CN116193982A - 番茄中导致ToBRFV抗性的基因 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种抗ToBRFV的番茄(Solanum lycopersicum)植物，所述植物在8号染色体上包含SEQ ID No.1至4的QTL。通过使用选自SEQ ID No.1至42中所示的SNP的标志物中的至少一种来鉴定8号染色体上所述QTL的存在。所述QTL存在于番茄植物的基因组中，所述番茄植物的代表性种子以保藏号NCIMB 43637保藏在NCIMB中。
Description
技术领域
本发明涉及包含QTL的番茄(Solanum lycopersicum)植物，其包含导致番茄褐色皱果病毒(ToBRFV)抗性的基因的等位基因。本发明还涉及赋予ToBRFV抗性的基因的等位基因。本发明进一步涉及产生ToBRFV抗性番茄植物的方法，以及鉴定和选择包含所述基因的等位基因的这种植物的方法。本发明还涉及番茄褐色皱果病毒抗性番茄植物的子代、种子和果实，涉及适合用于产生番茄植物的繁殖材料以及包含这种番茄果实或其部分的食品。本发明还涉及细胞或组织培养物，所述细胞或组织培养物由番茄褐色皱果病毒抗性番茄植物产生或可再生成番茄褐色皱果病毒抗性番茄植物。本发明还涉及一种用于鉴定导致番茄褐色皱果病毒抗性的基因的等位基因的标志物，以及所述标志物的用途。
背景技术
在保护作物栽培和露天作物栽培中，病毒性疾病是蔬菜种植者必须处理的主要威胁之一。一旦作物受到感染，通过难以控制的介体(通常是昆虫)，病毒可以迅速发生传播。此外，通过工具和田野工作者的汁液传播，栽培方法经常导致病毒的进一步传播。
针对病毒感染的最佳保护措施是使用抗性品种。已经鉴定出对许多已知病毒的抗性，这些抗性通过育种掺入合适的番茄品种中，使种植者即使在病毒压力下也能获得良好的产量。抗性通常可以分为不同的类型，最常见的是耐受性和抗性。耐受性并不一定意味着抗性水平较低，但它表明植物没有症状或症状减轻，即使所述病毒仍能在宿主内复制。抗性描述了一种机制，其中不仅症状消失或极大减少，而且植物内的病毒复制也受到限制，即不存在或极大减少。
在2015年，发表了一种新的烟草花叶病毒属(tobamovirus)病毒在番茄中出现(Salem等人,A new tobamovirus infecting tomato crops in Jordan.ArchVirol.2016Feb；161(2):503-6.Epub 2015Nov 19)。该病毒被证明与已知的烟草花叶病毒属烟草花叶病毒(TMV)、番茄花叶病毒(ToMV)和番茄轻斑驳病毒(ToMMV)有关，ToMMV和ToMV的最接近的相关序列的序列同一性为约80％至90％。植物的症状相当轻微，但几乎所有果实都出现了非常严重的褐色皱纹症状。观察到所述病毒破坏了常用的针对ToMV的抗性基因(Tm-1、Tm-2和Tm-22)的抗性，其中后者也称为Tm-2a。后来的出版物显示，在以色列也发现了该病毒，并确定该病毒也可以感染辣椒(Capsicum annuum)植物(Luria等人,(2017):A newIsraeli tobamovirus isolate infects tomato plants harboring Tm-22resistancegenes.PLoS ONE 12(1):e0170429.Doi:10.1371/journal.pone.0170429)。症状似乎基于受影响的品种而不同，并且在某些情况下，症状主要出现在营养部分，表现为严重或轻微的斑驳、坏死、叶片扭曲的形式或其他症状。由于该病毒与已知的烟草花叶病毒属明显不同，因此被赋予了一个新的名称：番茄褐色皱果病毒(TBRFV)。同时，这种病毒的常用缩写是ToBRFV，因此该缩写现在也在本申请中使用。
在过去几年中，ToBRFV已迅速传播到许多国家，并对数量迅速增加的蔬菜种植地区的番茄果实生产产生了重大影响。由于果实症状的严重性，ToBRFV的存在对番茄种植者的影响非常大，因为它使果实基本上无法销售。所述病毒至少是机械传播的，这使得传播容易、迅速而且难以控制。所述病毒的传播也可能通过受感染的种子发生。
发明内容
本发明的一个目的是提供对番茄褐色皱果病毒(ToBRFV)表现出真正抗性的番茄物种的番茄植物。
本发明的另一个目的是提供导致ToBRFV抗性的基因的等位基因。
由于新的ToBRFV传播非常快的问题，并对某些地区的番茄生产产生了重大影响，因此获得抗性番茄植物的紧迫性非常高。此外，由于所述病毒非常有效的传播，预计所述病毒能够迅速传播到其他地区。因此，组织了一次大型种质筛选，以了解可能来源的存在。最初，鉴定出几种醋栗番茄(Solanum pimpinellifolium)物种的抗性材料，并通过对这些来源和番茄品系之间的种群进行精细定位和表型分析，发现了6号、11号和12号染色体上的QTL，如共同未决申请WO2019110130和WO2019110821中所述。这些QTL在番茄中的渐渗导致了有用的表型抗性水平，但在实验室实验中发现，病毒滴度仍然相对较高，这表明所述病毒仍然可以在植物中复制。
因此，对于所使用的醋栗番茄来源之一GNL.3951，通过将其与内部育种品系相结合来开发进一步的种群以进行额外的QTL定位，以获得基于限制病毒复制的具有更强真正抗性的植物。对所有世代的植物进行生物测定，但也进行qPCR分析以确定所述植物中病毒滴度的存在和水平(实施例2)。
通过分子标志物鉴定和表征QTL提供了使用遗传连锁标志物来鉴定QTL的存在并因此鉴定抗性的存在的机会，这显然比结合qPCR分析使用生物测定更有效。为了这个目的，对F2种群、回交和F1与来源的杂交体进行了新的QTL定位研究。这些观察导致在8号染色体上鉴定出一个新的QTL区域(实施例1)。
本发明提供对番茄褐色皱果病毒(ToBRFV)具有抗性的番茄植物，所述植物包含QTL，所述QTL包含限制病毒在植物中复制的8号染色体上的基因的等位基因。所述8号染色体上的基因的等位基因特别是源自或渗入醋栗番茄物种的基因的等位基因。
鉴定的在8号染色体上的第一个QTL区域位于SEQ ID No.1和SEQ ID No.42之间。该QTL在8号染色体上的存在可以通过选自SEQ ID No.1至42中所示SNP的遗传连锁标志物来鉴定，优选通过选自SEQ ID No.3、SEQ ID No.4、SEQ ID No.14、SEQ ID No.16、SEQ IDNo.17、SEQ ID No.18、SEQ ID No.19、SEQ ID No.24、SEQ ID No.25、SEQ ID No.26、SEQ IDNo.27、SEQ ID No.28、SEQ IDNo.29、SEQ ID No.30、SEQ ID No.34和SEQ ID No.42中所示的SNP的标志物来鉴定。确定了QTL与选自SEQ ID No.26、SEQ ID No.29和SEQ ID No.30中所示的SNP的标志物紧密连锁。用于鉴定QTL的遗传连锁标志物是图1中列出的QTL中存在的任何一个序列表示的标志物。
对8号染色体上最初鉴定的QTL区域进行进一步精细定位，以确定QTL中赋予抗性的基因的位置。第一次精细定位操作产生了较小的QTL区域，其位于SEQ ID No.22和SEQ IDNo.34之间。这个较小的QTL区域包含7个基因。来自第一次定位的五个标志物，包括被确定为高度连锁的三个标志物，出现在那些基因中的一个基因(Tom2a基因)的序列中，表明与ToBRFV易感参考基因组(版本SL3_00)相比，Tom2a中存在多态性。由于该基因中存在最佳连锁标志物，Tom2a似乎是本发明的ToBRFV抗性的最可能候选基因。对该基因进行测序，并随后与公开的参考基因组进行比对，结果确定了另外两种多态性。参考基因组序列SL3_00和Tom2a的抗性序列之间的多态性可以通过SEQ ID No.26、SEQ ID No.27、SEQ ID No.28、SEQID No.29、SEQ ID No.30、SEQ ID No.43或SEQ ID No.44所示的任何一种标志物来鉴定。Tom2a的抗性序列构成本发明的等位基因。
进行了进一步的研究和观察，以确认Tom2a基因参与ToBRFV抗性。在这个过程中，培育QTL区域内有重组的种群。通过这些重组品系的标志物分析和表型分析，排除了QTL区域中存在的其他基因是ToBRFV抗性的潜在贡献者，并且可以确认Tom2a基因是本发明的ToBRFV抗性的因果基因(实施例4；图4)。
本发明涉及在8号染色体上包含QTL的番茄植物，所述QTL包含赋予抗性的Tom2a等位基因，其中8号染色体上QTL的存在与至少一种选自SEQ ID No.1至44中所示的SNP的标志物遗传连锁，优选选自SEQ ID No.3、SEQ ID No.4、SEQ ID No.14、SEQ ID No.16、SEQ IDNo.17、SEQ ID No.18、SEQ ID No.19、SEQ ID No.24、SEQ ID No.25、SEQ ID No.26、SEQ IDNo.27、SEQ ID No.28、SEQ IDNo.29、SEQ ID No.30、SEQ ID No.34、SEQ ID No.42、SEQ IDNo.43和SEQ ID No.44中所示的SNP的标志物，最优选选自SEQ ID No.26、SEQ ID No.27、SEQ ID No.28、SEQ ID No.29、SEQ ID No.30、SEQ ID No.43和SEQ ID No.44的标志物。
本发明提供了在番茄的8号染色体上赋予抗性的Tom2a等位基因，所述赋予抗性的Tom2a等位基因包含SEQ ID No.45，或包含与SEQ ID No.45具有至少70％序列同一性的同源Tom2a序列。在番茄植物中所述赋予抗性的Tom2a等位基因或同源Tom2a序列的存在导致ToBRFV抗性。SEQ ID No.45显示了赋予抗性的Tom2a等位基因的编码序列(CDS)。如本文所用，赋予抗性的Tom2a等位基因是导致ToBRFV抗性的Tom2a基因的一个版本。
SEQ ID No.45编码包含SEQ ID No.46的蛋白质。本发明涉及包含SEQ ID No.46的Tom2a蛋白，或包含与SEQ ID No.46具有至少70％序列同一性的同源Tom2a蛋白，所述蛋白导致ToBRFV抗性。
Tom2a基因的野生型序列包含SEQ ID No.47，并编码包含SEQ ID No.48的蛋白质。该基因的基因组序列中的多态性可用于鉴定赋予抗性的Tom2a基因的等位基因的存在，所述基因包含SEQ ID No.26、SEQ ID No.27、SEQ ID No.28、SEQ ID No.29、SEQ ID No.30、SEQ ID No.43或SEQ ID No.44的序列中所示的SNP。通过使用这些SNP中的任何一个作为标志物，通过确定SNP的存在，可以鉴定赋予抗性的Tom2a等位基因。
同源Tom2a基因包含同源序列，所述序列是与SEQ ID No.45具有至少70％序列同一性的序列，优选具有至少75％、77％、80％、83％、85％、87％、90％、93％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性。同源Tom2a蛋白包含同源序列，所述序列是与SEQ ID No.46具有至少70％序列同一性的序列，优选具有至少75％、77％、80％、83％、85％、87％、90％、93％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性。
在一个实施方案中，赋予抗性的同源Tom2a等位基因保留了可通SEQ ID No.26或通过SEQ ID No.28或通过SEQ ID No.43或通过SEQ ID No.44鉴定的多态性。在一个实施方案中，赋予抗性的Tom2a等位基因或其同源等位基因保留了可通过SEQ ID No.26和SEQIDNo.28；SEQ ID No.26和SEQ ID No.43；SEQ ID No.26和SEQ ID No.44；SEQ ID No.28和SEQ ID No.43；SEQ ID No.28和SEQ ID No.44；SEQ ID No.43和SEQ ID No.44；SEQ IDNo.26和SEQ ID No.28和SEQ ID No.43；SEQ ID No.26和SEQ ID No.28和SEQ ID No.44；SEQ ID No.26和SEQ ID No.43和SEQ ID No.44；SEQ ID No.28和SEQ ID No.43和SEQ IDNo.44；或SEQ ID No.26和SEQ ID No.28和SEQ ID No.43和SEQ ID No.44鉴定的多态性组合。
由于所述基因存在于公开的基因组中的负链上，SEQ ID No.26鉴定了SEQ IDNo.47的位置559上的A至G转换；SEQ ID No.28鉴定了SEQ ID No.47的位置312-314上的GGC缺失；SEQ ID No.43鉴定了SEQ ID No.47的位置673上的G至A转换，以及SEQ ID No.44鉴定了SEQ ID No.47的位置844上的A至G转换。
在一个实施方案中，赋予抗性的同源Tom2a等位基因保留了SEQ ID No.47的位置559上的A至G转换；SEQ ID No.47的位置312-314上的GGC缺失；SEQ ID No.47的位置673上的G至A转换，SEQ IDNo.47的位置844上的A至G转换中的至少一种或同源Tom2a基因的对应位置上的任何那些多态性。在一个进一步的实施方案中，赋予抗性的同源Tom2a等位基因保留了这些多态性中的两种、三种或全部四种的组合。图5单独地以及以比对的方式显示了Tom2a野生型和赋予抗性的Tom2a等位基因的CDS序列。
在一个实施方案中，所述同源Tom2a等位基因序列编码蛋白质，所述蛋白质包含SEQ ID No.48的位置105上的A缺失、SEQ ID No.48的位置187上至G的转换、SEQ ID No.48的位置225上至S的转换或SEQ ID No.48的位置282上至A的转换中的至少一种。
在一个实施方案中，由赋予抗性的Tom2a等位基因编码的蛋白质或其同源蛋白质保留了SEQ ID No.48的位置105上的Ala缺失、SEQ ID No.48的位置187上的Arg至Gly置换、SEQ ID No.48的位置225上的Gly至Ser置换或SEQ ID No.48的位置282上的Thr至Ala置换，或同源蛋白质的对应位置上的修饰。在一个实施方案中，由赋予抗性的Tom2a等位基因编码的蛋白质保留了这些多态性中的两种、三种或全部四种的组合。图6单独地以及以比对的方式显示了野生型的Tom2a蛋白质序列和赋予抗性的Tom2a等位基因。
如本文所用，序列同一性是两个序列在正确比对后两个序列之间相同的核苷酸或氨基酸的百分比。本领域技术人员知道如何比对序列，例如通过使用序列比对工具，例如
其可用于核苷酸序列和蛋白质序列。为了获得最显著的结果，应获得给出最高序列同一性评分的最佳可能比对。通过比较评估中最短序列的长度来计算序列同一性百分比，由此在本案例中，序列表示至少包含起始密码子和终止密码子的基因，或由这种基因编码的完整蛋白质。
所述Tom2a蛋白是一种四次穿膜蛋白，它是一种具有四次穿膜蛋白/外周蛋白结构域的蛋白质。所述蛋白质包含N端和C端尾部，和四个跨膜结构域，所述跨膜结构域通过两个非细胞质环和一个非常短的细胞质环连接(图8)。所观察到的突变存在于第二跨膜结构域(TM2)的末端，特别是位置105的Ala缺失，以及存在于所述蛋白质的C端尾部。位置105上的Ala缺失影响TM2结构域，也可能对其后面的短细胞质环产生影响。本发明涉及Tom2a基因中对TM2结构域有影响的突变，或对细胞质环有影响的突变，或对所述蛋白质C端尾部有影响的突变，或所述突变的组合。
在一个实施方案中，赋予抗性的Tom2a等位基因编码非功能性蛋白质。
图1提供了可用作标志物或用于开发标志物的SEQ ID No.序列，以鉴定导致番茄植物中ToBRFV抗性的在8号染色体上包含本发明Tom2a基因的等位基因的QTL的存在。表4显示了鉴定QTL的存在的序列中的核苷酸，并且因此鉴定抗性植物，以及SNP在图1序列中的位置。如本文所用，某个SEQ ID No.中的“所示的SNP”是序列中指示抗性的核苷酸，如表4的“图1中SNP的核苷酸，用作本发明的标志物”列所示。当标志物的序列定位在可公开获得的番茄基因组参考序列的SL3_00版本上时，可以溯源到所述标志物序列中SNP多态性对应的物理位置。该位置也在表4中示出。公开的番茄基因组参考序列的SL3_00版本可以例如在Solgenomics网站(solgenomis.net)上访问，并且是本文中使用的“公开的番茄基因组”的参考。本发明的标志物的位置源自公开的图谱，并且这些位置与所述物理位置相关。
通过使用标志物来鉴定QTL或赋予抗性的Tom2a等位基因的存在特别是通过鉴定标志物序列中SNP位置处表示抗性的核苷酸的存在来完成的。野生型核苷酸是存在于公开的基因组中该位置的核苷酸。
如本文所用，番茄植物是番茄物种的植物。
如本文所用，对番茄褐色皱果病毒的抗性是对Salem等人(2016，同上)中所述的病毒的抗性，该病毒被分类为NCBI分类ID 1761477。
如本文所用，当标志物和ToBRFV抗性在由包含本发明的QTL的植物和缺乏QTL的植物之间的杂交产生的分离种群中共分离时，标志物与包含本发明的Tom2a基因的等位基因的QTL遗传连锁，并因此可用于鉴定所述QTL。与QTL遗传连锁的标志物可用于鉴定该QTL，因为所述QTL中存在连锁标志物。本发明的赋予抗性的Tom2a等位基因中存在的标志物是完全连锁的，并且因此直接表示赋予抗性的所述基因的等位基因的存在。
本发明的ToBRFV抗性以隐性方式遗传。这意味着，当本发明的Tom2a基因的等位基因纯合地存在时，与不存在本发明的等位基因或杂合地存在本发明的等位基因的植物相比，植物中的病毒复制不存在或极大减少。然而，杂合植物可以用于通过杂交和选择培育纯合植物，因此杂合植物也构成本发明的一部分。
如实施例2所述，通过qPCR测试适当地确定病毒复制，从而确定本发明的ToBRFV抗性。所述抗性的证实可以通过生物测定来确定，例如使用烟草花叶病毒属的标准汁液机械接种技术，所述技术是本领域技术人员已知的，并且也例如Luria等人(2017，同上)所述。
为了确定抗性表型，将待测材料的种子播种在标准育苗盘中，并在播种后4周接种至少10株幼苗。通过将感染了ToBRFV的番茄植物的叶片在0.01M磷酸盐缓冲液(pH 7.0)中与硅藻土混合研磨来制备接种物。然后，在用接种物轻轻摩擦叶片之前，在幼苗上撒上金刚砂粉末。抗性按照0-5的等级评分；评分等级的描述可以在表3中找到。在接种后14-21天(dai)进行生物测定观察番茄幼苗的症状。
通过与已知对ToBRFV易感的对照品种进行比较来确定ToBRFV的抗性。ToBRFV易感番茄品种的实例是Livento F1和Adventure F1，它们在8号染色体上不具有本发明的赋予抗性的Tom2a等位基因，用作易感对照。由于在本发明完成之前没有已知具有本发明的ToBRFV抗性的番茄品种，因此不可能包括在本发明完成之前已知的抗性对照。然而，作为抗性对照，可以使用从保藏为NCIMB 43637的种子生长的植物；从该保藏生长的植物包含在8号染色体上的本发明的赋予抗性的Tom2a等位基因。所述测试是对特定品系的10株植物进行的，并且取平均分。当易感(S)对照的平均分高于3.0，优选地高于3.5时，所述测试是正确进行的。一旦达到该平均值，便是对测定进行评分的正确时刻。
表3：ToBRFV抗性评分等级
| 评分 | 症状 |
| 0 | 无症状 |
| 1 | 不光洁、单个斑点、有些轻微变色 |
| 2 | 斑驳、清晰可见的症状 |
| 3 | 严重斑驳、头部开始变形 |
| 4 | 严重斑驳、茎部坏死、头部严重变形、水泡斑点 |
| 5 | 植物死亡 |
如本文所用，当使用根据表3的评分时，在8号染色体上纯合地包含本发明的赋予抗性的Tom2a等位基因的ToBRFV抗性番茄植物的平均评分为1.5或低于1.5，优选评分低于1.0。
如本文所用，抗性意味着在感染ToBRFV的植物中病毒复制减少或不存在病毒复制。病毒复制的减少可以通过qPCR测试来测量。为了确定品系是否具有ToBRFV病毒复制的减少或不存在病毒复制，在取自该品系的至少5株受ToBRFV感染的植物的叶片样品中测定病毒滴度。从每株植物中取直径为6mm的叶片打孔样品，然后在500μl PBS缓冲溶液中研磨。将50μl所得悬浮液用于96孔KingFisher Flex分离实验方案，从而使用innuPREP DNA/RNA病毒PLUS试剂盒进行叶片材料的分离。然后在96CFX qPCR热循环仪(Biorad)中分析样品，以获得Cq_ToBRFV值，该值代表获得病毒PCR产物所需的循环次数，使用的程序为50℃下5分钟，95℃下20秒，然后按95℃下10秒，60℃下60秒进行40个循环。
为了能够比较不同大小和背景的样品的值，番茄PHD参考基因(一种番茄管家基因)被包括在qPCR测定中，所述基因校正样品材料量的任何变化，然后产生Cq_PHD值。表1中给出了测定中使用的引物。表2中给出了测定中使用的PCR体积。
表1：用于qPCR测定的ToBRFV和PHD引物
| 引物 | 序列 |
| TBFRV FW 3(SEQ ID No.49) | GTACATCTTGCTGGTCTTGT |
| TBFRV RV 3(SEQ ID No.50) | CGCTCTCTCCATTCTCTTATC |
| TBFRV P3(SEQ ID No.51) | FAM-TGGTGGTGTCAGTGTCTGTTTGGT-BHQ1 |
| PHD FW1(SEQ ID No.52) | TACCAACTCTTCCTCCCATAG |
| PHD RV1(SEQ ID No.53) | TGGATCGCACTGTGAGTA |
| PHD P1(SEQ ID No.54) | TxR 5'-TTCAAAGACTTCTCCGCCCGTCAC-3'BHQ2 |
表2：qPCR测定体积
为了准确地确定病毒滴度的最终值，使用delta-delta Ct方法，PHD作为管家基因，ToBRFV作为目的基因。最终值为Cq_corr，计算为Cq_ToBRFV–Cq_PHD。当至少5株植物样品的平均Cq_corr高于-11.00时，或者当平均Cq-corr比易感对照的平均Cq_corr高至少5.00时，确定植物具有ToBRFV病毒复制的减少(实施例2，表5)。
在一个实施方案中，包含如本文所定义的在8号染色体上的本发明的赋予抗性的Tom2a等位基因的本发明的抗性植物按优选增加的顺序具有高于-11.00、-10.50、-10.00、-9.50、-9.00、-8.50、-8.00、-7.50或-7.00的平均Cq_corr得分。
在一个实施方案中，包含如本文所定义的在8号染色体上的本发明的赋予抗性的Tom2a等位基因的本发明的抗性植物按优选增加的顺序具有比易感对照的平均值高至少5.00、5.50、6.00、6.50、7.00、7.50、8.00的平均Cq_corr得分。
上述平均值的计算优选地作为取自至少2次试验的平均值进行。当测试中的易感对照的平均Cq_corr值为-12或更低，优选为-13或更低，最优选为-14或更低时，植物适当感染ToBRFV。
可以从以NCIMB 43637保藏的种子生长具有本发明的赋予抗性的Tom2a等位基因的番茄植物，所述等位基因导致ToBRFV抗性。
NCIMB 43637具有本发明的ToBRFV抗性，并且在8号染色体上包含本发明的位于SEQ ID No.1和42之间的QTL，所述QTL包含具有SEQ ID No.45的赋予抗性的Tom2a等位基因。所述QTL，以及因此赋予抗性的Tom2a等位基因，以纯合形式存在于保藏物NCIMB 43637中。NCIMB 43637中的QTL与SEQ ID No.1至44中所示的SNP代表的标志物中的任何一个连锁，因此可以通过SEQ IDNo.1至44中所示的SNP代表的标志物中的任何一个来鉴定。NCIMB43637中赋予抗性的Tom2a等位基因包含SEQ ID No.26、SEQ ID No.27、SEQ ID No.28、SEQID No.29、SEQ ID No.30、SEQ ID No.43和SEQ ID No.44中所示的多态性。赋予抗性的Tom2a等位基因特别可以通过确定SEQ ID No.26、SEQ ID No.28、SEQ ID No.43或SEQ IDNo.44中所示的SNP的存在来鉴定。
在ToBRFV生物测定或qPCR测试中，在8号染色体上包含本发明的赋予抗性的Tom2a等位基因的植物可以用作抗性对照品种。当待评估的植物、品系或种群表现出与NCIMB43637相同的抗性，并且该植物、品系或种群包含本文所述的在8号染色体上的赋予抗性的Tom2a等位基因时，该植物、品系或种群被认为具有本发明的ToBRFV抗性，并因此是本发明的植物。
本发明的植物任选地是栽培的番茄植物，所述番茄植物具有使其适合商业栽培的改善的农艺特性。因此，所述植物是农业上的优良植物。
在一个实施方案中，本发明的ToBRFV抗性番茄植物不需要赋予抗性的Tm-1基因的等位基因。在一个实施方案中，本发明的ToBRFV抗性番茄植物不需要赋予抗性的TOM1基因或TOM3基因。本发明的包含赋予抗性的Tom2a等位基因的ToBRFV抗性番茄植物不需要赋予烟草抗性的Tm-1基因、TOM1基因或TOM3基因的存在来显示抗性。
在一个实施方案中，本发明的ToBRFV抗性番茄植物包含赋予抗性的Tom2a等位基因和11号染色体上赋予抗性的QTL，如共同未决申请WO2019110821中所述。所述11号染色体上赋予抗性的QTL特别地包含赋予抗性的CCA基因或赋予抗性的Albino3样基因，其分别在WO2021110855和共同未决申请PCT/EP2021/055008中描述。这些QTL的组合，特别是赋予抗性的Tom2a等位基因与所述基因中的任一个的组合，导致番茄对ToBRFV的抗性更强和更持久。
本发明还涉及从本发明的植物收获的番茄果实，其中所述番茄果实在其基因组中包含本发明的赋予抗性的Tom2a等位基因，所述基因导致植物中的ToBRFV抗性。这种番茄果实在本文中也称为“本发明的果实”或“本发明的番茄果实”。如本文所用，“番茄果实”是由番茄物种植物结出的果实。
本发明涉及一种产生ToBRFV抗性的番茄植物的方法，所述方法包括在缺乏所述QTL的番茄植物的8号染色体上引入包含赋予抗性的Tom2a等位基因的QTL，其中所述QTL区域位于SEQ ID No.1和SEQ ID No.42之间，并且与选自SEQ ID No.1至44中所示SNP的任何标志物连锁，优选与选自SEQ ID No.3、SEQ ID No.4、SEQ IDNo.14、SEQ ID No.16、SEQ IDNo.17、SEQ ID No.18、SEQ ID No.19、SEQ ID No.24、SEQ ID No.25、SEQ ID No.26、SEQ IDNo.27、SEQ ID No.28、SEQ ID No.29、SEQ ID No.30、SEQ ID No.34、SEQ ID No.42、SEQ IDNo.43和SEQ ID No.44中所示的SNP的标志物连锁，最优选与选自SEQ ID No.26、SEQ IDNo.27、SEQ ID No.28、SEQ ID No.29、SEQ ID No.30、SEQ ID No.43和SEQ ID No.44中所示的SNP的标志物连锁。
本发明涉及一种产生ToBRFV抗性番茄植物的方法，所述方法包括在缺乏所述等位基因的番茄植物中引入本文所述的赋予抗性的Tom2a等位基因。
当植物性相容时，本发明的赋予抗性的Tom2a等位基因可以通过通常使用的育种技术(例如杂交和选择)从另一种包含赋予抗性的Tom2a等位基因的植物中引入。这样的引入可以来自通常可以容易地杂交的相同物种的植物，或来自相关物种的植物。杂交的困难可以通过本领域已知的技术来克服，例如胚胎拯救，或者可以应用同源转基因。如本文所述的适当标志物用于跟踪赋予抗性的Tom2a等位基因掺入另一植物。
上述方法尤其可用于将本发明的赋予抗性的Tom2a等位基因引入适合掺入这种遗传信息的植物物种中。在一个特定的实施方案中，所述赋予抗性的Tom2a等位基因可以从包含赋予抗性的Tom2a等位基因的醋栗番茄植物，或从与番茄性相容的另一茄属物种引入到缺乏赋予抗性的Tom2a等位基因的番茄植物中，例如通过使用包括杂交和选择的标准育种方法。在另一个实施方案中，所述赋予抗性的Tom2a等位基因可以使用标准育种方法从包含赋予抗性的Tom2a等位基因的番茄植物引入到缺乏赋予抗性的Tom2a等位基因的番茄植物中。
在8号染色体上赋予抗性的Tom2a等位基因可以从番茄植物的代表性种子(其以保藏号NCIMB 43637保藏在NCIMB中)、或从NCIMB 43637保藏的种子、或从该保藏物的后代(其有性或营养子代)引入。在番茄的8号染色体上引入赋予抗性的Tom2a等位基因导致ToBRFV抗性。
可替代地，本发明的赋予抗性的Tom2a等位基因可以从另一种性不相容的植物转移或引入(例如通过使用转基因方法)。可以适当使用的技术包含本领域技术人员已知的一般植物转化技术，例如使用农杆菌介导的转化方法。基因组编辑方法，例如使用CRISPR/Cas系统，也可以用于获得本发明的植物，例如通过编辑内源性易感Tom2a基因以将其修饰成赋予抗性的Tom2a等位基因。易感的Tom2a基因特别地可以被靶向以诱导突变，所述突变导致SEQ ID No.48的位置105上的Ala缺失、SEQ ID No.48的位置187上的Arg至Gly转换、SEQ IDNo.48的位置225上的Gly至Ser转换、或SEQ ID No.48的位置282上的Thr至Ala转换，或在同源蛋白质的对应位置上的任何那些修饰。产生那些修饰的组合的靶向修饰也构成本发明的一部分。可进一步编辑易感Tom2a基因以获得非功能性Tom2a蛋白，这是本发明的一部分。
本发明还涉及包含本发明的赋予抗性的Tom2a等位基因的本发明的植物，所述等位基因纯合地或杂合地导致ToBRFV抗性。所述植物是自交系、杂交体、双单倍体或分离群体的植物。优选地，本发明的植物是非转基因植物。
本发明还涉及在8号染色体上包含本发明的赋予抗性的Tom2a等位基因的番茄种子，其中从所述种子生长的植物是本发明的植物。在一个优选的实施方案中，本发明赋予抗性的Tom2a等位基因纯合地存在于种子中，并且从所述种子生长的植物是抗ToBRFV的。本发明还涉及由本发明的植物产生的种子，其中所述种子含有本发明的赋予抗性的Tom2a等位基因，因此，从所述种子生长的植物是本发明的植物。本发明还涉及通过将所述种子生长成植物而将所述种子用于产生本发明的植物的用途。本发明还涉及包含果实或种子的本发明的植物的植物部分，其中所述植物部分在其基因组中的8号染色体上包含本发明的赋予抗性的Tom2a等位基因。
此外，本发明还涉及包含本发明的番茄果实或其部分的食品或加工食品。所述食品可能已经经历了一个或多个加工步骤。这种加工步骤可以包括但不限于以下处理中的任何一种或其组合：去皮、切割、洗涤、榨汁、烹饪、冷却或包含本发明果实的沙拉混合物。所获得的加工形式也是本发明的一部分。
本发明还涉及适合用于产生本发明的番茄植物的繁殖材料，其中所述繁殖材料适合用于有性繁殖，并且特别地选自小孢子、花粉、子房、胚珠、胚囊和卵细胞；或者所述繁殖材料适合用于营养繁殖，并且特别地选自插枝、根、茎、细胞、原生质体；或者所述繁殖材料适合用于再生细胞的组织培养，并且特别地选自叶、花粉、胚、子叶、下胚轴、分生组织细胞、根、根尖、花药、花、种子和茎；其中由所述繁殖材料产生的植物包含如本文所定义的在8号染色体上的本发明的赋予抗性的Tom2a等位基因，所述基因赋予ToBRFV抗性。本发明的植物可用作繁殖材料的来源。
本发明进一步涉及包含如本文所定义的本发明的赋予抗性的Tom2a等位基因的细胞。本发明的细胞可以从本发明的植物中获得或存在于本发明的植物中。这样的细胞可以是分离的形式，或者是完整植物的部分，或者来自其部分，并且仍然构成本发明的细胞，因为这样的细胞包含遗传信息，所述遗传信息决定了如本文所述的赋予抗性的Tom2a等位基因，所述基因导致栽培的番茄植物的ToBRFV抗性。本发明的植物的每个细胞都携带导致ToBRFV抗性的遗传信息。本发明的细胞也可以是可再生成本发明的新植物的再生细胞。在这种情形下，遗传信息的存在是在8号染色体上本发明的赋予抗性的Tom2a等位基因的存在，其中赋予抗性的Tom2a等位基因如本文所定义。
本发明进一步涉及本发明的植物的植物组织，所述组织包含如本文所定义的在8号染色体上的本发明的赋予抗性的Tom2a等位基因。所述组织可以是未分化的组织或已经分化的组织。未分化的组织是例如茎尖、花药、花瓣或花粉，并且可以用于微体繁殖以获得生长成本发明的新植物的小植株。所述组织也可以从本发明的细胞生长。
本发明还涉及本发明的植物、细胞、组织或种子的后代，所述后代包含如本文所定义的在8号染色体上的本发明的赋予抗性的Tom2a等位基因，所述赋予抗性的Tom2a等位基因的存在(优选地以纯合形式存在)导致ToBRFV抗性。这样的后代本身可以是植物、插枝、种子、细胞或组织。
如本文所用，“后代”意指与本发明的植物杂交产生的第一代和所有其他后代，例如F1、F2或其他代，其中杂交包括与自身杂交或与另一植物杂交，并且其中被确定为后代的子代包含如本文所定义的在8号染色体上的本发明的赋予抗性的Tom2a等位基因，所述基因导致对ToBRFV的抗性。在该杂交中使用的本发明的植物任选地是从保藏物NCIMB 43637的种子或从其后代种子生长的植物，所述后代种子是通过将从保藏的种子生长的植物与其自身或与另一植物杂交一代或多代而产生的直接或进一步子代，其中所述后代种子保留了在8号染色体上的本发明的赋予抗性的Tom2a等位基因。
后代还包括携带在8号染色体上的本发明的赋予抗性的Tom2a等位基因并且抗ToBRFV的番茄植物，并且其通过营养繁殖或另一种形式的繁殖从本发明的植物或植物的后代获得。
本发明进一步涉及本发明的番茄植物的适合有性生殖的部分，该植物部分包含在8号染色体上的本发明的赋予抗性的Tom2a等位基因，所述赋予抗性的Tom2a等位基因如本文所定义。这样的部分例如选自小孢子、花粉、子房、胚珠、胚囊和卵细胞。
此外，本发明涉及本发明的番茄植物的适合营养繁殖的部分，该植物部分特别是包含在8号染色体上的本发明的赋予抗性的Tom2a等位基因的插枝、根、茎、细胞或原生质体，所述赋予抗性的Tom2a如本文所定义。如前所述的植物的部分被认为是繁殖材料。由繁殖材料产生的植物包含如本文所定义的在8号染色体上的本发明的赋予抗性的Tom2a等位基因，所述赋予抗性的Tom2a等位基因的存在导致ToBRFV抗性。
本发明进一步涉及本发明的植物的组织培养物，该组织培养物也是繁殖材料，并且在其基因组中在8号染色体上包含本发明的赋予抗性的Tom2a等位基因，所述赋予抗性的Tom2a等位基因如本文所定义。所述组织培养物包含再生细胞。这样的组织培养物可以选自或来源于植物的任何部分，特别是来自叶、花粉、胚、子叶、下胚轴、分生组织细胞、根、根尖、花药、花、种子或茎。所述组织培养物可再生为包含如本文所定义的在8号染色体上的本发明的赋予抗性的Tom2a等位基因的番茄植物，其中所述再生的番茄植物表达ToBRFV抗性并且也是本发明的一部分。
本发明还涉及本发明的植物在植物育种中的用途。因此，本发明还涉及用于培育抗ToBRFV的栽培番茄植物的育种方法，其中包含如本文所定义的在8号染色体上的本发明的赋予抗性的Tom2a等位基因的植物用于赋予另一植物所述抗性。可用于植物育种以开发另一种具有ToBRFV抗性的植物的代表性种子以保藏号NCIMB 43637保藏于NCIMB。
本发明还涉及在8号染色体上的本发明的QTL用于培育对ToBRFV具有抗性的番茄植物的用途，特别是如本文所定义的赋予抗性的Tom2a等位基因用于培育对ToBRFV具有抗性的番茄植物的用途。
本发明还涉及一种用于鉴定番茄植物、或醋栗番茄植物、或与番茄性相容的另一茄属物种植物中ToBRFV抗性的标志物，所述标志物选自SEQ ID No.1至44中所示的SNP，优选选自SEQ ID No.26、SEQ ID No.27、SEQ ID No.28、SEQ ID No.29、SEQ ID No.30、SEQ IDNo.43和SEQ ID No.44中所示的SNP，最优选选自SEQ ID No.26、SEQ ID No.28、SEQ IDNo.43和SEQ ID No.44中所示的SNP。基于SEQ ID No.1和SEQ ID No.42之间如上定义的区域中的多态性，特别是基于与SEQ ID No.47相比的多态性而开发的任何其他标志物也是本发明的一部分。
选自SEQ ID No.1至44中所示的SNP的任何标志物，优选选自SEQ ID No.26、SEQID No.27、SEQ ID No.28、SEQ ID No.29、SEQ ID No.30、SEQ ID No.43和SEQ ID No.44中所示的SNP，最优选选自SEQ ID No.26、SEQ ID No.28、SEQ ID No.43和SEQ ID No.44中所示的SNP的标志物用于鉴定番茄植物、或醋栗番茄植物、或与番茄性相容的另一茄属物种植物中的ToBRFV抗性的用途也是本发明的一部分。这些标志物用来开发用于鉴定在8号染色体上的QTL，特别是用于鉴定导致ToBRFV抗性的赋予抗性的Tom2a等位基因，包括确定SEQID No.22和34之间的区域中的任何其他多态性的其他标志物的任何用途也是本发明的一部分。
本发明还涉及一种用于选择ToBRFV抗性的番茄植物、或ToBRFV抗性的醋栗番茄植物、或与番茄性相容的另一茄属物种的ToBRFV抗性植物的方法，所述方法包括鉴定在8号染色体上本发明的赋予抗性的Tom2a等位基因的存在，以及选择包含所述赋予抗性的Tom2a等位基因的植物作为ToBRFV抗性植物。
使用选自SEQ ID No.1至44中所示的SNP的标志物中的至少一种，优选选自SEQ IDNo.26、SEQ ID No.27、SEQ ID No.28、SEQ ID No.29、SEQ ID No.30、SEQ ID No.43和SEQID No.44中所示的SNP，最优选选自SEQ ID No.26、SEQ ID No.28、SEQ ID No.43和SEQ IDNo.44中所示的SNP的标志物来适当地鉴定在8号染色体上本发明的赋予抗性的Tom2a等位基因的存在。
本发明还涉及测试番茄植物、醋栗番茄植物、或与番茄性相容的另一茄属物种植物中赋予ToBRFV抗性的本发明的赋予抗性的Tom2a等位基因的存在的方法，所述方法包括在所述植物的基因组中检测选自SEQ ID No.1至44中所示的SNP的标志物序列的存在，优选选自SEQ ID No.26、SEQ ID No.27、SEQ ID No.28、SEQ ID No.29、SEQ ID No.30、SEQ IDNo.43和SEQ ID No.44中所示的SNP，最优选选自SEQ ID No.26、SEQ ID No.28、SEQ IDNo.43和SEQ IDNo.44中所示的SNP的标志物。
所述测试番茄植物、醋栗番茄植物、或与番茄性相容的另一茄属物种植物中赋予ToBRFV抗性的本发明的赋予抗性的Tom2a等位基因的存在的方法任选地进一步包括选择包含所述赋予抗性的Tom2a等位基因的番茄植物、醋栗番茄植物、或与番茄性相容的另一茄属物种植物作为ToBRFV抗性植物。因此选择的番茄植物、醋栗番茄植物、或与番茄性相容的另一茄属物种植物随后可以用作将赋予ToBRFV抗性的Tom2a等位基因渗入缺乏赋予抗性的Tom2a等位基因的番茄植物的来源。
本发明还涉及用于产生抗ToBRFV的番茄植物的方法，所述方法包括：
a)将本发明的在8号染色体上包含本发明的赋予抗性的Tom2a等位基因的植物与另一植物杂交；
b)任选地对由杂交产生的植物进行一轮或多轮自交和/或杂交，以获得下一代种群；
c)从步骤a)的杂交产生的种群或步骤b)的下一代种群中选择包含如本文所定义的在8号染色体上的赋予抗性的Tom2a等位基因的植物，当赋予抗性的Tom2a等位基因纯合地存在时，所述植物对ToBRFV具有抗性。
本发明还涉及用于产生抗ToBRFV的番茄植物的方法，所述方法包括：
a)将在8号染色体上包含本发明的赋予抗性的Tom2a等位基因的第一亲本植物与第二亲本植物杂交，所述第二亲本植物是不包含本发明的赋予抗性的Tom2a等位基因的植物；
b)将步骤a)得到的植物与所述第二亲本植物回交至少三代；
c)从第三或更高回交种群中选择至少包含步骤a)的第一亲本植物的在8号染色体上的赋予抗性的Tom2a等位基因的植物。
包含在8号染色体上的赋予抗性的Tom2a等位基因的植物的选择通过使用与赋予抗性的Tom2a等位基因遗传连锁的分子标志物来适当地进行，所述标志物选自SEQ ID No.1至44中所示的SNP，优选选自SEQ ID No.26、SEQ ID No.27、SEQ ID No.28、SEQ ID No.29、SEQ ID No.30、SEQ ID No.43和SEQ ID No.44中所示的SNP，最优选选自SEQ ID No.26、SEQID No.28、SEQ ID No.43和SEQ ID No.44中所示的SNP的标志物，用于鉴定8号染色体上赋予抗性的Tom2a等位基因。可以备选地或另外确认植物对ToBRFV具有抗性，特别是通过进行qPCR测试以确定ToBRFV感染后植物中病毒滴度的缺失或极大降低。
在一个实施方案中，在产生抗ToBRFV的番茄植物的方法中使用的本发明的植物是从以NCIMB保藏号NCIMB 43637保藏的种子生长的植物或其后代植物。
本发明还提供了将另一种期望性状引入包含ToBRFV抗性的番茄植物的方法，包括：
a)将在8号染色体上包含赋予抗性的Tom2a等位基因的本发明的番茄植物与包含另一种期望性状的第二番茄植物杂交，以产生F1后代；
b)任选地在F1中选择包含赋予抗性的Tom2a等位基因和其他期望性状的植物；
c)将任选地选择的F1后代与任一亲本杂交以产生回交后代；
d)选择包含ToBRFV抗性和其他期望性状的回交后代；并且
e)任选地连续重复步骤c)和d)一次或多次，以产生所选的包含其他期望性状和对ToBRFV具有抗性的第四或更高回交后代。任选地进行回交直到回交后代稳定并可用作亲本系，这可以在3至10次回交后达到。
在一个实施方案中，在将其他期望性状引入包含ToBRFV抗性的番茄植物的方法中使用的本发明的植物是从以NCIMB保藏号NCIMB 43637保藏的种子生长的植物或其后代植物。
任选地，自交步骤在上述方法中的任何杂交或回交步骤之后进行。可替代地，在所述方法的任何杂交或自交步骤之后，选择导致ToBRFV抗性的在8号染色体上包含本发明的赋予抗性的Tom2a等位基因和其他期望性状的植物。所述其他期望性状可以选自但不限于以下：对细菌、真菌或病毒疾病的抗性、对昆虫或害虫的抗性、改善的发芽率、植物大小、植物类型、改善的产量、改善的保质期、对水胁迫的耐受、对盐胁迫的耐受、对热胁迫的耐受和雄性不育。本发明包括通过该方法产生的番茄植物和由此获得的番茄果实。
本发明进一步涉及通过使用组织培养或通过使用营养繁殖产生在8号染色体上包含本发明的赋予抗性的Tom2a等位基因的番茄植物的方法，其中赋予抗性的Tom2a等位基因的纯合存在导致对ToBRFV的抗性。
本发明进一步提供通过使用双单倍体产生技术产生纯合地包含本发明的赋予抗性的Tom2a等位基因并且对ToBRFV具有抗性的双单倍体品系，以产生在8号染色体上包含本发明的赋予抗性的Tom2a等位基因并且对ToBRFV具有抗性的番茄植物的方法。
本发明进一步涉及产生包含如本文所定义的在8号染色体上的本发明的赋予抗性的Tom2a等位基因的番茄植物的方法，其中所述赋予抗性的Tom2a等位基因的存在导致ToBRFV抗性，所述方法包括将包含所述赋予抗性的Tom2a等位基因的种子生长为所述番茄植物。在一个实施方案中，所述方法中使用的种子是以保藏号NCIMB 43637保藏在NCIMB中的种子或其后代种子。
本发明进一步涉及用于种子生产的方法，所述方法包括从本发明的种子生长番茄植物、允许所述植物产生带种子的番茄果实、收获所述番茄果实、并提取那些种子。种子的产生适当地通过与自身杂交或与另一植物杂交来进行，所述另一植物任选地也是本发明的植物。如此产生的种子具有生长成包含本发明的赋予抗性的Tom2a等位基因的植物的能力。在用于种子生产的植物的优选实施方案中，赋予抗性的Tom2a等位基因纯合地存在。
本发明进一步涉及杂交种子和产生所述杂交种子的方法，包括将第一亲本植物与第二亲本植物杂交并收获所得杂交种子，其中所述第一亲本植物和/或第二亲本植物是包含如本文所定义的在8号染色体上的本发明的赋予抗性的Tom2a等位基因的本发明的植物。所得到的杂交种子和可以从所述杂交种子生长的杂交植物也是本发明的一部分。在优选的实施方案中，亲本植物两者均包含本发明的赋予抗性的Tom2a等位基因，并且所述杂交种子纯合地包含本发明的赋予抗性的Tom2a等位基因。
如本文所用在8号染色体上的本发明的赋予抗性的Tom2a等位基因的渐渗包括通过标准育种技术从包含所述赋予抗性的Tom2a等位基因的供体植物将赋予抗性的Tom2a等位基因引入不携带所述赋予抗性的Tom2a等位基因或杂合地携带所述赋予抗性的Tom2a等位基因的受体植物。可以使用育种方法，例如杂交和选择、回交、重组选择，或导致遗传序列从抗性植物转移到易感植物的其他育种方法。包含本发明的赋予抗性的Tom2a等位基因的植物的选择可以通过进行qPCR测试来进行，或通过观察对ToBRFV的抗性的生物测定来进行，或者可以使用如本文所定义的标志物、通过标志物辅助育种或这些选择方法的组合进行选择，优选选自SEQ ID No.1至44中所示的SNP的标志物，优选选自SEQ ID No.26、SEQ IDNo.27、SEQ ID No.28、SEQ ID No.29、SEQ ID No.30、SEQ ID No.43和SEQ ID No.44中所示的SNP的标志物，最优选选自SEQ ID No.26、SEQ ID No.28、SEQ ID No.43和SEQ ID No.44中所示的SNP的标志物。所述供体植物可以是番茄植物、醋栗番茄植物、或与番茄性相容的另一茄属物种植物。从受体植物和供体植物之间的初始杂交的F1代或任何进一步后代中开始选择，然后与自身或与另一植物进行进一步杂交，适当地使用本文所鉴定和定义的标志物。
本发明将在以下实施例中进一步说明，并且实施例仅用于说明目的。实施例不意味着以任何方式限制本发明。在实施例和应用中，参考了以下附图。
附图说明
图1-SEQ ID No.1至44的核苷酸序列，包括表示ToBRFV抗性的SNP。
图2-基于qPCR观察的易感品系、抗性供体和F2种群中病毒滴度的变化。
图3-保藏物的qPCR结果。
图4-通过标志物分析结合重组品系表型分析鉴定Tom2a作为ToBRFV抗性的因果基因。
图5-CDS序列Tom2a基因SEQ ID No.45：GNL_R(抗性)，来自GNL.3951的赋予抗性的等位基因，如NCIMB 43637中所示；SEQ IDNo.47：参考基因组SL3_00(易感)；单独地以及以比对的方式。
图6-Tom2a蛋白质序列SEQ ID No.46：由赋予抗性的Tom2a等位基因编码的蛋白质；SEQ ID No.48：野生型蛋白质，易感；由SL3_00的参考序列编码；单独地以及以比对的方式。
图7-平均qPCR结果显示了具有在杂交培育的等基因品系中用作易感亲本的品系的易感野生型的植物的病毒滴度(Cq_corr)，并且这些等基因品系的植物在chr 11上具有QTL，在chr 8上具有包含本发明的赋予抗性的Tom2a等位基因的QTL，具有chr 8和chr11上的QTL的组合，以及缺乏这两个QTL。
图8-Tom2a蛋白结构域和膜的预测。
保藏
番茄(Solanum lycopersicum)种群20R.1552Q08_04的种子于2020年7月14日以保藏号NCIMB 43637保藏在NCIMB Ltd,Ferguson Building,Craibstone Estate,Bucksburn,Aberdeen AB21 9YA,UK，所述种子在8号染色体上纯合地包含本发明赋予抗性的Tom2a等位基因。
实施例
实施例1
8号染色体上ToBRFV抗性QTL的定位
观察到早期用醋栗番茄来源GNL.3951和内部育种品系TB2制成的BC3F2种群具有良好的表型抗性水平，但当进行qPCR时，它们分离出病毒滴度水平。所述来源植物本身在感染后具有低病毒滴度(实施例2，图2，表5)，因此显然在育种过程中没有转移完整的抗性机制。由于当病毒复制受到限制时，预计抗性更可靠，因此决定再次将BC3F2与供体植物杂交，以获得新的F1。随后从3个F1植物中制备F2种群，并且再次进行qPCR观察以确定感染ToBRFV后植物中的病毒滴度。观察到两个种群具有与来源植物相当的病毒滴度水平，这意味着植物不仅没有症状，而且植物中的病毒复制也极大减少。然而，第三个种群在qPCR测试中显示出大量分离(实施例3，图2)。
随后对该观察结果进行了广泛的标志物分析，以确定哪些遗传区域仍然是杂合的，并鉴定三个种群之间的差异。通过这种方式，似乎8号染色体上的区域可能是病毒复制的限制和更好的抗性水平的原因。对于显示出低病毒滴度的两个F2种群，该区域是固定的，但对于感染后在植物中存在病毒分离的种群，该区域仍然是分离的。通过进一步精细定位，可以进一步缩小8号染色体上的该QTL区域。原始QTL内重组体的鉴定最初产生了约1.5Mbp的较小区域，位于SEQ ID No.1和SEQ ID No.42之间。在该区域内，鉴定了许多与所述QTL连锁的多态性SNP标志物。
表4中列出了该分析中鉴定的QTL区域中存在的多态SNP标志物。基于公开的SL3_00番茄图谱的SNP的确切物理位置也可在表4中找到。图1给出了这些标志物的序列，即表示抗性的SNP与许多周围核苷酸组合用于标志物设计。这些标志物，特别是这些标志物中的SNP，被确定为与QTL共分离。所述标志物可以用于鉴定从保藏物生长的植物或其后代中QTL的存在。这些标志物可进一步用于鉴定对于ToBRFV抗性的本发明的在8号染色体上的QTL在包含所述QTL的任何其它番茄种群中的存在。此外，所述标志物可以用于鉴定醋栗番茄或另一茄属物种的抗性。
对于经选择纯合地具有QTL的F2和F3植物进行了进一步观察，根据表3中描述的等级，这证实了QTL的存在导致疾病评分平均为0–1，偶尔接近1.5，并且通过qPCR分析观察到低病毒滴度。用育种品系作为轮回亲本进行了进一步的回交，并且在回交世代的后续自交种群中，发现QTL的纯合存在导致抗ToBRFV的植物。
表4
SNP的位置出现在SEQ ID No.的位置101，如图1所示，其中所述位置用粗体和下划线表示。对于SEQ ID No.28，用作标志物的多态性位于位置101-104。对于SEQ ID No.30，用作标志物的多态性位于位置101-103。以这种方式，当与野生型序列相比时，可以在位置101之后分别鉴定GCC缺失和G缺失。
SEQ ID No.28和30从技术上讲不是SNP，因为它们不是单核苷酸多态性，而是插入缺失。SEQ ID No.28具有从公开的参考基因组中野生型序列的位置61.253.155开始的核苷酸TGCC的缺失，核苷酸TGCC被T取代，导致实际的GCC缺失。对应于野生型序列中61.253.155至61.253.161的位置是TGCCGCT，而抗性品系具有TGCT，即存在GCC缺失，如在SEQ ID No.28的位置101-104所示。SEQ ID No.30具有从公开的参考基因组中野生型序列的位置61.254.440开始的核苷酸TG的缺失，核苷酸TG被T取代，导致实际的G缺失。对应于野生型序列中61.254.440至61.254.443的位置是TGGA，而抗性品系具有TGA，即存在G缺失，如在SEQID No.30的位置101-103所示。为了简单起见，在本发明的上下文中，这些插入缺失多态性也称为SNP。
实施例2
ToBRFV抗性来源的qPCR测试
用ToBRFV感染ToBRFV抗性表型的来源植物，并且随后观察病毒滴度。这样做是为了确定抗性是否只是表型的，使得没有症状但病毒仍在复制，因此来源植物可以被称为是耐受的，或者如果病毒滴度真的极大降低或甚至不存在时，来源植物因此是真正具有抗性的。
通过进行qPCR测试来完成病毒滴度的测量。在该测试中，从ToBRFV感染的植物中取直径为约6mm的叶片打孔样品。将这些样品在500μl PBS缓冲溶液中研磨，并且将50μl所得悬浮液用于96孔KingFisher Flex分离实验方案。使用innuPREP DNA/RNA病毒PLUS试剂盒进行叶片材料的分离。在96CFX qPCR热循环仪(Biorad)中分析样品，使用程序为50℃下5分钟，95℃下20秒，然后按95℃下10秒，60℃下60秒进行40个循环。获得PCR产物所需的循环数是对样品中存在的病毒量的测量(Cq_ToBRFV)。为了能够比较具有不同遗传背景和具有不同样品大小的样品，在每次PCR运行中都包括番茄参考基因PHD基因，以校正结果(Cq_PHD)。每个样品的最终值Cq_corr计算为Cq_ToBRFV-Cq_PHD＝Cq_corr。因为Cq_PHD通常在25和29之间，具有非常高的病毒滴度的样品(例如Cq_ToBRFV为7)将导致大约-20的最终Cq_corr。病毒滴度低的样品将导致Cq_corr为大约-10至0。
表1中给出了测定中使用的引物。表2中给出了测定中使用的PCR体积。
从五个不同的试验中，收集了两个内部育种品系(TO1和TB2)和两个具有抗性表型的来源植物(即它们在生物测定中没有症状)的样品。在每个试验中，每个品系包括5至10株植物。对这些样品中的每一个进行qPCR分析，以确定感染后的病毒滴度。第一个试验Jordan_Winter是一个主动接种的田间试验。其他试验是在受控条件下进行的，据此对幼苗进行接种和评分。在不同试验中，观察到每个基因型的结果之间存在一些差异，但病毒滴度与基因型之间存在极好的相关性(表5)。两个耐受品系得分相当，并且具有介于-14.94和-19.94之间的平均Cq_corr值。无症状来源GNL.3919显然必须被视为耐受来源，因为病毒滴度并不比易感育种品系低多少，值在-11.70和-17.19之间。然而，另一个来源GNL.3951在所有试验中的得分非常令人信服并且具有一致的低病毒滴度水平，每个试验的平均Cq_corr值在-0.40和-8.75之间。因此，已证实为了获得真正的抗性使病毒在植物中的复制减少，必须使用GNL.3951的遗传学。
表5-试验的平均Cq_corr得分
实施例3
ToBRFV回交和F2种群和保藏物的qPCR测试
如实施例1中所述，最初在GNL.3951和易感番茄品系TB2之间产生BC3F2种群。在对这些种群进行ToBRFV生物测定的样品中测定了病毒滴度，发现所述滴度与GNL.3951来源不可比。因此，在BC3F2和GNL.3951之间进行了新的杂交，并将该F1自交以获得F2种群。
再一次，三个F2种群被ToBRFV感染以观察病毒症状。在这三个由三个F1植物产生的F2种群中，发现存在病毒抗性表型。然而，当进行qPCR测定以确定病毒滴度时，F2种群中的一个的病毒滴度表现出明显分离，而另两个种群的病毒滴度水平与抗性来源相当(图2)。得出的结论是，真正的抗性，即病毒复制的减少，不一定能通过生物测定来确定，而必须通过测定病毒滴度的测试来确认。还证实在番茄植物中可能获得真正的抗性，即病毒滴度降低。
从在qPCR中没有分离病毒滴度的F2种群中的一个种群中，通过自交获得F3种群。如实施例1所述，使用来自QTL分析的平行开发的标志物，确认植物具有与表4的标志物连锁的在8号染色体上的QTL。再一次，用ToBRFV感染植物，并进行病毒滴度的qPCR分析。经证实，F3种群也具有病毒复制的减少，因此这些植物保持了抗性(图3)。发现8号染色体上开发用于QTL的标志物与病毒滴度的降低共分离，并且因此可用于鉴定病毒滴度的降低。这些F3种群中的一个，20R.1552Q08_4，随后作为NCIMB 43637被保藏用于本发明。
实施例4
Tom2a作为ToBRFV抗性因果基因的鉴定
为了确定8号染色体上QTL区域内赋予ToBRFV抗性的实际基因，首先使用重组体(即在QTL区域中具有重组的品系，源自最初使用的品系)进行进一步的精细定位步骤。重组体表型分型后，所涉及的QTL区域被缩短为SEQ ID No.22至SEQ ID No.34所示标志物的区域。在该区域内，存在七个推定基因(图4)。
最初，具有SEQ ID No.26、SEQ ID No.29和SEQ ID No.30的标志物被鉴定为最优选的，并且这些标志物存在于那些基因中的一个基因中，所述基因在Sl3_00基因组中被鉴定为Solyc08g077220.3，被命名为Tom2a。目的是确认该基因为材料中的赋予抗性的基因。所述抗性由本文所公开的基因的等位基因赋予。
在新培育的品系组中，再次进行自交以获得进一步的重组体。用该区域中存在的13个标志物(图4的SL001–SL013)分析了这些重组体，发现该种群包括在Tom2a基因两侧具有重组的植物。SL004和SL005之间的重组将Solyc08g077220.3留下的基因与该区域分开。SL009和SL010之间的重组将Solyc08g077220.3与Solyc08g 077230.3分开。对这些重组体进行表型分析，以确定抗性表型是否确实与Tom2a基因的存在相关。
图4显示了重组品系的标志物图谱和表型分析得分。该区域内的指示基因是基于公开的ITAG3.2参考的注释来鉴定的，所述参考可以例如在solgenomics网站上找到。如果SL005留下的基因簇包含因果基因，则除07外，所有12个重组体的表型都偏离了预期。因此，可以排除这些基因。重组体07的表型符合Solyc08g077220.3(即Tom2a)的预期，是ToBRFV抗性的因果基因。通过这些观察，确实证实了抗性材料中Tom2a基因的等位基因导致了番茄品系中的ToBRFV抗性。
实施例5
在chr 8上具有QTL和在chr 11上具有QTL的材料的病毒滴度
通过BC2F3种群的培育产生了等基因品系。与杂交中用于培育等基因BC2F3品系的易感亲本一起接种和分析具有本发明的QTL的包含赋予抗性的Tom2a等位基因的品系、在11号染色体上具有如WO2019110821中所述的QTL的品系、在8号染色体和11号染色体上具有QTL组合的品系以及在8号染色体和11号染色体上具有QTL易感版本的品系。11号染色体上的QTL包含赋予抗性的CCA基因和/或赋予抗性的Albino3样基因。接种后，如实施例2所述，进行病毒滴度的qPCR分析。
结果如图7所示。发现具有赋予抗性的Tom2a等位基因(4_IL_QTL08)结合11号染色体上的QTL(5_IL_QTL08+11)的品系的病毒滴度的降低甚至进一步降低。这是一个非常令人惊讶的效果，因为只具有11号染色体上的QTL(3_IL_QTL11)的品系病毒滴度降低有限。缺乏两个抗性QTL的等基因品系(2_IL_野生型)与易感亲本(1_原始品系)具有相似的病毒滴度。因此，可以得出结论，通过组合8号染色体和11号染色体的QTL，可以在番茄中获得更强和更持久的抗性。通过将赋予抗性的Tom2a等位基因与赋予抗性的CCA基因组合或与赋予抗性的Albino3样基因组合，可以特别地获得更强和更持久的ToBRFV抗性。
Claims (25)
1.一种在8号染色体上包含QTL的番茄(Solanum lycopersicum)植物，其中在8号染色体上的QTL位于SEQ ID No.1和SEQ ID No.42之间，当所述QTL纯合地存在时赋予ToBRFV抗性。
2.根据权利要求1所述的番茄植物，其中所述QTL包含赋予抗性的Tom2a等位基因，所述赋予抗性的Tom2a等位基因包含SEQ ID No.45，或包含与SEQ ID No.45具有至少70％序列同一性的同源Tom2a序列。
3.根据权利要求1或2所述的番茄植物，其中8号染色体上QTL的存在与至少一种选自SEQ ID No.1至44中所示的SNP的标志物遗传连锁，优选选自SEQ ID No.3、SEQ ID No.4、SEQ ID No.14、SEQ IDNo.16、SEQ ID No.17、SEQ ID No.18、SEQ ID No.19、SEQ ID No.24、SEQ ID No.25、SEQ ID No.26、SEQ ID No.27、SEQ ID No.28、SEQ IDNo.29、SEQ ID No.30、SEQ ID No.34、SEQ ID No.42、SEQ ID No.43和SEQ ID No.44中所示的SNP的标志物，最优选选自SEQ ID No.26、SEQ ID No.27、SEQ ID No.28、SEQ ID No.29、SEQ ID No.30、SEQIDNo.43和SEQ ID No.44的标志物。
4.根据权利要求1、2或3所述的番茄植物，其中所述QTL存在于番茄植物的基因组中，所述番茄植物的代表性种子以保藏号NCIMB43637保藏在NCIMB中。
5.根据权利要求1、2或3所述的番茄植物，其中所述QTL从NCIMB43637或其后代植物中渗入。
6.根据权利要求1、2或3所述的番茄植物，其中所述QTL从醋栗番茄(Solanumpimpinellifolium)物种的植物或从与番茄性相容的另一茄属物种的植物中渗入。
7.根据权利要求1-6中任一项所述的番茄植物，其中所述QTL纯合地存在。
8.根据权利要求1-7中任一项所述的番茄植物的细胞，所述细胞在其基因组中包含权利要求1-3中任一项所述的在8号染色体上的QTL。
9.根据权利要求1-4中任一项所述的包含在8号染色体上的QTL的番茄种子，其中从所述种子生长的植物是如植物1-7中任一项所述的植物。
10.适合用于产生权利要求1-7中任一项所述的番茄植物的繁殖材料，其中所述繁殖材料适合用于有性繁殖，并且特别地选自小孢子、花粉、子房、胚珠、胚囊和卵细胞；或者所述繁殖材料适合用于营养繁殖，并且特别地选自插枝、根、茎、细胞和原生质体；或者所述繁殖材料适合用于再生细胞的组织培养，并且特别地选自叶、花粉、胚、子叶、下胚轴、分生组织细胞、根、根尖、花药、花、种子和茎；其中由所述繁殖材料产生的植物包含在8号染色体上的QTL，所述QTL导致权利要求1-4中任一项所述的ToBRFV抗性。
11.用于在番茄植物、或醋栗番茄植物、或与番茄性相容的另一茄属物种植物中鉴定ToBRFV抗性的标志物，所述标志物选自SEQ ID No.1至44中所示的SNP，优选选自SEQ IDNo.26、SEQ ID No.27、SEQ IDNo.28、SEQ ID No.29、SEQ ID No.30、SEQ ID No.43和SEQ IDNo.44中所示的SNP，最优选选自SEQ ID No.26、SEQ ID No.28、SEQ ID No.43和SEQ IDNo.44中所示的SNP的标志物。
12.用于在番茄植物、或醋栗番茄植物、或与番茄性相容的另一茄属物种植物中鉴定导致ToBRFV抗性的在8号染色体上的QTL的标志物，所述标志物选自SEQ ID No.1至44中所示的SNP，优选选自SEQ ID No.26、SEQ ID No.27、SEQ ID No.28、SEQ ID No.29、SEQ IDNo.30、SEQ ID No.43和SEQ ID No.44中所示的SNP，最优选选自SEQ ID No.26、SEQ IDNo.29和SEQ ID No.30中所示的SNP的标志物。
13.根据权利要求11或12所述的标志物用于在番茄植物、或醋栗番茄植物、或与番茄性相容的另一茄属物种植物中鉴定ToBRFV抗性的用途。
14.用于产生ToBRFV抗性番茄植物的方法，所述方法包括将权利要求1-4中任一项所述的在8号染色体上的QTL渗入番茄植物中。
15.用于选择ToBRFV抗性番茄植物、或醋栗番茄植物、或与番茄性相容的另一茄属物种植物的方法，所述方法包括鉴定权利要求1-4中任一项所述的在8号染色体上的QTL的存在，以及选择包含所述QTL的植物作为ToBRFV抗性植物。
16.根据权利要求15所述的方法，其中通过使用选自SEQ ID No.1至44中所示的SNP的标志物来鉴定8号染色体上QTL的存在，所述标志物优选选自SEQ ID No.3、SEQ ID No.4、SEQ ID No.14、SEQ ID No.16、SEQ ID No.17、SEQ ID No.18、SEQ ID No.19、SEQ IDNo.24、SEQ ID No.25、SEQ ID No.26、SEQ ID No.27、SEQ ID No.28、SEQ IDNo.29、SEQ IDNo.30、SEQ ID No.34、SEQ ID No.42、SEQ ID No.43和SEQ ID No.44中所示的SNP，最优选通过选自SEQ ID No.26、SEQ ID No.27、SEQ ID No.28、SEQ ID No.29、SEQ ID No.30、SEQID No.43和SEQ ID No.44中所示的SNP的标志物来鉴定。
17.一种用于产生抗ToBRFV的番茄植物的方法，所述方法包括：
a)将权利要求1-6中的任一项所述的在8号染色体上包含QTL的植物与另一植物杂交；
b)任选地对步骤a)中杂交产生的植物进行一轮或多轮自交和/或杂交，以获得下一代种群；
c)从步骤a)的杂交产生的植物或步骤b)的下一代种群中选择权利要求1-4中任一项所述的在8号染色体上包含所述QTL的植物，当所述QTL纯合地存在时，所述植物对ToBRFV具有抗性。
18.根据权利要求17所述的方法，其中通过使用与所述QTL遗传连锁的分子标志物进行在8号染色体上包含所述QTL的植物的选择，所述标志物选自SEQ ID No.1至44中所示的SNP，优选选自SEQ ID No.3、SEQ ID No.4、SEQ ID No.14、SEQ ID No.16、SEQ ID No.17、SEQ ID No.18、SEQ ID No.19、SEQ ID No.24、SEQ ID No.25、SEQ ID No.26、SEQ IDNo.27、SEQ ID No.28、SEQ ID No.29、SEQ ID No.30、SEQ ID No.34、SEQ ID No.42、SEQ IDNo.43和SEQ ID No.44中所示的SNP，最优选通过选自SEQ ID No.26、SEQ ID No.27、SEQ IDNo.28、SEQ ID No.29、SEQ ID No.30、SEQ ID No.43和SEQ ID No.44中所示的SNP的标志物来选择。
19.根据权利要求17所述的方法，其中抗ToBRFV的植物是通过表型选择的，特别是通过使用用于ToBRFV抗性的生物测定，或使用qPCR测试来选择。
20.根据权利要求17-19中任一项所述的方法，其中权利要求1-7中任一项所述的植物是从以NCIMB保藏号NCIMB 43637保藏的种子生长的植物或其后代植物。
21.用于产生番茄杂交种子的方法，所述方法包括将第一亲本植物与第二亲本植物杂交并收获所得杂交种子，其中所述第一亲本植物和所述第二亲本植物是本发明的抗ToBRFV植物，所述植物在8号染色体上包含权利要求1-4中任一项所述的QTL，其中所述QTL的存在导致从所述种子生长的杂交植物对ToBRFV有抗性。
22.根据权利要求21所述的方法产生的杂交种子。
23.包含SEQ ID No.45、或包含与SEQ ID No.45具有至少70％序列同一性的同源Tom2a序列的赋予抗性的Tom2a等位基因。
24.根据权利要求23所述的赋予抗性的Tom2a等位基因，所述等位基因编码包含SEQ IDNo.46的蛋白质，或编码与SEQ ID No.46具有至少70％序列同一性的同源蛋白质。
25.根据权利要求23或24所述的赋予抗性的Tom2a等位基因，其中所述同源序列编码包含SEQ ID No.48的位置105上的Ala缺失、SEQ ID No.48的位置187上的Arg至Gly转换、SEQID No.48的位置225上的Gly至Ser转换、或SEQ ID No.48的位置282上的Thr至Ala转换中的至少一种的蛋白质。
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