；InDel标记IDP25K和IDP27K的InDel物理位置分别为103537713和103634975，SNP标记的SNP物理位置为103446448；上述物理位置均参考玉米自交系B73AGPv3；各分子标记的引物如下：
IDP25K的正向引物和反向引物序列分别为SEQIDNO.1和2；
IDP27K的正向引物和反向引物序列分别为SEQIDNO.3和4；
SNP标记的正向引物和反向引物序列分别为SEQIDNO.5和6。
其中，利用SEQIDNO.1和2在玉米抗粗缩病自交系X178中可扩增出大小为2925bp的含标记IDP25K的特征条带，其中，标记IDP25K的核苷酸序列如SEQIDNO.29所示；利用SEQIDNO.3和4在玉米抗粗缩病自交系X178中可扩增出大小为3048bp的含标记IDP27K的特征条带，其中，标记IDP27K的核苷酸序列如SEQIDNO.30所示的特征条带。在玉米感病自交系B73中无法扩增出上述2925bp、3048bp的特征条带。
利用SEQIDNO.5和6可在玉米中扩增出大小为361bp的条带，且所述SNP标记在玉米抗粗缩病自交系X178的物理位置为103446448处的碱基为T，在玉米感病自交系B73的物理位置为103446448处的碱基为C。
本发明还提供所述分子标记在鉴定玉米抗粗缩病的主效QTL位点qMrdd8中的应用。
本发明还提供所述分子标记在筛选或鉴定玉米抗粗缩病种质资源中的应用。所述应用包括如下步骤：
1)提取待测植株的基因组DNA；
2)以待测植株的基因组DNA为模板，利用扩增上述分子标记的引物，进行PCR扩增反应；
3)检测PCR扩增产物。
优选地，步骤3)中采用1.5％琼脂糖凝胶电泳检测I标记IDP25K、IDP27K的PCR扩增产物，采用DNA测序技术检测SNP标记的PCR扩增产物。
本发明还提供所述分子标记在玉米分子标记辅助育种中的应用。
本发明还提供根据所述InDel分子标记IDP25K和IDP27K开发的与玉米抗粗缩病主效QTL紧密连锁的分子标记及其在筛选或鉴定玉米抗粗缩病种质资源中的应用。。
本发明进一步提供用于鉴定玉米抗粗缩病种质资源的PCR检测试剂盒，所述试剂盒包含扩增上述各分子标记(即IDP25K和IDP27K，及SNP标记)的引物。
本发明通过精细定位玉米抗粗缩病的主效QTL位点qMrdd8，发现了与玉米抗粗缩病基因紧密连锁的3个分子标记，包括2个InDel标记--IDP25K和IDP27K，以及1个SNP标记。所述分子标记的开发为高产玉米分子辅助育种提供了一条可行的途径。
附图说明
图1为本发明实施例1中利用F2群体定位主效抗病QTLqMrdd8的遗传图谱。
图2为本发明实施例2中2014年主效QTLqMrdd8的精细定位结果。
图3为本发明实施例3中InDel25的序列。
图4为本发明实施例3中InDel27的序列。
图5为本发明实施例3中2015年主效QTLqMrdd8的精细定位结果。
图6为本发明实施例4中玉米自交系B73与X178的SNP7基因型。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册(SambrookJ&RussellDW,Molecularcloning:alaboratorymanual,2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。
实施例12012年玉米抗粗缩病主效QTLqMrdd8定位
1.1材料与方法
1.1.1试验材料
前期以X178与B73的重组自交系群体(RIL)在Bin8.03定位到了一个主效抗病QTL(Shietal.,2012)。本发明以来源于X178与B73的RIL群体的家系NL203为抗病亲本，B73为感病亲本，构建了3个F2群体，分别表示为F2-1、F2-2和F2-5，分别包含241、253和312个单株。
1.1.2抗病性鉴定
3个F2群体采用不同的鉴定方法，其中F2-1和F2-2在江苏南京进行人工接种鉴定，F2-5在江苏盐城进行自然发病鉴定。在江苏盐城对F2-5群体进行自然发病鉴定时，选择靠近小麦或水稻的长方形试验地。整个F2-5群体种植成21行，每行15株，行长4米，行宽0.6米，设置自交系NL203为抗病对照，B73为感病对照。播种时不使用杀虫剂，苗期进行正常田间管理，不进行病虫害防治。
在江苏南京采用网箱集团接种结合移栽的方法对F2-1和F2-2群体进行人工接种鉴定。首先将F2-1和F2-2群体的种子播种在发苗盘内(60cm×40cm)，每个发苗盘播种50粒，包括抗病对照NL203和感病对照B73各10粒。发苗盘放置在无灰飞虱的地方，防止在玉米苗期灰飞虱意外传毒。当玉米生长至2叶1心时，每个发苗盘加盖60目的防虫网箱(70cm×50cm×50cm)。同时，通过RT-PCR和酶联免疫法检测水稻幼苗(株高达15cm左右)上灰飞虱的带毒率。此时，水稻幼苗上的灰飞虱全部从小麦等作物上迁飞而来，虫龄整齐一致，适合于玉米粗缩病的人工接种鉴定。按照平均每株玉米1头带毒灰飞虱的比例将相同水稻田上捕获的灰飞虱群体放入防虫网箱内。在室温条件下接种3天，每天早中晚3次人工惊扰灰飞虱，促使其迁飞而均匀传毒。传毒结束后，移走防虫网，喷洒杀虫剂以杀死灰飞虱终止传毒。在玉米生长至4叶1心时移栽到大田防虫网室内，成熟期调查单株的抗病性。
人工接种鉴定和自然发病鉴定都采用相同的病害调查方法。在玉米成熟期，将病害严重度分为5级，具体的分级标准如下：0级，健康植株；1级，株高为健株株高的4/5左右，仅上部叶片有蜡白色突起，整个植株与健康植株的差异不大；2级，为健株株高的2/3左右，半数以上叶片有明显的蜡白色突起；3级，为健株株高的1/2左右，植株变粗，叶色浓绿，所有叶片有明显的蜡白色突起；4级，为健株株高的1/3以下，不能抽雄，叶色浓绿，整株显症或提早枯死。在分级调查的基础上，计算抗感对照的病情指数(diseaseseverityindex，DSI)。DSI(％)＝(0级×该级别株数+1级×该级别株数+2级×该级别株数+3级×该级别株数+4级×该级别株数)/(最高病级×调查总株数)×100。
1.1.3基因型分析与QTL定位
当玉米生长至5叶期时，每株取少量新鲜叶片，采用CTAB法提取基因组DNA。SSR和InDel标记来源于数据库MaizeGDB(http://www.maizegdb.org/)，引物序列由北京奥科生物科技有限公司合成。PCR反应采用降落式的扩增程序，扩增产物用6％的聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，银染显色。
PCR扩增反应采用15μL体系，体系组分如下：ddH2O11.30μL；PCR反应缓冲液1.50μL；dNTPMixture(各10mM)0.80μL；TaqDNA聚合酶(5U/μL)0.10μL；正、反向引物(1.0μM)各0.30μL；DNA模板(50ng/μL)1.00μL。将各反应组分混匀后，加20.00μL矿物油覆盖，在PTC200型PCR仪上进行扩增，扩增程序如下：94℃5min；94℃40s，67℃30s(每个循环降1℃)，72℃40s，共10个循环；94℃40s，55℃30s，72℃40s，共30个循环；72℃8min。
分子标记连锁图谱通过QTLIcimapping软件构建。用X2测验法检测各标记基因型分离是否符合1:2:1，按照软件要求整理基因型数据，在LOD大于3.0的条件下进行分组，采用nnTwoOpt进行排序，采用SARF进行整理。分子标记连锁图谱构建后，采用ICIM加性作图方法进行QTL定位，定位过程中去掉缺失的表型，作图步长为0.20cM，通过1000次的置换检验确定在P＝0.05水平下QTL显著的LOD水平。
1.2结果
1.2.1连锁图谱构建
以NL203和B73基因组DNA为模板，筛选第8染色体上157个标记，包括124个SSR标记和33个InDel标记，获得了18个多态性标记，多态性比例为11％。利用筛选获得的多态性标记分析3个F2群体的基因型，并构建连锁图谱。其中，基于群体F2-5的连锁图谱最长，达153.81cM，相邻标记间最大距离25.53cM，平均间距9.01cM(图1)。
1.2.2qMrdd8定位
以NL203和B73构建的3个F2群体为材料，结合人工接种和自然鉴定的抗病性，在玉米第8染色体Bin8.03的区域定位到了抗粗缩病的主效QTLqMrdd8，最高解释表型变异25.71％(图1，表1)。
表1基于F2群体定位主效抗病QTLqMrdd8
实施例22014年玉米抗粗缩病主效QTLqMrdd8精细定位
2.1材料与方法
2.1.1试验材料
2013年海南，选择定位区间umc1617-phi121呈杂合的单株与B73回交的后代种植，期望从中筛选出在定位区间内发生了重组的单株。
2.1.2多态性标记开发
根据MaizeGDB上B73与Mo17之间在定位区间的InDel，总共设计了26对InDel标记。根据自交系基因组重测序的结果，在定位区间内设计了47对InDel标记。
2.1.3表型鉴定与基因型分析
2013年海南，筛选到的重组单株自交。2014年夏季，利用重组单株的自交后代在江苏南京开展人工接种鉴定，在山东济宁开展自然发病鉴定，具体方法与2012年的方法相同。利用定位区间内的多态性标记分析重组单株自交后代的基因型，结合抗病性开展精细定位。
2.2结果
2.2.1多态性标记
利用X178与B73进行筛选之后，根据B73与Mo17设计的InDel，获得了6对多态性标记，分别为ID1，ID5，ID16，ID17，ID18，ID20(表2)。根据自交系掖478与齐319设计的InDel，获得了5对带型清晰的多态性标记，分别为IDRQ1，IDRQ2，IDRQ4，IDRQ20，IDRQ50(表2)。
表22014年开发的多态性标记
注：表2中的物理位置参考B73AGPv3。
2.2.2重组单株筛选与精细定位
2013年海南，利用定位区间内的多态性标记筛选3899个单株，结果获得5种类型的重组单株，重组单株在海南自交。2014年夏季，利用定位区间内的多态性标记分析重组单株自交后代的基因型，结合人工接种鉴定和济宁自然鉴定的结果，推测抗病基因位于标记IDRQ2和ID16之间，区间大小357Kb(图2)。
实施例32015年玉米抗粗缩病主效QTLqMrdd8精细定位
3.1材料与方法
3.1.1试验材料
2014年海南，选择定位区间IDRQ2-ID16呈杂合的单株且与B73回交的后代种植，总共选择了30个果穗，期望从中筛选出在定位区间内发生了重组的单株。
3.1.2多态性标记开发
2014年，针对定位区间参考B73AGPv3设计PCR引物，扩增测定PCR产物的序列以开发多态性标记。
3.1.3表型鉴定与基因型分析
2014年冬季在海南对筛选到的重组单株进行自交。采用重组单株的自交后代，在山东济宁和江苏徐州进行自然发病鉴定，每个地点2次重复，每重复1个材料种植4-8行。在江苏南京进行人工接种鉴定，具体方法与2012年的方法相同。在玉米成熟期调查抗病性，采用0-4级的分级标准和DSI评价每个材料的抗病性。利用定位区间IDRQ2-ID16标记分析鉴定单株的基因型，结合抗病性开展精细定位。
3.2结果
3.2.1多态性标记
通过测定自交系X178与B73在定位区段的部分序列，发现了一个2548bp与一个2761bp的InDel，分别命名为InDel25(图3)与InDel27(图4)，物理位置分别为103537713与103634975，并开发了多态性标记IDP25K与IDP27K(表3)。
表3基于InDel25与InDel27开发的InDel标记
注：表中的物理位置参考AGPv3。
3.2.2重组单株选择与精细定位
针对QTL定位区间，2014年海南总共取样6662株，通过IDRQ1，IDRQ2和ID16等引物的筛选，获得了在IDRQ2和ID16之间发生重组的单株和第1与9等类型的纯合重组单株(图5)。其中，含有杂合片段的重组单株自交后代用于精细定位，第1，2，5与9类型的重组单株与B731:1混合后进行抗病性鉴定。利用定位区间内的多态性标记分析重组单株自交后代的基因型，结合人工接种鉴定和自然鉴定的结果，推测抗病基因位于标记IDRQ2和IDRQ20之间，区间大小347Kb(图5)。
实施例4定位区间内DNA多态性发掘与关联分析
4.1材料与方法
4.1.1试验材料
关联分析以226份玉米自交系构成的自然群体为材料，该群体遗传基础广泛，包括我国6个主要类群即四平头、旅大红骨、Lancaster、BSSS、PA和PB的部分自交系。
4.1.2定位区间多态性发掘
针对定位区间参考B73AGPv3设计PCR引物，扩增测定PCR产物的序列以发掘多态性。
4.1.3表型鉴定与关联分析
供试材料于2010年在山东济宁和2011年在江苏盐城进行抗玉米粗缩病自然鉴定，在每个环境下，试验地靠近小麦田或者水稻田。田间试验采用随机区组设计，2个重复，每个材料种植1行。在玉米成熟期调查抗病性，按0-4级的标准进行分级，在分级调查的基础上，计算每个材料的病情指数。
采取每个自交系苗期的叶片，按照CTAB法提取基因组DNA，通过1.5％的琼脂糖凝胶电泳和分光光度计(Nanodrop2000)检测基因组DNA质量。针对测序发掘的多态性，分析每个自交系的基因型。采用自交系的基因型，结合群体结构、亲缘关系通过TASSELversion3.0软件中的混合线性模型进行关联分析。
4.2结果
4.2.1多态性发掘
通过PCR扩增，测定自交系X178与B73在定位区段的部分序列，发现了一个2548bp与一个2761bp的InDel，分别命名为IDP25K与IDP27K(表3)。同时，发现了一个SNP，物理位置为103446448，命名为SNP7(图6)。
4.2.2基因型分析与关联分析
针对SNP7设计了扩增产物长361bp的引物(SNP7-F：5'-TGGAAGGGTGGATCTATTGCTTG-3'与SNP7-R5'-GTATGGCTTATCGTCCGTGACGT-3')，通过PCR扩增，测序获得226份材料的基因型(表4)。通过PCR扩增电泳获得226份自交系的IDP25K与IDP27K基因型。分析发现SNP7，IDP25K与IDP27K在226份自交系中的基因型一致(表4)。方差分析表明不同自交系之间抗病性差异极显著。通过TASSEL关联分析表明3个基因组多态性与玉米抗粗缩病显著关联(P<0.01)。
表4226份玉米自交系的基因型与表型
注：a中In表示插入，Del表示缺失。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
参考文献
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Claims (10)

1.与玉米抗粗缩病主效QTL紧密连锁的分子标记，其特征在于，所述玉米抗粗缩病主效QTL是位于玉米第8号染色体Bin8.03区域内的qMrdd8，与其紧密连锁的分子标记包括2个InDel标记--IDP25K和IDP27K，以及1个SNP标记；InDel标记IDP25K和IDP27K的InDel物理位置分别为103537713和103634975，SNP标记的SNP物理位置为103446448；上述物理位置均参考玉米自交系B73AGPv3；扩增各分子标记的引物如下：
IDP25K的正向引物和反向引物序列分别为SEQIDNO.1和2；
IDP27K的正向引物和反向引物序列分别为SEQIDNO.3和4；
SNP标记的正向引物和反向引物序列分别为SEQIDNO.5和6。
2.根据权利要求1所述的分子标记，其特征在于，利用SEQIDNO.1和2在玉米抗粗缩病自交系X178中可扩增出大小为2925bp的含标记IDP25K的特征条带，其中，标记IDP25K的核苷酸序列如SEQIDNO.29所示；
利用SEQIDNO.3和4在玉米抗粗缩病自交系X178中可扩增出大小为3048bp的含标记IDP27K的特征条带，其中，标记IDP27K的核苷酸序列如SEQIDNO.30所示的特征条带。
3.根据权利要求1或2所述的分子标记，其特征在于，所述SNP标记在玉米抗粗缩病自交系X178的物理位置为103446448处的碱基为T，在玉米感病自交系B73的物理位置为103446448处的碱基为C。
4.权利要求1-3任一项所述分子标记在鉴定玉米抗粗缩病的主效QTL位点qMrdd8中的应用。
5.权利要求1-3任一项所述分子标记在筛选或鉴定玉米抗粗缩病种质资源中的应用。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，包括如下步骤：
1)提取待测植株的基因组DNA；
2)以待测植株的基因组DNA为模板，利用扩增权利要求1-3任一项所述分子标记的引物，进行PCR扩增反应；
3)检测PCR扩增产物；
其中，标记IDP25K、IDP27K以及SNP标记的正向引物和反向引物序列同权利要求1所述。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，步骤3)中采用1.5％琼脂糖凝胶电泳检测标记IDP25K、IDP27K的PCR扩增产物，采用DNA测序技术检测SNP标记的PCR扩增产物。
8.权利要求1-3任一项所述分子标记在玉米分子标记辅助育种中的应用。
9.鉴定玉米抗粗缩病种质资源的PCR检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含扩增权利要求1-3任一项所述分子标记的引物，其中，标记IDP25K、IDP27K以及SNP标记的正向引物和反向引物序列同权利要求1所述。
10.根据权利要求1-3任一项所述分子标记IDP25K和IDP27K开发的与玉米抗粗缩病主效QTL紧密连锁的分子标记。
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