CN116056566A - 具有改进的烟草花叶病毒抗性的番茄植物 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种杂种番茄(Solanum lycopersicum)植物，在其基因组中包括至少一个拷贝的Rug‑1抗性基因，其中所述Rug‑1抗性基因能够赋予番茄褐色皱果病毒(ToBRFV)耐受性/抗性表型。本发明还涉及由根据本发明的植物生产的种子、可以由其生长出根据本发明的植物的种子、由根据本发明的植物生产的果实和根据本发明的植物的部分。本发明还涉及鉴定和/或选择根据本发明的植物或植物部分的方法。本发明还涉及用于生产根据本发明的具有ToBRFV耐受性/抗性表型的番茄植物的方法。本发明还涉及增强番茄植物的ToBRFV耐受性/抗性表型的方法，根据本发明的Rug‑1抗性基因用于增强番茄植物中的ToBRFV耐受性/抗性表型的用途，以及根据本发明的Rug‑1抗性基因的特异性遗传标记物用于选择具有增强的ToBRFV耐受性/抗性表型的番茄植物的用途。
Description
技术领域
本发明涉及植物育种领域。提供了一种杂种番茄(Solanum lycopersicum)植物，在其基因组中包括至少一个拷贝的Rug-1抗性基因，其中所述Rug-1抗性基因能够赋予番茄褐色皱果病毒(Tomato Brown Rugose Fruit Virus,ToBRFV)耐受性/抗性表型。本发明还涉及由根据本发明的植物生产的种子、由其可以生长出根据本发明的植物的种子、由根据本发明的植物生产的果实和根据本发明的植物的部分。本发明还涉及鉴定和/或选择根据本发明的植物或植物部分的方法。本发明还涉及用于生产根据本发明的具有ToBRFV耐受性/抗性表型的番茄植物的方法。本发明还涉及用于增强番茄植物的ToBRFV耐受性/抗性表型的方法，根据本发明的Rug-1抗性基因用于增强番茄植物中ToBRFV耐受性/抗性表型的用途，以及根据本发明的Rug-1抗性基因的特异性遗传标记物用于选择具有增强的ToBRFV耐受性/抗性表型的番茄植物的用途。
背景技术
烟草花叶病毒属(Tobamovirus)是蒂状病毒科(Virgaviridae)中的一个病毒属，其特征是存在线性单链正义基因组RNA。该属中目前有35个种。与该属病毒相关的疾病症状包括叶片上的坏死性病变。烟草花叶病毒属这个名称是首字母缩写词，源自模式种烟草花叶病毒。
番茄花叶病毒(ToMV)可引起番茄植株变黄和矮化，导致作物损失(loss ofstand)和产量降低。此外，病毒可能导致果实成熟不均匀，进一步降低产量。虽然ToMV最常见的是感染番茄，但该病毒也可以感染辣椒、马铃薯、茄子和香瓜茄。
许多商业植物携带抗ToMV的病毒抗性基因。然而，这些抗性基因可能变得无效，因为病毒种的抗性破坏株可能会进化，或因为新的病毒种可能会进化。在番茄中，三种显性ToMV抗性基因已被用于控制ToMV。这些抗性基因是Tm1(由多毛番茄(S.habrochaites)基因渗入；赋予对0和2号ToMV毒株的抗性)、Tm2(由秘鲁番茄(S.peruvianum)基因渗入，赋予对0和1号ToMV毒株的抗性)和Tm22(同样由秘鲁番茄基因渗入)，赋予对0、1和2号的抗性。
抗性基因和病毒进化之间存在着不断的进化竞争。最近发现了烟草花叶病毒属的一个新种，在此称为番茄褐色皱果病毒(ToBRFV)，其可以感染携带三种所指出的Tm抗性基因中的任何一种或其组合的番茄植物(参见WO2017/012951 A1和Luria 2017 PLoS ONE 12(1):e0170429)。同时已经记载了11号染色体上的QTL、6号染色体上的QTL和9号染色体上的QTL可以独立地在番茄植物中赋予对ToBRFV感染的有限程度的抗性和/或耐受性(参见WO2018/219941 A1和WO 2020/18783 A1)。然而，在第11、6和9号染色体上包括一个或多个QTL的番茄植株在ToBRFV感染后仍表现出不希望有的疾病症状，例如不希望有的叶片扭曲和变形、果实上的花叶病形成和/或斑点形成。US2020/0077614A1教导了具有对ToBRFV感染的抗性的番茄植物是通过将WO 2018/219941 A1中2号染色体上的Tm-1抗性基因与选自11号染色体上的QTL、6号染色体上的QTL和9号染色体上的QTL中的至少一个QTL组合来获得的。鉴于宿主对病原体失去抗性的危险，一直需要开发额外的病毒抗性来源。因此，本发明的一个目的是，在任何先前记载的抗性来源之外，提供用于获得具有对ToBRFV感染的改进抗性的植物的方法和手段。
发明内容
本发明提供了一种杂种(hybrid)番茄植物，在其基因组中包括至少一个拷贝的Rug-1抗性基因，其中Rug-1抗性基因赋予番茄褐色皱果病毒(ToBRFV)耐受性/抗性表型，并且其中Rug-1抗性基因编码包括与SEQ ID NO:16的至少95％的氨基酸序列同一性的蛋白质。
此外，本发明提供了由根据本发明的杂种番茄植物生产的种子，其中该种子包括本文所述的Rug-1抗性基因。本发明进一步提供了一种种子，由其可以生长出根据本发明的杂种番茄植物。本发明进一步提供了根据本发明的杂种番茄植物的植物细胞、组织或植物部分或根据本发明的种子，其包括本文所述的Rug-1抗性基因。
此外，本发明提供了用于鉴定和/或选择番茄植物或植物部分的方法，包括确定所述植物或植物部分在其基因组中是否包括本文所述的Rug-1抗性基因。
此外，本发明提供了用于生产具有ToBRFV耐受性/抗性表型的番茄植物的方法，所述方法包括以下步骤：(i)将第一种番茄植物与第二种植物杂交，其中第一种番茄植物在其基因组中包括至少一个拷贝的本文所述的Rug-1抗性基因；(ii)任选地从(i)的杂交中收获种子并选择在其基因组中包括Rug-1抗性基因的种子。
此外，本发明提供了用于增强番茄植物的ToBRFV耐受性/抗性表型的方法，其中所述番茄植物优选地包括将本文所述的Rug-1抗性基因渗入所述番茄植物中。本发明进一步提供了本文所述的Rug-1抗性基因用于增强番茄植物中的ToBRFV耐受性/抗性表型的用途。本发明进一步提供了本文定义的Rug-1抗性基因的特异性遗传标记物用于选择具有增强的ToBRFV耐受性/抗性表型的番茄植物的用途。
附图说明
图1：基于根据实施例1和ELISA测定的视觉评估和ToBFRV抗性分类的抗病性测试中获得的结果。
图2：对应于14、28和36dpi(接种后天数)的三种不同评估的QTL定位。
图3：评估3的2号染色体的QTL区间。
图4：包括Tm-1抗性基因的SOURCE01和GCR237的序列比较。
图5：SNP_17的簇状图(cluster plot)。
图6：使用Droplet PCR获得的预期结果的视觉概览。
图7：RUG-1蛋白和TM1蛋白的CLUSTAL多氨基酸序列比对。
具体实施方式
通用定义
应当理解，本发明不限于特定的方法或方案。还应理解，本文使用的术语仅用于描述特定实施例的目的，并不旨在限制本发明的范围，本发明的范围将仅由所附权利要求书限制。必须注意，如本文和所附权利要求书中使用的，单数形式“一个(a)”、“一个(an)”和“该(the)”包括复数引用，除非上下文另有明确规定。因此，例如，提及“一个载体”是提及一个或多个载体并且包括本领域技术人员已知的其等价物等。术语“约”在本文中用于表示近似、大致、大约或在该范围内。当术语“约”与数值范围结合使用时，其通过将边界扩展到规定的数值之上和之下来修改该范围。一般而言，术语“约”在本文中用于将数值修改为高于和低于所述值的20％，优选10％上下(更高或更低)的变化。如本文所使用的，词语“或”表示特定列表的任何一个要素并且还包括该列表的要素的任何组合。当在本说明书和所附权利要求书中使用时，词语“包括(comprise)”、“包括(comprising)”、“包括(include)”、“包括(including)”和“包括(includes)”旨在指定存在一个或多个所述特征、整数、成分或步骤，但不排除存在或添加一个或多个其他特征、整数、成分、步骤或它们的组。为清楚起见，说明书中使用的某些术语按照以下来定义和使用：
术语“基因组”涉及生物体的遗传物质。它由DNA组成。基因组包括DNA的基因和非编码序列。
术语“基因”指(基因组)DNA序列，其包括在细胞中被转录成信使RNA分子(mRNA)的区域(转录区)和可操作地连接的调节区(在本文中也描述为调控序列，例如启动子)。因此，基因可以包括几个可操作地连接的序列，例如启动子、5'前导序列，包括例如：涉及翻译起始的序列、(蛋白质)编码区(cDNA或基因组DNA)和3'非翻译序列，包括例如：转录终止位点。因此，基因的不同等位基因是该基因的不同替代形式，其形式可以是例如：基因组DNA序列(例如启动子序列、外显子序列、内含子序列等)、mRNA和/或编码蛋白质的氨基酸序列的一个或多个核苷酸的差异。基因可以是内源基因(在原始物种中)或嵌合基因(例如转基因或顺基因)。基因序列的“启动子”被定义为启动特定基因转录的DNA区域。启动子位于其转录的基因附近，位于DNA的同一条链和上游。启动子的长度约为100-1000个碱基对。在一方面，启动子被定义为约1000个碱基对或更多个碱基对(例如大约1500或2000)的区域，在该基因编码的蛋白质的起始密码子(即ATG)的上游。
“基因的表达”是指这样一个过程，其中DNA区域可操作地连接到适当的调节区(特别是启动子)，被转录成具有生物活性的RNA，即能够被翻译成具有生物活性的蛋白质或肽或本身具有活性(例如在转录后基因沉默或RNAi中)。编码序列可以是正义方向并且编码所需的具有生物活性的蛋白质或肽。
术语“蛋白质”和“多肽”可互换使用，是指由氨基酸链组成的分子，不涉及特定的作用方式、尺寸、3维结构或来源。因此，蛋白质的“片段”或“部分”仍可称为“蛋白质”。“分离的蛋白质”用于指不再处于其自然环境中的蛋白质，例如在体外或在重组细菌或植物宿主细胞中。
术语“肽序列”和“氨基酸序列”是指蛋白质或多肽的一级氨基酸序列。
如本文所使用的，QTL(数量性状基因座)是占据染色体上特定位置并且包括植物中特定表型特征或性状的遗传指令的遗传单位(通常由一个或多个分子基因组标记物标示)。与基因不同，QTL的确切边界是未知的，但是本领域技术人员可以通过使用遗传定位领域中公知的精细定位技术和后续的DNA测序程序发现而无过度负担。QTL编码至少一种基因，其单独或与其他基因组合的表达导致表型性状被表达，或编码至少一种调节区，该调节区控制至少一种基因的表达，其单独或与其他基因组合的表达导致表型性状被表达。QTL可以通过以下方式来定义：使用一种或多种分子基因组标记物标示其在包括QTL的基因渗入供体的基因组中的遗传位置。这些一种或多种标记物依次标示特定基因座。
基因座之间的距离通常通过同一染色体上基因座之间的交换频率来测量。两个基因座相距越远，它们之间发生交换的可能性就越大。相反，如果两个基因座靠得很近，则它们之间不太可能发生交换。通常，1厘摩(cM)等于基因座(标记物)之间的1％重组。当一个QTL可以由多个标记物标示时，端点标记物之间的遗传距离表明QTL的尺寸。定义QTL的标记物可以是与QTL连锁的标记物或与QTL连锁不平衡的标记物。
“平均值”在本文中是指算术平均值。
应当理解，不同植物系之间的比较涉及在与一种或多种对照植物系的植物(优选野生型植物)相同的条件下种植一个系(或品种)的多个植物(例如，每个系至少5株植物，优选地至少10株植物)，并确定在相同的环境条件下生长时植物系之间的差异，优选统计学显著性差异。优选地，这些植物属于同一系或品种。更优选地，对照植物是等基因植物。术语“等基因植物”是指除目的QTL或目的因果基因外在遗传上相同的两种植物。
如本文所使用的，术语“分子基因组标记物”或简称“标记物”是指用在将核酸序列特征的差异可视化的方法中的指示剂。这类指示剂的实例是限制性片段长度多态性(RFLP)标记物、扩增片段长度多态性(AFLP)标记物、单核苷酸多态性(SNP)、插入突变、微卫星标记物(SSR)、序列表征扩增区域(SCAR)、酶切扩增多态性序列(CAPS)标记物或同工酶标记物，或本文所述标记物的组合，其定义了特定的遗传和染色体位置。
如本文所使用的，术语“Rug-1抗性基因”是指编码包括与SEQ ID NO:16的至少95％(例如更优选96％、97％、98％、98.3％、98.7％、99.0％或99.3％或最优选99.7％)的氨基酸序列同一性的基因。这种由Rug-1抗性基因编码的蛋白质在本文中被描述为“RUG-1”蛋白。不囿于理论，认为RUG-1蛋白起到病毒RNA复制的抑制剂的作用，对ToBRFV复制具有特定和/或增强的作用。编码本发明的RUG-1蛋白的核酸序列可以是SEQ ID NO:17的核酸序列。优选地，Rug-1抗性基因存在于，或可获自，或获自，或包括在名为PAR02001的番茄植物的基因组中，所述PAR02001的番茄植物的代表性数量的种子已经以保藏号NCIMB 43590保藏。
如本文所使用的，术语“Tm-1抗性基因”是指在Ishibashi et al.(2007)PNAS 104(34)13833–13838中记载的Tm-1抗性基因，并已知编码80kDa的多肽，其作为病毒RNA复制的抑制剂发挥作用。优选地，Tm-1抗性基因存在于，可获自，或获自，或包括在名为PAR02001的番茄植物的基因组中，所述PAR02001的番茄植物的代表性数量的种子已经以保藏号NCIMB43590保藏。因此，Tm-1抗性基因编码的蛋白质包括与SEQ ID NO:21的至少98％(例如更优选98.3％、98.7％、99.0％或99.3％或最优选99.7％)的氨基酸序列同一性，并且在本文中也称为“TM-1”蛋白。因此，编码根据本发明的TM-1蛋白的核酸序列可以是SEQ ID NO:22的核酸序列。
“序列同一性”和“序列相似性”可以通过使用全局或局部比对算法比对两个肽或两个核苷酸序列来确定。通过例如程序GAP或BESTFIT或Emboss程序“Needle”(使用默认参数，见下文)进行最佳比对后，当序列共享至少某个最小百分比的序列同一性(如下文进一步定义)时，序列可以被称为“基本相同”或“基本相似”。这些程序使用Needleman和Wunsch全局比对算法在整个长度上比对两个序列，将匹配数最大化且将空位数最小化。通常，使用默认参数，空位生成罚分＝10，空位延伸罚分＝0.5(用于核苷酸和蛋白质比对)。对于核苷酸，使用的默认评分矩阵是DNAFULL，对于蛋白质，默认评分矩阵是Blosum62(Henikoff&Henikoff,1992,PNAS 89,10915-10919)。序列比对和百分比序列同一性的分数可以例如使用计算机程序确定，例如EMBOSS(http://www.ebi.ac.uk/Tools/psa/emboss_needle/)。或者，可以通过检索如FASTA、BLAST等数据库来确定序列相似性或同一性。Hits优选地成对比对以比较序列同一性，优选地在序列的全长上进行比对。
如本文所使用的，如果序列同一性百分比为至少80％，例如，至少83％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、98.3％、98.7％、99％、99.2％、99.3％、99.5％、99.7％、99.9％或更多，优选地在它们的整个长度上确定(由使用默认参数的Emboss“needle”确定的，即空位生成罚分＝10，空位延伸罚分＝0.5，使用核酸评分矩阵DNAFULL)，则两个核苷酸序列具有“基本序列同一性”。
如本文所使用的，术语“杂交”用于表示核酸在合适的严格条件下的杂交，这对于本领域技术人员来说是显而易见的，取决于探针序列和靶序列的性质。杂交和洗涤的条件是本领域中公知的，并通过改变培育时间、温度和/或溶液的离子强度，根据期望的严格性来调节条件是容易实现的。参见例如Sambrook,J.et al.,Molecular Cloning:ALaboratory Manual,2nd edition,Cold Spring Harbor Press,Cold Spring Harbor,NewYork,1989。条件的选择取决于被杂交的序列的长度，特别是探针序列的长度、核酸的相对G-C含量和允许的错配量。当需要具有较低互补程度的链之间部分杂交时，优选低严格条件。当需要完全或接近完全的互补性时，优选高严格条件。当提及与参考序列具有“基本序列同一性”或与参考序列具有至少80％序列同一性(例如至少83％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、98.3％、98.7％、99％、99.2％、99.3％、99.5％、99.7％、99.9％核酸序列同一性)的核酸序列(例如DNA或基因组DNA)时，在一个实施方案中，所述核苷酸序列被认为与给定核苷酸序列基本相同，并且可以使用严格杂交条件鉴定。在另一个实施方案中，相较于给定核苷酸序列，核酸序列包括一个或多个突变，但仍可使用严格杂交条件鉴定。
“严格杂交条件”可用于鉴定与给定核苷酸序列基本相同的核苷酸序列。严格条件取决于序列并且在不同情况下会有所不同。通常，严格条件选择为在确定的离子强度和pH下比特定序列的热熔点(Tm)低约5℃。Tm是(在确定的离子强度和pH下)50％的靶序列与完全匹配的探针杂交的温度。通常，严格条件选择为其中盐浓度在pH 7下约为0.02摩尔，温度为至少60℃。降低盐浓度和/或提高温度会增加严格性。RNA-DNA杂交(使用例如100个核苷酸的探针的RNA印迹法)的严格条件是例如包括在0.2XSSC中在63℃下洗涤至少一次并持续20分钟的那些条件，或等同条件。DNA-DNA杂交(使用例如100个核苷酸的探针的DNA印迹法)的严格条件是例如包括在至少50℃(通常约55℃)的温度下在0.2X SSC中洗涤至少一次(通常是2次)并持续20分钟的那些条件，或等同条件。同样参见Sambrook et al.(1989)和Sambrook and Russell(2001)。
如本文所使用的，短语“杂交”到DNA或RNA分子用于表明分子通过碱基配对识别和杂交另一个核酸分子，这意味着两个核酸分子之间存在足够的序列相似性以在适当的条件下实现杂交。
如本文所使用的，术语“基因渗入(introgression)”、“基因渗入(introgressed)”和“基因渗入(introgressing)”是指一种自然和人工的过程，其中一个物种、品种或栽培品种(称为供体亲本)的基因组片段被转导到另一个物种、品种或栽培品种(称为受体亲本)的基因组中，例如通过将供体和受体亲本杂交。该过程可以任选地通过将所得植物与受体亲本回交来完成，受体亲本称为轮回亲本。基因渗入片段存在于其自然基因组环境之外，这意味着含有来自细叶番茄(Solanum pimpinellifolium)的基因渗入片段的植物不是细叶番茄植物。
术语“等位基因”用于表示特定基因座处基因的任何一种或多种替代形式，所有这些等位基因与特定基因座处的一种性状或特征相关。在生物体的二倍体细胞中，给定基因的等位基因位于染色体上的特定位置，称为基因座。一个等位基因存在于一对同源染色体的每条染色体上。二倍体植物物种可以包括基因的相同等位基因(纯合的)或两个不同的等位基因(杂合的)。
术语“基因座”是指染色体上存在例如基因或遗传标记物的特定位置或位点。
如本文所使用的，术语“植物”包括整株植物或其任何部分或衍生物，例如植物器官(例如，收获或未收获的果实、叶片、种子、花等)、植物细胞、植物原生质体、可再生出整株植物的植物细胞或组织培养物、植物愈伤组织、植物细胞团和植物中完整的植物细胞，或植物的部分，例如胚、花粉、胚珠、子房、果实(例如，收获的组织或器官，例如收获的辣椒果实或其部分)、花、叶片、种子、无性繁殖的植物、根、根茎、茎、根尖等。此外，还包括任何发育阶段，例如未成熟和成熟的幼苗等。
“植物系”或“育种系”是指植物及其子代。如本文所使用的，术语“自交系”是指已经重复自交的植物系，优选3次以上，更优选6次以上。
术语“栽培品种”(或“栽培”植物)在本文中用于表示具有除“野生”状态之外的生物学状态的植物，其中“野生”状态表示植物或种质的原始的非栽培、非驯化、或自然状态，而术语栽培的不包括此类野生或杂草植物。术语栽培品种确实包括具有良好农艺特性的材料，例如育种材料、研究材料、育种系、良种育种系、合成种群、杂种、创始人种群(founderstock)/基础种群、自交系、栽培品种(杂种栽培品种的开放授粉)、分离种群、突变体/遗传种群以及先进/改良栽培品种。在一个实施方案中，术语栽培品种还包括地方品种，即人类多年来在当地选择和栽培并使其适应特定地理环境并共享共同基因库的植物(或种群)。与野生种质相比，栽培品种具有良好的农艺特性，例如产量高、果实尺寸更大、肥力更高、植物和/或果实的一致性更高等。
“植物品种”是指具有已知最低等级的相同植物分类群内的一组植物，其(不考虑是否满足承认植物育种者权利的条件)可以根据由某一基因型或基因型组合导致的特征的表达来限定，可以通过这些特征中的至少一个的表达来与任何其他植物组区分开，并且可以被视为一个实体，因为其可以在没有任何变化的情况下繁殖。因此，术语“植物品种”不能用于表示一组植物，即使它们属于同一种类，如果它们都以存在一个基因座或基因(或由于这个单一基因座或基因而生产的一系列表型特征)为特征，但在其他基因座或基因方面却可能彼此之间存在巨大差异。
术语茄科(Solanaceae)是指植物的一个科，其包括属(特别是茄属(Solanum)和辣椒属(Capsicum))，其包括由人类栽培和培育的水果和蔬菜种，例如番茄(Solanumlycopersicum)、辣椒(Capsicum annuum)、茄子(Solanum melongena)和香瓜茄(Solanummuricatum)。
“番茄植物”或“栽培番茄植物”是番茄的植物，即番茄品种、育种系或栽培种，由人类栽培并具有良好的农艺特性；优选地，此类植物不是“野生植物”，即通常具有比栽培植物更差的产量和更差的农艺特性的植物，例如在野生种群中自然生长的植物。
“野生植物”包括例如物种的野生种质或野生近缘种。在本发明的一个方面，所谓传家宝(heirloom)番茄品种或栽培品种，即在人类历史早期普遍生长并经常被适应于特定地理区域的开放授粉品种或栽培品种，在本文中涵盖为栽培番茄植物。
番茄的野生近缘种包括S.arcanum、克梅留斯基番茄(S.chmielewskii)、小花番茄(S.neorickii)(＝Lycopersicon parviflorum)、S.cheesmaniae、多腺番茄(S.galapagense)、细叶番茄(S.pimpinellifolium)、智利番茄(S.chilense)、S.corneliomulleri、多毛番茄(S.habrochaites)(＝L.hirsutum)、S.huaylasense、蒜芥茄(S.sisymbriifolium)、秘鲁番茄(S.peruvianum)、S.hirsutum、潘那利番茄(S.pennellii)、类番茄茄(S.lycopersicoides)、里基茄(S.sitiens)和赭黄茄(S.ochranthum)。
术语“F1、F2等”指两个亲本植物或亲本系之间杂交后的连续相关世代。由两种植物或植物系杂交生产的种子生长出的植物称为F1世代。F1植物自交生产F2世代等。术语“杂种”植物(或杂种种子)是指通过两个近交亲本系杂交获得的植物或种子。术语“F1杂种”植物(或“F1杂种”种子或“F1种子”)是指通过两个近交亲本系杂交获得的第一世代植物或种子。
根据本发明的番茄植物可以是确定的或不确定的。番茄果实可能有不同的大小和形状，如樱桃状、铃形、块状、醋栗状、深圆形椭圆形或罗马形、扁平球状、葡萄状、长块状、长尖状、牛心状、梨状、牛排状、圆形、小梨状、小尖状、填充状、李子状(cherry,bell,blocky,currant,deep round oval or roma,flattened globe,grape,long blocky,longpointed,oxheart,pear,beefsteak,round,small pear,small pointed,stuffer,plum)。番茄的表皮颜色可能从深红色、紫色、鲜红色到黄色，甚至粉红色。番茄的公认表皮颜色是例如深色、双色、深粉色、金色、绿色、橙色、粉色、红色、白色和黄色。
如本文所使用的，术语“子代(progeny)”、“子代(progenies)”和“后代(descendants)”是指可衍生自或可获自本发明的植物的任何和所有后代，其包括本文所述的ToBRFV耐受性/抗性表型和/或一种或多种纯合或杂合形式的ToBRFV耐受性/抗性表型QTL。子代可以通过细胞培养或组织培养或通过产生植物种子获得。术语子代还可以包括源自至少一种抗性亲本植物与相同或另一品种或(育种)系的另一种植物杂交的植物。后代通过例如传统育种方法(自交和/或杂交)或再生或转化直接衍生自、获自、或可获自或可衍生自亲本植物。然而，术语“后代”通常包括更进一步的世代，例如第二、第三、第四、第五、第六、第七或更多世代，即通过例如传统育种方法、再生或遗传转化技术衍生自、获自、可获自或可衍生自前一世代植物的植物世代。例如，可以通过上述任何方法从第一世代子代产生第二世代子代。
如本文所使用的，术语番茄褐色皱果病毒(ToBRFV)是指烟草花叶病毒的新种，其是通过病毒基因组测序确定并公开于WO2017/012951A1。分离出一种病毒株，称为VE484毒株，其保藏于DSMZ。毒株VE484能够感染包括广泛使用的抗性基因Tm1、Tm2和Tm22的栽培番茄植物。其还能够感染其他茄科，特别是辣椒属的成员(如栽培辣椒)，以及除了番茄外，可能感染茄属的其他成员，如番茄的野生近缘种，茄子和香瓜茄。如WO2017/012951A1中公开的这种正义单链RNA病毒的基因组序列编码四个ORF(开放阅读框)。整个基因组的长度为6402个碱基，与最相似的病毒(Genbank登记号FR878069.1)(烟草花叶病毒毒株Ohio V，完整基因组，基因组RNA)在整个长度上只有82％的序列同一性。根据《Virus Taxonomy:9threport of the International Committee on Virus Taxonomy》(ISBN 978-0-12-384684-6，p1155)一书中提出的物种划分标准，具有低于90％序列同一性的核苷酸基因组序列的病毒建议归类为新属。
如果相较于对照植物，感染ToBRFV后疾病症状减轻，如果相较于对照植物，植物在感染后仍然没有疾病和/或病毒滴度降低，则认为植物具有ToBRFV耐受性/抗性表型。ToBFRV耐受性/抗性的评估优选地是通过目测观察进行，通过观察如下文实施例中所述的不同症状(包括花叶病、发育迟缓、系统性萎黄病，以及有时为伴随叶片变形的系统性坏死)。疾病症状包括叶片样品中的坏死性病变和花叶病症状。局部症状(表明在用ToBRFV接种植物后病毒没有传播)，表明植物对ToBRFV具有抗性。ToBRFV耐受性/抗性例如可以通过使用ToBRFV接种物，或在自然ToBRFV出现的田间、隧道或温室的生长区域中进行标准化ToBRFV抗性测试评估。可能使用各种ToBRFV抗性测定，例如如本文实施例中的ToBRFV抗性测试中所记载的。通常，ToBRFV抗性测试可以包括例如，当植物为至少2周龄时(例如2周龄、3周龄、4周龄、5周龄、6周龄、7周龄、8周龄或更多)，对多个植物的叶片进行人工接种，任选地随后对叶片进行第二次接种，例如在1周后、2周后或3周后，将植物和对照植物在合适的条件下培育合适的时间。易感对照应具有严重的症状以使测试成功(例如，至少30％，优选至少40％，或50％，或超过60％(>>50％)的叶片面积显示花叶病和叶片扭曲/变形)。优选地，每个重复中包括每个基因型的至少5个，例如10、20、30、40、50或甚至超过200株植物，并且优选地进行多个重复。在一方面，当测试抗性时，如果系或品种的至少90％、95％或100％的植物显示小于25％的叶片面积显示出花叶病症状和/或叶片扭曲/变形(例如20％、15％、10％、5％或甚至小于5％或更优选无症状(0％))，而易感对照系或品种的至少50％、60％、70％、80％、90％或更多的植物显示超过25％的叶片面积显示出花叶病症状和/或叶片扭曲/变形(例如，30％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％，或甚至超过95％或更优选无抗性(100％))，则认为该系或品种“具有抗性”。在另一方面，在本文实施例中所限定的ToBRFV抗性测试方案中，当植物得分为6或更高，例如，7、8或最优选地9时，则认为该植物显示出高水平的ToBRFV耐受性/抗性。在本文实施例中所限定的ToBRFV抗性测试方案中，当植物得分为4或5时，则认为该植物具有中等水平的ToBRFV耐受性/抗性。在本文实施例中所限定的ToBRFV抗性测试方案中，当植物得分为2或3时，则认为该植物具有低水平的ToBRFV耐受性/抗性。在本文实施例中所限定的ToBRFV抗性测试方案中，当植物得分为1时，则认为该植物没有ToBRFV耐受性/抗性。或者，除目测观察之外，还可通过定量酶联免疫吸附测定(ELISA)和/或逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测病毒滴度来进行ToBFRV耐受性/抗性的评估。
应当理解，不同植物系之间的比较涉及在与对照植物相同的条件下生长的一个系的多株植物(例如，每系至少5株植物，优选至少10株植物)，以及确定在相同环境条件下生长时植物系之间的统计学显著差异。优选地，这些植物属于同一系或品种。
例如，通过在100ml 0.03M磷酸盐缓冲液中研磨10g感染的叶片(冷冻和/或新鲜叶片)来制备“病毒悬液”或“病毒接种物”。通过将病毒机械接种到健康植物上，用所述病毒悬液接种植物(优选幼年植物，例如15日龄的植物)，例如通过用一定量的悬液轻轻接触叶片。作为替代方案，可以将患病叶片的一部分直接在需要感染的植物叶片上摩擦。优选地对叶片进行预处理以破坏下表皮并增强病毒的进入。如本领域技术人员已知的，这可以通过例如将金刚砂粉末预先撒在叶片上，或通过将硅藻土粉末撒在叶片上来实现。优选地避免过度伤害。接种后，植物可在白天25℃、夜间20℃、16小时的光周期下培育。
接种的植物的评估可以在接种后的任何时间时进行，例如在接种后15天时或在出现第一个症状时。筛选的评估优选地是通过以下方式进行：目测观察看到不同的症状(包括花叶病、发育迟缓、系统性萎黄病，有时为伴随叶片变形的系统性坏死)、定量酶联免疫吸附测定(ELISA)和逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)来检测病毒滴度。
在本文件及其权利要求中，动词“包括”及其变形以其非限制性意义使用，表示包括该词之后的项目，但不排除未具体提及的项目。此外，通过不定冠词“一个(a)”或“一个(an)”提及一个元素并不排除存在多个所述元素的可能性，除非上下文明确要求存在一个且只有一个元素。因此，不定冠词“一个(a)”或“一个(an)”通常表示“至少一个”。还应理解，当在本文中提及“序列”时，通常指的是具有亚基(例如氨基酸或核酸)的特定序列的实际物理分子。
本发明的植物
本发明提供了一种杂种番茄植物，其基因组中包括至少一个拷贝的Rug-1抗性基因，其中Rug-1抗性基因赋予(即能够赋予)番茄褐色皱果病毒(ToBRFV)耐受性/抗性表型，并且其中Rug-1抗性基因编码包括与SEQ ID NO:16的至少95％的氨基酸序列同一性的蛋白质。
本发明人出乎意料地发现，包括至少一个拷贝的本文所述的Rug-1抗性基因的番茄植物显示出ToBRFV耐受性/抗性表型。进一步出乎意料地发现，所观察到的由所述至少一个拷贝的Rug-1抗性基因生产的ToBRFV耐受性/抗性表型不是由2号染色体上的Tm-1抗性基因导致的。
当包括在番茄植物的基因组中时，根据本发明的Rug-1抗性基因因此赋予ToBRFV耐受性/抗性表型。用于确定给定番茄植物是否显示出ToBRFV耐受性/抗性表型的手段和方法在本领域中是公知的。优选地，ToBRFV耐受性/抗性表型是通过目测观察看到不同症状(包括花叶病、发育迟缓、系统性萎黄病、有时为伴随叶片变形的系统性坏死)来确定，最优选地通过使用如下文实施例中所述的测试来确定。
本发明提供的番茄植物是杂种番茄植物，因此不是近交番茄植物。杂种植物可能具有例如改进的一致性、活力和/或疾病耐受性等优点。本发明的杂种植物中包括的Rug-1抗性基因包括在从本文中称为SOURCE01的专有番茄近交植物系获得的渗入片段中。在进一步优选的实施方案中，根据本发明的番茄植物是F1杂种植物，更优选单交F1杂种植物。
不囿于理论，据认为Rug-1抗性基因编码多肽，所述多肽通过与包括ToBRFV在内的烟草花叶病毒的复制蛋白结合并抑制其功能，起到病毒RNA复制的抑制剂的作用，并且所述多肽具有相较于其他先前已知的起到烟草花叶病毒抑制剂作用的多肽(例如由Tm-1抗性基因编码的多肽)不同的和/或更高的结合活性和/或抑制活性。
根据本发明的Rug-1抗性基因编码包括与SEQ ID NO:16的至少95％的氨基酸序列同一性的蛋白质，例如更优选与SEQ ID NO:16的96％、97％、98％、98.3％、98.7％、99.0％或99.3％或最优选99.7％的序列同一性(如使用本文其他位置公开的方法确定的)。
在一方面，本发明提供一种番茄植物，其中本文所述的Rug-1抗性基因以纯合形式存在。出乎意料地发现，相较于Rug-1抗性基因杂合的纯合植物，本文所述的Rug-1抗性基因纯合的番茄植物的ToBRFV耐受性/抗性表型显示出改进的ToBRFV耐受性/抗性表型。这种其中Rug-1抗性基因以纯合形式存在的番茄植物可以使用常规方法容易地从其中Rug-1抗性基因以杂合形式存在的番茄植物获得，例如通过自交其中Rug-1抗性基因以杂合形式存在的番茄植物，任选地随后选择包括纯合形式的Rug-1抗性基因的后代。
因此，当存在于番茄植物的基因组中时，根据本发明的Rug-1抗性基因优选地赋予ToBRFV耐受性/抗性表型。包括本文所述的Rug-1抗性基因的番茄种子的代表性样品已经保藏，并且来自保藏物或保藏物的后代，本发明的Rug-1抗性基因可以容易地转移到任何其他植物中，所述植物可以与从保藏的种子生长出的番茄植物或其后代杂交。或者，可以鉴定包括相同的Rug-1抗性基因的其他供体。在一方面，本发明提供了一种番茄植物，其中Rug-1抗性基因存在于、或可获自、或获自或包括于称为PAR02001的番茄植物的基因组中，其代表性数量的种子已经以保藏号NCIMB 43590保藏。
在一方面，本发明提供了一种番茄植物，其中该植物是单交F1杂种或近交系。因此，本发明提供了一种单交F1杂种或近交系番茄植物，一种在其基因组中包括至少一个拷贝的Rug-1抗性基因的杂种番茄植物，其中Rug-1抗性基因赋予ToBRFV耐受性/抗性表型，并且其中Rug-1抗性基因编码包括与SEQ ID NO:16的至少95％的氨基酸序列同一性的蛋白质。
在一方面，本公开提供了本文涵盖的衍生自本发明的杂种植物的单倍体植物和/或双单倍体植物，其包括本文所述的Rug-1抗性基因。单倍体和双单倍体植物可以例如通过花药或小孢子培养和再生成整株植物而生产。对于双单倍体的生产，染色体加倍可以使用已知的方法来诱导，例如秋水仙碱处理等。因此，在一方面，提供了番茄植物，其包括所述ToBRFV耐受性/抗性表型，其中该植物是双单倍体植物。
本发明的Rug-1抗性基因可以与其他已知的或尚未发现的能够赋予ToBRFV耐受性/抗性表型的基因和/或QTL组合。抗性基因和病毒进化之间存在着不断的进化竞赛。为了降低新病毒种族或新病毒物种进化而破坏由单一抗性QTL和/或抗性基因提供的保护的概率，优选地，植物品种包括多个抗性基因。此外，相较于仅包括单一抗性QTL和/或抗性基因的植物，这样的多个抗性QTL和/或抗性基因可以提供增强的耐受性/抗性表型。因此，在一方面，本发明的番茄植物进一步包括WO 2018/219941 A1和WO 2020/18783A1中记载的11号染色体上的QTL、6号染色体上的QTL和9号染色体上的QTL中的一种或多种。
因此，一方面，本发明的番茄植物进一步包括位于11号染色体上SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:13之间的数量性状基因座QTL11，并且其中所述QTL11当以纯合形式存在时能够赋予ToBRFV耐受性/抗性表型。在本发明的上下文中，发现相较于仅包括Rug-1抗性基因的植物或仅包括纯合形式的QTL11的植物，包括纯合形式的QTL11和Rug-1抗性基因两者的番茄植物的ToBRFV耐受性/抗性表型显示出改进的ToBRFV耐受性/抗性表型。
本文所述的QTL11包括单倍型，该单倍型的特征在于存在本文更详细描述的SNP标记物SNP_1至SNP_15中的一种或多种。因此，在一方面，本发明提供了进一步包括QTL11的番茄植物，其中所述QTL11包括在基因渗入片段中，并且其中所述包括QTL11的基因渗入片段包括一种或多种选自以下的SNP标记物的单倍型：
位于SEQ ID NO:1的第51位核苷酸处或位于包括与SEQ ID NO:1的至少97％的序列同一性的序列的第51位核苷酸处的SNP_01的腺嘌呤；
位于SEQ ID NO:2的第51位核苷酸处或位于包括与SEQ ID NO:2的至少97％的序列同一性的序列的第51位核苷酸处的SNP_02的腺嘌呤；
位于SEQ ID NO:3的第51位核苷酸处或位于包括与SEQ ID NO:3的至少97％的序列同一性的序列的第51位核苷酸处的SNP_03的鸟嘌呤；
位于SEQ ID NO:4的第51位核苷酸处或位于包括与SEQ ID NO:4的至少97％的序列同一性的序列的第51位核苷酸处的SNP_04的腺嘌呤；
位于SEQ ID NO:5的第51位核苷酸处或位于包括与SEQ ID NO:5的至少97％的序列同一性的序列的第51位核苷酸处的SNP_05的腺嘌呤；
位于SEQ ID NO:6的第51位核苷酸处或位于包括与SEQ ID NO:6的至少97％的序列同一性的序列的第51位核苷酸处的SNP_06的鸟嘌呤；
位于SEQ ID NO:7的第51位核苷酸处或位于包括与SEQ ID NO:7的至少97％的序列同一性的序列的第51位核苷酸处的SNP_07的鸟嘌呤；
位于SEQ ID NO:8的第51位核苷酸处或位于包括与SEQ ID NO:8的至少97％的序列同一性的序列的第51位核苷酸处的SNP_08的腺嘌呤；
位于SEQ ID NO:9的第51位核苷酸处或位于包括与SEQ ID NO:9的至少97％的序列同一性的序列的第51位核苷酸处的SNP_09的胸腺嘧啶；
位于SEQ ID NO:10的第51位核苷酸处或位于包括与SEQ ID NO:10的至少97％的序列同一性的序列的第51位核苷酸处的SNP_10的胸腺嘧啶；
位于SEQ ID NO:11的第51位核苷酸处或位于包括与SEQ ID NO:11的至少97％的序列同一性的序列的第51位核苷酸处的SNP_11的腺嘌呤；
位于SEQ ID NO:12的第51位核苷酸处或位于包括与SEQ ID NO:12的至少97％的序列同一性的序列的第51位核苷酸处的SNP_12的胸腺嘧啶；
位于SEQ ID NO:13的第51位核苷酸处或位于包括与SEQ ID NO:13的至少97％的序列同一性的序列的第51位核苷酸处的SNP_13的胸腺嘧啶；
位于SEQ ID NO:14的第51位核苷酸处或位于包括与SEQ ID NO:14的至少97％的序列同一性的序列的第51位核苷酸处的SNP_14的胞嘧啶；和
位于SEQ ID NO:15的第51位核苷酸处或位于包括与SEQ ID NO:15的至少97％的序列同一性的序列的第51位核苷酸处的SNP_15的胸腺嘧啶；
因此，作为QTL11的特征性SNP标记物是：
位于SEQ ID NO:1的第51位核苷酸处或位于包括与SEQ ID NO:1的至少97％(更优选至少98％，甚至更优选至少99％)的序列同一性的序列的第51位核苷酸处的SNP_01的腺嘌呤；
位于SEQ ID NO:2的第51位核苷酸处或位于包括与SEQ ID NO:2的至少97％(更优选至少98％，甚至更优选至少99％)的序列同一性的序列的第51位核苷酸处的SNP_02的腺嘌呤；
位于SEQ ID NO:3的第51位核苷酸处或位于包括与SEQ ID NO:3的至少97％(更优选至少98％，甚至更优选至少99％)的序列同一性的序列的第51位核苷酸处的SNP_03的鸟嘌呤；
位于SEQ ID NO:4的第51位核苷酸处或位于包括与SEQ ID NO:4的至少97％(更优选至少98％，甚至更优选至少99％)的序列同一性的序列的第51位核苷酸处的SNP_04的腺嘌呤；
位于SEQ ID NO:5的第51位核苷酸处或位于包括与SEQ ID NO:5的至少97％(更优选至少98％，甚至更优选至少99％)的序列同一性的序列的第51位核苷酸处的SNP_05的腺嘌呤；
位于SEQ ID NO:6的第51位核苷酸处或位于包括与SEQ ID NO:6的至少97％(更优选至少98％，甚至更优选至少99％)的序列同一性的序列的第51位核苷酸处的SNP_06的鸟嘌呤；
位于SEQ ID NO:7的第51位核苷酸处或位于包括与SEQ ID NO:7的至少97％(更优选至少98％，甚至更优选至少99％)的序列同一性的序列的第51位核苷酸处的SNP_07的鸟嘌呤；
位于SEQ ID NO:8的第51位核苷酸处或位于包括与SEQ ID NO:8的至少97％(更优选至少98％，甚至更优选至少99％)的序列同一性的序列的第51位核苷酸处的SNP_08的腺嘌呤；
位于SEQ ID NO:9的第51位核苷酸处或位于包括与SEQ ID NO:9的至少97％(更优选至少98％，甚至更优选至少99％)的序列同一性的序列的第51位核苷酸处的SNP_09的胸腺嘧啶；
位于SEQ ID NO:10的第51位核苷酸处或位于包括与SEQ ID NO:10的至少97％(更优选至少98％，甚至更优选至少99％)的序列同一性的序列的第51位核苷酸处的SNP_10的胸腺嘧啶；
位于SEQ ID NO:11的第51位核苷酸处或位于包括与SEQ ID NO:11的至少97％(更优选至少98％，甚至更优选至少99％)的序列同一性的序列的第51位核苷酸处的SNP_11的腺嘌呤；
位于SEQ ID NO:12的第51位核苷酸处或位于包括与SEQ ID NO:12的至少97％(更优选至少98％，甚至更优选至少99％)的序列同一性的序列的第51位核苷酸处的SNP_12的胸腺嘧啶；
位于SEQ ID NO:13的第51位核苷酸处或位于包括与SEQ ID NO:13的至少97％(更优选至少98％，甚至更优选至少99％)的序列同一性的序列的第51位核苷酸处的SNP_13的胸腺嘧啶；
位于SEQ ID NO:14的第51位核苷酸处或位于包括与SEQ ID NO:14的至少97％(更优选至少98％，甚至更优选至少99％)的序列同一性的序列的第51位核苷酸处的SNP_14的胞嘧啶；
位于SEQ ID NO:15的第51位核苷酸处或位于包括与SEQ ID NO:15的至少97％(更优选至少98％，甚至更优选至少99％)的序列同一性的序列的第51位核苷酸处的SNP_15的胸腺嘧啶。优选地，本文所述的QTL11包括单倍型，该单倍型的特征在于存在本文所述的SNP标记物SNP_1至SNP_15中的2个或更多个、更优选本文所述的SNP标记物SNP_1至SNP_15中的3个或更多个、甚至更优选本文所述的SNP标记物SNP_1至SNP_15中的4个或更多个，并且特别优选本文所述的SNP标记物SNP_1至SNP_15中的5个或更多个。
根据本发明的植物进一步包括本文所述的QTL11，因此包括至少一个拷贝的QTL11。因此，这样的植物可能是QTL11杂合的或QTL11纯合的。本文所述的QTL11是隐性的。这意味着至少一个拷贝的QTL11需要被包括在番茄植物基因组中包括的两条11号染色体上，以实现所述QTL11赋予的ToBRFV耐受性/抗性表型。在一方面，本发明提供了一种番茄植物，其中QTL11以纯合形式存在。这种其中QTL11以纯合形式存在的番茄植物可以使用常规方法容易地从其中QTL11以杂合形式存在的番茄植物中获得，例如自交其中QTL11以杂合形式存在的番茄植物，任选地随后选择包括纯合形式的QTL11的后代。
因此，当以纯合形式存在于番茄植物的基因组中时，根据本发明的抗性QTL11优选地赋予ToBRFV耐受性/抗性表型。包括本文所述的QTL11的番茄种子的代表性样品已被保藏，并且来自保藏物或保藏物的后代，本发明的QTL11可以容易地转移到任何其他植物中，所述植物可以与由保藏的种子生长出的番茄植物或其后代杂交。或者，可以鉴定包括相同QTL11的其他供体，例如包括与相同的QTL11的SNP单倍型。在一方面，本发明提供了一种番茄植物，其中QTL11存在于、或可获自、或获自或包括于称为PAR02001的番茄植物的基因组中，其代表性数量的种子已经以保藏号NCIMB 43590保藏。
在一方面，本发明提供了本文所述的番茄植物，其中所述植物进一步包括Tm-1抗性基因。在本发明的上下文中，发现包括Rug-1抗性基因和Tm-1抗性基因两者的番茄植物的ToBRFV耐受性/抗性表型相较于仅包括Rug-1抗性基因的植物显示出改进的ToBRFV耐受性/抗性表型。
Tm-1抗性基因记载于Ishibashi et al.(2007)PNAS 104(34)13833–13838并且已知编码80kDa的多肽，其起到病毒RNA复制的抑制剂的作用。因此，Tm-1抗性基因编码包括与SEQ ID NO:21的至少98％氨基酸序列同一性的蛋白质。
因此，本发明提供的植物可用于生产果实。因此，本发明提供了本文提供的番茄种的植物作为食用作物的用途。特别地，由本发明的植物生产的果实可以有利地用作食用作物，因为这些果实不太可能表现出通常在ToBRFV感染后形成的疾病症状。
本发明提供的植物可用于生产繁殖材料。这种繁殖材料包括适合于有性繁殖和/或由有性繁殖产生的繁殖材料，例如花粉和种子。这种繁殖材料包括适合于无性或营养繁殖和/或由无性或营养繁殖生产的繁殖材料，包括但不限于插枝、嫁接物、块茎、细胞培养物和组织培养物。因此，本发明进一步提供了本文提供的番茄种的植物作为繁殖材料来源的用途。
种子
在一方面，本发明提供了由根据本发明的番茄植物生产的种子，其中所述种子包括本文所述的Rug-1抗性基因。因此，本发明提供了由根据本发明的杂种番茄植物生产的种子，其中所述种子在其基因组中包括至少一个拷贝的Rug-1抗性基因，其中Rug-1抗性基因赋予ToBRFV耐受性/抗性表型并且其中Rug-1抗性基因编码包括与SEQ ID NO:16的至少95％(例如更优选96％、97％、98％、98.3％、98.7％、99.0％或99.3％或最优选99.7％)的氨基酸序列同一性的蛋白质。
在一方面，本发明提供种子，由其可以生长出根据本发明的杂种番茄植物。因此，本发明提供种子，由其可以生长出在其基因组中包括至少一个拷贝的Rug-1抗性基因的杂种番茄植物，其中Rug-1抗性基因赋予ToBRFV耐受性/抗性表型并且其中Rug-1抗性基因编码包括与SEQ ID NO:16的至少95％(例如更优选96％、97％、98％、98.3％、98.7％、99.0％或99.3％或最优选99.7％)的氨基酸序列同一性的蛋白质。
此外，本发明提供了多种根据本发明的种子。由于本文所述的Rug-1抗性基因的存在，本发明的种子可以与其他种子区分开，无论是在表型上(基于本发明的ToBRFV抗性表型)和/或使用分子方法检测细胞或组织中是否存在Rug-1抗性基因，例如检测本发明的Rug-1抗性基因的分子基因分型方法或测序。种子包括例如由本发明的植物生产的种子，其在自花授粉和任选地选择包括一个或两个拷贝的突变等位基因(例如通过非破坏性种子取样方法和分析Rug-1抗性基因的存在)后是突变等位基因杂合的，或异花授粉后生产的种子，例如用来自另一种番茄(tomato)植物的花粉(优选地来自另一种番茄(Solanumlycopersicum)植物的花粉)对本发明的植物授粉，或用本发明的植物的花粉对另一种番茄植物授粉。
本发明进一步提供了从本文所述的生产植物的方法获得的种子。
在一方面，多个种子被包装到一个容器中(例如，袋子、纸箱、罐子等)。容器可以是任何尺寸。种子可以在包装之前被造粒(pellet)(以形成丸粒(pill或pellet))和/或用各种化合物处理，包括种子包衣。
植物部分和营养繁殖
在另一方面，本文提供了获自(可获自)本发明的植物的植物部分，以及包括所述植物部分的容器或包装。
特别地，本发明提供了根据本发明的杂种番茄植物的植物细胞、组织或植物部分或根据本发明的种子，其包括本文所述的Rug-1抗性基因，优选地其中所述部分选自果实、叶片、花药、雌蕊、茎、叶柄、根、胚珠、花粉、原生质体、组织、种子、花、子叶、胚轴、胚和细胞。本文描述的植物部分的各个发展阶段都包括在本发明中。
在另一方面，植物部分是植物细胞。在又一方面，植物部分是非可再生细胞或可再生细胞。在另一方面，植物细胞是体细胞。
非可再生细胞是不能通过体外培养再生成整株植物的细胞。非可再生细胞可以位于本发明的植物或植物部分(例如叶片)中。非可再生细胞可以是种子中的细胞，或所述种子的种皮中的细胞。成熟的植物器官(包括成熟的叶片、成熟的茎或成熟的根)含有至少一个非可再生细胞。
在另一方面，植物细胞是生殖细胞，例如胚珠或作为花粉一部分的细胞。在一方面，花粉细胞是营养(非生殖)细胞或精细胞(Tiezzi,Electron Microsc.Review,1991)。这种生殖细胞是单倍体。当其再生为整株植物时，其包括起始植物的单倍体基因组。如果发生染色体加倍(例如通过化学处理)，则可以再生出双单倍体植物。在一方面，包括Rug-1抗性基因的本发明的植物是根据本发明的单倍体或双单倍体番茄植物。
此外，提供了本发明的番茄植物的体外细胞培养物或组织培养物，其中细胞培养物或组织培养物来源于本文所述的植物部分，例如但不限于叶片、花粉、胚、子叶、胚轴、愈伤组织、根、根尖、花药、花、种子或茎，或它们中任何一种的部分，或分生细胞、体细胞或生殖细胞。
本发明还提供了一种营养繁殖的植物，其中所述植物是从根据本发明的植物部分繁殖的。
此外，提供了分离的细胞、体外细胞培养物和组织培养物、原生质体培养物、植物部分、收获的材料(例如收获的番茄果实)、花粉、子房、花、种子、雄蕊、花部分等，在每个细胞中包括至少一个拷贝的本发明的Rug-1抗性基因。因此，当所述细胞或组织被再生或生长成完整的番茄植物时，该植物包括能够赋予ToBRFV耐受性/抗性表型的Rug-1抗性基因。
因此，还提供了本发明植物的细胞或组织的体外细胞培养物和/或组织培养物。细胞培养物或组织培养物可以用生芽培养基和/或生根培养基处理以再生为番茄植物。
此外，根据本发明的植物的营养繁殖或克隆繁殖也包括在本文中。存在许多不同的营养繁殖技术。插枝(茎节、芽尖、茎等)可以例如用于如上所述的体外培养。此外，还存在其他营养繁殖技术并且可以使用，例如嫁接或空中压条。在空中压条中，允许一根茎在它仍然附着在亲本植物上时生出根，一旦已经生出足够的根，将克隆植物与亲本分离。
因此，在一方面，提供了一种方法，包括：(a)获得本发明的植物的一部分(例如细胞或组织，例如插枝)，
(b)营养繁殖所述植物部分以从该植物部分生产相同的植物。
因此，本发明的植物的营养植物部分用于克隆/营养繁殖的用途也是本发明的一方面。在一方面，提供了用于营养繁殖包括本文所述的Rug-1抗性基因的本发明的杂种番茄植物的方法。此外，提供了包括本文所述的Rug-1抗性基因的营养繁殖植物。
在另一方面，包括根据本发明的Rug-1抗性基因的本发明的植物是通过体细胞胚胎发生技术进行繁殖。
还提供了从任何上述植物部分再生的或从上述细胞或组织培养物再生的杂种番茄植物，所述再生植物在其基因组中包括至少一个拷贝的本文所述的Rug-1抗性基因。这种植物也可以称为本发明的植物的营养繁殖。
本发明还涉及包括本文所述植物部分或由本文所述植物部分组成的食品或饲料产品。食品或饲料产品可以是新鲜的或加工过的，例如罐装、蒸煮、煮熟、油炸、烫洗和/或冷冻(canned,steamed,boiled,fried,blanched and/or frozen)等。实例是三明治、沙拉、果汁、酱汁、水果酱、番茄酱或包括本发明植物的果实或果实的一部分的其他产品。
鉴定、选择和生产植物或植物部分的方法
本发明进一步提供了其中使用和/或获得包括本发明的Rug-1抗性基因的番茄植物的方法。
因此，本发明提供了一种用于鉴定和/或选择番茄植物或植物部分的方法，包括确定所述植物或植物部分是否在其基因组中包括本文所述的Rug-1抗性基因。因此，本发明提供了用于鉴定和/或选择番茄植物或植物部分的方法，包括确定所述植物或植物部分是否在其基因组中包括至少一个拷贝的Rug-1抗性基因，其中Rug-1抗性基因赋予ToBRFV耐受性/抗性表型，并且其中Rug-1抗性基因编码包括与SEQ ID NO:16的至少95％(例如更优选96％、97％、98％、98.3％、98.7％、99.0％或99.3％或最优选99.7％)的氨基酸序列同一性的蛋白质。所述方法可用于鉴定和/或选择任何番茄植物或植物部分，包括但不限于近交番茄植物或植物部分、杂种番茄植物或植物部分，以及双单倍体番茄植物或植物部分。优选地，本发明提供了用于鉴定和/或选择杂种番茄植物或植物部分的方法，包括确定所述植物或植物部分是否在其基因组中包括至少一个拷贝的Rug-1抗性基因，其中Rug-1抗性基因赋予ToBRFV耐受性/抗性表型，并且其中Rug-1抗性基因编码包括与SEQ ID NO:16的至少95％(例如更优选96％、97％、98％、98.3％、98.7％、99.0％或99.3％或最优选99.7％)的氨基酸序列同一性的蛋白质。该方法可以包括使用已知方法在DNA、RNA(或cDNA)或蛋白质水平上筛选，以检测根据本发明的Rug-1抗性基因的存在。有许多方法用于检测包括Rug-1抗性基因的渗入片段的存在。例如，如果包括目的基因(如Rug-1抗性基因)或目的QTL(如QTL11)的植物与不包括所述目的基因或目的QTL的植物之间存在单个核苷酸差异(单核苷酸多态性，SNP)，SNP基因分型检测可用于检测植物或植物部分或细胞是否在其基因组中包括所述目的基因或目的QTL。例如，SNP可以使用KASP测定(参见万维网kpbioscience.co.uk)或其他SNP基因分型测定容易地检测出。为了开发KASP测定，例如可以选择SNP上游70个碱基对和下游70个碱基对，并可以设计两种等位基因特异性正向引物和一种等位基因特异性反向引物。KASP测定方法参见例如Allen et al.2011,Plant Biotechnology J.9,1086-1099,特别是p097-1098。同样可以使用其他基因分型测定。例如，同样可使用TaqMan SNP基因分型测定、高分辨率熔解(HRM)测定、SNP基因分型测定(例如Fluidigm、Illumina等)或DNA测序。
分子标记物也可用于辅助鉴定含有本发明的Rug-1抗性基因的植物(或从其获得的植物部分或核酸)。例如，人们可以开发一种或多种与Rug-1抗性基因在遗传上(并且优选地也在物理上)紧密连锁的合适的分子标记物。优选地基于本文公开的Rug-1基因的编码序列选择合适的分子标记物。例如，任何表征Rug-1抗性基因的SNP(例如通过区分Rug-1抗性基因和Tm-1抗性基因)可以用作分子标记物，用于鉴定含有本发明的Rug-1抗性基因的植物(或从其获得的植物部分或核酸)。这样的SNP标记物可以通过Rug-1抗性基因(例如SEQ IDNO:17)与Tm-1抗性基因(例如SEQ ID NO:22)的编码序列之间的核苷酸序列比对获得。
可以使用本领域公知的方法开发合适的分子标记物，例如通过将根据本发明的番茄植物(优选地具有ToBRFV耐受性/抗性表型)与对照植物(优选同基因植物)进行杂交，并从该杂交中开发分离种群(例如F2或回交种群)。然后可以如本文所述对分离种群的ToBRFV耐受性/抗性表型进行表型分型，并使用例如分子标记物(例如SNP(单核苷酸多态性)、AFLP(扩增片段长度多态性，参见例如EP 534 858)或者其他)进行基因分型，并且通过软件分析，可以鉴定在分离种群中与本发明的ToBRFV耐受性/抗性表型共分离的分子标记物，并且可以鉴定它们的顺序及距目的QTL基因座(或因果基因)的遗传距离(厘摩距离，cM)。与目的基因或QTL紧密连锁的分子标记物(例如在5cM或更小的距离处的标记物)可用于检测和/或选择包括或保留目的基因或QTL(例如在渗入片段中)的植物(例如本发明的植物或本发明的植物的后代)或植物部分。这种紧密连锁的分子标记物可以在育种计划中替代表型选择(或与表型选择一起使用)，即在标记物辅助选择(MAS)中。优选地，在MAS中使用连锁标记物。更优选地，在MAS中使用侧翼标记物，即在目的QTL的基因座的任一侧的一个标记物。
对检测根据本发明的Rug-1抗性基因特别有用的SNP标记物可选自：
位于SEQ ID NO:18的第51位核苷酸处或位于包括与SEQ ID NO:18的至少97％(更优选至少98％，甚至更优选至少99％)的同一性的序列的第51位核苷酸处的SNP_16的鸟嘌呤；
位于SEQ ID NO:19的第51位核苷酸处或位于包括与SEQ ID NO:19的至少97％(更优选至少98％，甚至更优选至少99％)的同一性的序列的第51位核苷酸处的SNP_17的胸腺嘧啶；以及
位于SEQ ID NO:20的第51位核苷酸处或位于包括与SEQ ID NO:20的至少97％(更优选至少98％，甚至更优选至少99％)的同一性的序列的第51位核苷酸处的SNP_18的胸腺嘧啶。
本发明进一步提供了对本文所述的Rug-1抗性基因特异的遗传标记物，用于选择具有增强的ToBRFV耐受性/抗性表型的番茄植物的用途。优选地，所述Rug-1抗性基因的特异性遗传标记物是本文所述的用于鉴定具有ToBRFV耐受性/抗性表型的番茄植物的SNP标记物SNP_16至SNP_18中的一种或多种，其中所述SNP_16至SNP_18是：
位于SEQ ID NO:18的第51位核苷酸处或位于包括与SEQ ID NO:18的至少97％(更优选至少98％，甚至更优选至少99％)的同一性的序列的第51位核苷酸处的SNP_16的鸟嘌呤；
位于SEQ ID NO:19的第51位核苷酸处或位于包括与SEQ ID NO:19的至少97％(更优选至少98％，甚至更优选至少99％)的同一性的序列的第51位核苷酸处的SNP_17的胸腺嘧啶；以及
位于SEQ ID NO:20的第51位核苷酸处或位于包括与SEQ ID NO:20的至少97％(更优选至少98％，甚至更优选至少99％)的同一性的序列的第51位核苷酸处的SNP_18的胸腺嘧啶。
本发明进一步提供了编码与SEQ ID NO:16具有至少95％的氨基酸序列同一性的蛋白质的核酸用于培育具有ToBRFV耐受性/抗性表型的番茄植物的用途，优选地与SEQ IDNO:16的96％、97％、98％、98.3％、98.7％、99.0％或99.3％或更优选地99.7％的序列同一性。本发明进一步提供了编码与SEQ ID NO:17具有至少95％的核苷酸序列同一性的蛋白质的核酸用于培育具有ToBRFV耐受性/抗性表型的番茄植物的用途，优选地与SEQ ID NO:17的96％、97％、98％、98.3％、98.7％、99.0％或99.3％或更优选地99.7％的序列同一性。
本发明进一步提供了本文所述的SNP标记物SNP_16至SNP_18中的一种或多种用于培育具有ToBRFV耐受性/抗性表型的番茄植物的用途，其中所述SNP标记物SNP_16至SNP_18是：
位于SEQ ID NO:18的第51位核苷酸处或位于包括与SEQ ID NO:18的至少97％(更优选至少98％，甚至更优选至少99％)的同一性的序列的第51位核苷酸处的SNP_16的鸟嘌呤；
位于SEQ ID NO:19的第51位核苷酸处或位于包括与SEQ ID NO:19的至少97％(更优选至少98％，甚至更优选至少99％)的同一性的序列的第51位核苷酸处的SNP_17的胸腺嘧啶；以及
位于SEQ ID NO:20的第51位核苷酸处或位于包括与SEQ ID NO:20的至少97％(更优选至少98％，甚至更优选至少99％)的同一性的序列的第51位核苷酸处的SNP_18的胸腺嘧啶。
本发明进一步提供了一种用于生产具有ToBRFV耐受性/抗性表型的番茄植物的方法，所述方法包括以下步骤：(i)将第一种番茄植物和第二种植物杂交，其中第一种番茄植物在其基因组中包括本文所述的Rug-1抗性基因；(ii)任选地从(i)的杂交中收获种子并选择在其基因组中包括Rug-1抗性基因的种子。因此，本发明进一步提供了用于生产具有ToBRFV耐受性/抗性表型的番茄植物的方法，所述方法包括以下步骤：(i)将第一种番茄植物和第二种植物杂交，其中第一种番茄植物在其基因组中包括Rug-1抗性基因，其中Rug-1抗性基因赋予ToBRFV耐受性/抗性表型并且其中Rug-1抗性基因编码包括与SEQ ID NO:16的至少95％(例如更优选96％、97％、98％、98.3％、98.7％、99.0％或99.3％或最优选99.7％)的氨基酸序列同一性的蛋白质；(ii)任选地从(i)的杂交中收获种子并选择在其基因组中包括Rug-1抗性基因的种子。所述方法可用于生产任何番茄植物，包括但不限于近交番茄植物、杂种番茄植物和双单倍体番茄植物。优选地，本发明提供了用于生产具有ToBRFV耐受性/抗性表型的近交番茄植物的方法，所述方法包括以下步骤：(i)将第一种番茄植物和第二种植物杂交，其中第一种番茄植物在其基因组中包括Rug-1抗性基因，其中Rug-1抗性基因赋予ToBRFV耐受性/抗性表型并且其中Rug-1抗性基因编码包括与SEQ ID NO:16的至少95％(例如更优选96％、97％、98％、98.3％、98.7％、99.0％或99.3％或最优选99.7％)氨基酸序列同一性的蛋白质；(ii)任选地从(i)的杂交中收获种子并选择在其基因组中包括Rug-1抗性基因的种子。
优选地，本文提供的生产番茄植物的方法的步骤(i)中的第一种番茄植物和第二种番茄植物都是根据本发明的植物。更优选地，本文提供的生产番茄植物的方法的步骤(i)中的第一种番茄植物和第二种番茄植物都是根据本发明的Rug-1抗性基因纯合的植物。
本发明进一步提供了一种植物，优选杂种植物，其生长自通过鉴定和/或选择包括本文所述的Rug-1抗性基因的番茄物种的植物或植物部分的方法获得的种子。本发明进一步提供了一种植物，优选杂种植物，其生长自通过生产在其基因组中包括至少一个拷贝的本文定义的Rug-1抗性基因的番茄植物的方法获得的种子。
本发明进一步提供了用于增强番茄植物的ToBRFV耐受性/抗性表型的方法，所述方法包括将本文所述的Rug-1抗性基因渗入所述番茄植物中。因此，本发明提供了用于增强番茄植物的ToBRFV耐受性/抗性表型的方法，所述方法包括将Rug-1抗性基因渗入所述番茄植物中，其中Rug-1抗性基因赋予ToBRFV耐受性/抗性表型，并且其中Rug-1抗性基因编码包括与SEQ ID NO:16的至少95％(例如更优选96％、97％、98％、98.3％、98.7％、99.0％或99.3％或最优选99.7％)的氨基酸序列同一性的蛋白质。所述方法可用于增强任何番茄植物的ToBRFV耐受性/抗性表型，包括但不限于近交番茄植物、杂种番茄植物和双单倍体番茄植物。优选地，本发明提供了用于增强杂种番茄植物的ToBRFV耐受性/抗性表型的方法，所述方法包括将Rug-1抗性基因渗入所述番茄植物中，其中Rug-1抗性基因赋予ToBRFV耐受性/抗性表型并且其中Rug-1抗性基因编码包括与SEQ ID NO:16的至少95％(例如更优选96％、97％、98％、98.3％、98.7％、99.0％或99.3％或最优选99.7％)的氨基酸序列同一性的蛋白质。
本发明进一步提供了本文所述的Rug-1抗性基因用于在番茄植物中增强ToBRFV耐受性/抗性表型中的用途。因此，本发明提供了本文所述的Rug-1抗性基因用于在番茄植物中增强ToBRFV耐受性/抗性表型的用途，其中Rug-1抗性基因赋予ToBRFV耐受性/抗性表型并且其中Rug-1抗性基因编码包括与所述番茄植物的SEQ ID NO:16的至少95％(例如更优选96％、97％、98％、98.3％、98.7％、99.0％或99.3％或最优选99.7％)的氨基酸序列同一性的蛋白质。所述用途可以用于增强任何番茄植物的ToBRFV耐受性/抗性表型，包括但不限于近交番茄植物、杂种番茄植物和双单倍体番茄植物。优选地，本发明提供了Rug-1抗性基用于在番茄植物中增强ToBRFV耐受性/抗性表型的用途，其中Rug-1抗性基因赋予ToBRFV耐受性/抗性表型并且其中Rug-1抗性基因编码包括与所述番茄植物的SEQ ID NO:16的至少95％(例如更优选96％、97％、98％、98.3％、98.7％、99.0％或99.3％或最优选99.7％)的氨基酸序列同一性的蛋白质。
在一方面，根据本发明的植物、植物部分和细胞并非排他地通过基本生物学方法获得。特别地，根据本发明的植物、植物部分和细胞并非排他地通过如Rule 28(2)EPC所定义的基本生物学方法获得。
本发明的其他实施方案涉及以下实施方案，这些实施方案不应被孤立地看待，而是可以与本文记载的任何其他实施方案组合。优选地，下文记载的一个或多个细胞是如上文定义的非可再生细胞。或者，下文记载的一个或多个细胞是非繁殖细胞。如本文所使用的，术语“非繁殖植物细胞”是不能通过光合作用由无机物质(如水、二氧化碳和矿物盐等)合成碳水化合物和蛋白质来维持其生命的植物细胞。
在一个实施方案中，本发明提供了在其基因组中包括至少一个拷贝的Rug-1抗性基因的杂种番茄植物的细胞，其中所述Rug-1抗性基因赋予(即能够赋予)ToBRFV耐受性/抗性表型并且其中所述Rug-1抗性基因编码包括与SEQ ID NO:16的至少95％的氨基酸序列同一性的蛋白质。
根据前述实施方案的细胞，其中Rug-1抗性基因以纯合形式存在。
根据前述实施方案的细胞，其中Rug-1抗性基因存在于、或可获自、或获自、或包括于称为PAR02001的番茄植物的基因组中，其代表性数量的种子已经以保藏号NCIMB 43590保藏。
根据前述实施方案的细胞，其中所述细胞是番茄植物的细胞，其进一步包括位于11号染色体上SEQ ID NO:1与SEQ ID NO:13之间的的数量性状基因座QTL11，并且其中所述QTL11当以纯合形式存在时能够赋予ToBRFV耐受性/抗性表型。
根据前述实施方案的细胞，其中QTL11被包括在基因渗入片段中，并且其中所述包括QTL11的基因渗入片段包括一种或多种选自以下的SNP标记物的单倍型：
位于SEQ ID NO:1的第51位核苷酸处或位于包括与SEQ ID NO:1的至少97％的序列同一性的序列的第51位核苷酸处的SNP_01的腺嘌呤；
位于SEQ ID NO:2的第51位核苷酸处或位于包括与SEQ ID NO:2的至少97％的序列同一性的序列的第51位核苷酸处的SNP_02的腺嘌呤；
位于SEQ ID NO:3的第51位核苷酸处或位于包括与SEQ ID NO:3的至少97％的序列同一性的序列的第51位核苷酸处的SNP_03的鸟嘌呤；
位于SEQ ID NO:4的第51位核苷酸处或位于包括与SEQ ID NO:4的至少97％的序列同一性的序列的第51位核苷酸处的SNP_04的腺嘌呤；
位于SEQ ID NO:5的第51位核苷酸处或位于包括与SEQ ID NO:5的至少97％的序列同一性的序列的第51位核苷酸处的SNP_05的腺嘌呤；
位于SEQ ID NO:6的第51位核苷酸处或位于包括与SEQ ID NO:6的至少97％的序列同一性的序列的第51位核苷酸处的SNP_06的鸟嘌呤；
位于SEQ ID NO:7的第51位核苷酸处或位于包括与SEQ ID NO:7的至少97％的序列同一性的序列的第51位核苷酸处的SNP_07的鸟嘌呤；
位于SEQ ID NO:8的第51位核苷酸处或位于包括与SEQ ID NO:8的至少97％的序列同一性的序列的第51位核苷酸处的SNP_08的腺嘌呤；
位于SEQ ID NO:9的第51位核苷酸处或位于包括与SEQ ID NO:9的至少97％的序列同一性的序列的第51位核苷酸处的SNP_09的胸腺嘧啶；
位于SEQ ID NO:10的第51位核苷酸处或位于包括与SEQ ID NO:10的至少97％的序列同一性的序列第51位核苷酸处的的SNP_10的胸腺嘧啶；
位于SEQ ID NO:11的第51位核苷酸处或位于包括与SEQ ID NO:11的至少97％的序列同一性的序列第51位核苷酸处的的SNP_11的腺嘌呤；
位于SEQ ID NO:12的第51位核苷酸处或位于包括与SEQ ID NO:12的至少97％的序列同一性的序列第51位核苷酸处的的SNP_12的胸腺嘧啶；
位于SEQ ID NO:13的第51位核苷酸处或位于包括与SEQ ID NO:13的至少97％的序列同一性的序列第51位核苷酸处的的SNP_13的胸腺嘧啶；
位于SEQ ID NO:14的第51位核苷酸处或位于包括与SEQ ID NO:14的至少97％的序列同一性的序列第51位核苷酸处的的SNP_14的胞嘧啶；
位于SEQ ID NO:15的第51位核苷酸处或位于包括与SEQ ID NO:15的至少97％的序列同一性的序列第51位核苷酸处的的SNP_15的胸腺嘧啶；
根据前述实施方案的细胞，其中QTL11以纯合形式存在。
根据前述实施方案的细胞，其中QTL11存在于、或可获自、或获自或包括于称为PAR02001的番茄植物的基因组中，其代表性数量的种子已经以保藏号NCIMB 43590保藏。
根据前述实施方案的细胞，其中所述细胞是进一步包括Tm-1抗性基因的番茄植物的细胞。
根据前述实施方案的细胞，其中所述细胞是单交F1杂种番茄植物的细胞。
衍生自在其基因组中包括至少一个拷贝的Rug-1抗性基因的杂种番茄植物的单倍体植物或双单倍体细胞，其中所述Rug-1抗性基因赋予(即能够赋予)ToBRFV耐受性/抗性表型并且其中所述Rug-1抗性基因编码包括与SEQ ID NO:16的至少95％的氨基酸序列同一性的蛋白质。
种子保藏
名为PAR02001的番茄系的种子的代表性样品，其包括含有纯合形式的Rug-1抗性基因的基因渗入片段、含有纯合形式的QTL11和杂合形式的Tm-1抗性基因的基因渗入片段，由Nunhems B.V.根据布达佩斯条约，按照Expert Solution(EPC 2000,Rule 32(1))在2020年3月20日保藏在国家工业、食品和海洋微生物保藏中心(NCIMB Ltd.)(英国苏格兰，阿伯丁郡AB21 9YA，巴克斯本，克莱伯斯通区，弗格森大厦)。种子被给予以下保藏号NCIMB43590(番茄PAR02001)。
申请人要求根据Rule EPC 32(1)或具有类似条款和规章的国家或条约的相关法规，所述生物材料及其衍生的任何材料的样本只向指定的专业人员提供，直到专利授权公告，或提交之日起20年(如果所述申请被驳回、撤回或视为撤回)。
在本申请未决期间，由美国专利局主任确定的有权根据要求获取该保藏物的人将可以获取该保藏物。受37C.F.R.§1.808(b)的制约，在专利授权时，保藏者对所保藏材料的公众可获得性提出的所有限制都将被不可撤销地去除。保藏物将被维持30年时间，或最近一次请求后的5年，或被维持到专利的有效期，以较长时间为准，如果在此期间所述保藏物一旦无法存活，则要将其替换。申请人不会放弃根据本专利对本申请授予的或根据《植物品种保护法》(7USC 2321et seq.)授予的任何权利。
以下非限制性实施例描述了可以如何获得根据本发明的植物，其包括Rug-1抗性基因并且/或者QTL11和/或Tm-1抗性基因。除非在实施例中另有说明，所有重组DNA技术均按照标准方案进行，标准方案记载于Sambrook et al.(1989)Molecular Cloning:ALaboratory Manual,Second Edition,Cold Spring Harbor Laboratory Press,和Sambrook and Russell(2001)Molecular Cloning:A Laboratory Manual,ThirdEdition,Cold Spring Harbor Laboratory Press,NY；和Ausubel et al.(1994)CurrentProtocols in Molecular Biology,Current Protocols,USA的第1卷和第2卷中。植物分子工作的标准材料和方法记载于由BIOS Scientific Publications Ltd(UK)和BlackwellScientific Publications,UK联合出版的Plant Molecular Biology Labfax(1993)byR.D.D.Croy。标准育种方法记载于
‘Principles of Plant breeding’,Second Edition,Robert W.Allard(ISBN0-471-02309-4)。
实施例
实施例1
抗病性测试
植物在25-20℃、70％的湿度、16/8小时光照/黑暗周期下在生长室中的泥炭和蛭石混合物(比例5:1)中生长，直到从子叶到第一叶期(播种后15天)。每个基因型接种12株植物(两个地块，每个地块6株植物，每株植物两个重复且完全随机化)。为了检测接种和筛选质量，每90株植物包括六项敏感检测。每个基因型使用三株植物作为模拟物(mock)。
对于ToBFRV接种物制备，从库存中取出用WO2017/012951A1中所记载的ToBFRV感染的并且以冷冻叶片形式保存在-80℃下的叶片。使用100ml磷酸盐缓冲液0.03M加保护剂(EDTA 1ml/100ml、二乙基氨基甲酸(DECA)1ml/100ml、巯基乙酸钠1ml/100ml)研磨10g冷冻的ToBFRV感染的叶片。叶片表面覆盖有硅藻土粉末。将棉头拭子浸入植物汁液(充满ToBFRV颗粒)中，然后轻轻擦拭叶片。对所有叶片重复该过程。让汁液在叶片表面干燥，随后用自来水冲洗植物。接种的番茄植株在25°-20℃，16/8小时光照/黑暗周期下在生长室中培养。接种后3/4天后，向植物提供铁(1g/L)。一周后，使用20-20-20肥料(氮(20％)、磷(20％)和钾(20％))(1g/L)。这种肥料施两次，间隔一周。
接种后15天时，接种的植物已准备好用于评估。通常，两次评估已足够，其中第二次评估是在第一次评估后两周时进行。检测每株植物中是否存在ToBFRV感染的症状。
使用等级1-9对单个植物进行评分，其中1代表严重的花叶病和叶片扭曲/变形，9代表完全没有症状(无症状)。
表1：ToBFRV抗性分类
| 抗性水平 | 描述 |
| 1 | 严重的花叶病和叶片扭曲/变形 |
| 2 | 叶片扭曲和变形 |
| 3 | 更严重的花叶病 |
| 4 | 轻度花叶病和叶片卷曲/扭曲 |
| 6 | 存在轻度花叶病 |
| 9 | 无症状 |
图1提供了基于目测评估和根据表1的ToBFRV抗性分类的SOURCE01的抗病性测试结果。完全易感的番茄品种“Bonny Best”用作阳性对照。未接种ToBFRV接种物的番茄植株用作阴性对照。
除了基于对个体植物的目测评估的ToBFRV抗性测试外，还可以使用ELISA测定测试ToBFRV抗性。根据制造商的说明，使用Agdia,Inc.的烟草花叶病毒ELISA完整试剂盒(PSA57400/0288)进行ELISA测定。简而言之，该测试使用涂有抗体的96孔微量滴定板，该抗体检测来自烟草花叶病毒群的多种病毒(但并非全部)。组织样品(例如叶片组织、种子等)在提取缓冲液中研磨并稀释。然后将样品连同提供的对照(阳性对照、阴性对照和仅缓冲液)一起上样到微量滴定孔中并培育。培育后，洗涤板并将新制备的碱性磷酸酶缀合物分配到孔中，然后再次培育。再次洗涤板并将PNP底物添加到每个孔中，然后再次培育。通过肉眼和/或使用读板器在405nm处检查结果。有色孔为对病毒呈阳性反应。仅当阳性对照有色且阴性对照几乎透明且仅含缓冲液的孔无色时，测试结果才有效。图1提供了基于SOURCE01、完全易感阳性对照品种“Bonny Best”和未接种阴性对照的ELISA测定的抗病性测试的结果。
此外，ToBFRV抗性测试可以基于RT-PCT测定。使用国际种子联合会出版的文件“Detection of Infectious Tomato brown rugose fruit virus(ToBRFV)in Tomato andPepper Seed(version 1.4,March 2020)”中记载的方法进行RT-PCT测定，使用其中第4页上记载的引物CaTa28和CSP1325。基于SOURCE01、完全易感阳性对照品种“Bonny Best”和未接种阴性对照的RT-PCR测定的抗病性测试结果在图1中提供。
实施例2
导致鉴定出Rug-1抗性基因的SOURCE01的QTL定位
开发了三个种群，其中SOURCE01作为供体和三个良种系。保藏系PAR02001是通过SOURCE01与用于定位种群的敏感良种系之一的杂交获得。
将这些种群的每个种群的300株植物在气候室中用ToBRFV进行测试。播种后14天时进行植物接种。第一次读数是在14dpi(接种后天数)时完成，第二次读数是在28dpi时完成，第三次读数是在36dpi时完成，ELISA测试是在36-40dpi时完成。
定位是单独在每个种群中并针对每个dpi读数进行的。对于每个种群，选择一组最少100个标记物并在300个F2个体中的每一个中运行。舍弃单态标记物，并使用JoinMap软件包中的最大似然定位函数独立地计算每个种群的遗传连锁图。将所得到的图谱与评估1、评估2和评估3的结果组合使用，使用Hailey-Knott回归法以及R/QTL软件包中的多重插补法识别数量性状基因座(QTL)。由于在所有种群中发现的QTL均位于相同的位置，因此将所有种群的数据合并。再次使用Hailey-Knott回归法和R/QTL软件包中的多重插补法鉴定数量性状位点(QTL)。在此数据集上重复定位以获得更有力的结果。在2号和11号染色体上发现了两个具有高LOD值的QTL。在所有dpi读数中都发现了这两个QTL，它们具有不同的LOD分数；参见图2。
每个定位种群和组合种群数据集的剩余区间在图3中示出。99％置信区间(LOD 3下降)中存在的标记物带有下划线。评估3和组合数据集的剩余物理区间为28.7Mbps。额外的标记物没有减少这个区间，因此开启了重组精细定位。这种精细定位的结果在图3中示出。
从图3中提供的数据可以进一步得出结论，抗性赋予区间仍然与已知Tm-1抗性基因位于其上的多毛番茄基因渗入重叠。由于克隆了Tm-1抗性基因并公布了其序列，本发明人可以将其与SOURCE01的Tm-1等位基因进行比较。比较的结果在图4中示出。
从图4可以得出结论，SOURCE01与来自GCR237的抗性Tm-1等位基因高度相似，共享所有SNP，但为杂合形式(参见图3，实例标记为mTO268402325)。除此之外，还发现了其他变异(实例标记为SOURCE01[A/G])，也为杂合形式。
在两种类型的SNP上都设计了标记物，并在SOURCE01种子上进行了测试。使用这些标记物获得的结果在图4中示出。将F2数据添加到图5中所示的数据中，以改进由于偏度(skewness)导致的簇状图。
从图5可以得出结论，在WGRS数据中SOURCE01是该标记物杂合的，然而在排序和筛选时却发现其是纯合的。这个结果并不像预期的那样，因为所有SOURCE01种子都具有纯合的Tm-1等位基因。这与来自WGRS数据的杂合调用(call)相冲突。SOURCE01的WGRS数据还显示Tm-1基因中存在两倍的读段数。基于此信息结合偏态图(skewed plot)，怀疑SOURCE01具有称为Rug-1的Tm-1基因的旁系同源物。
为了证明这一假设，为Tm-1基因、Rug-1基因和内部持家基因Fw2.2和Sp设计了液滴PCR引物。选择后两个基因，因为预期这些基因中没有重复事件。
图6提供了液滴PCR预期结果的概览。
实施例3
Rug-1抗性基因的表征
发现Rug-1基因编码在病毒结合侧具有独特氨基酸的蛋白质。图7提供了RUG1和TM1的氨基酸序列之间的比对。
Ishibash et al.(2012)PLOS Pathogens 8(10)e1002975)记载了在多毛番茄中，对应于显性抗性基因Tm-1的残基79-112的一个小区域已处于正向选择之下。推测来自SOURCE01的TM-1蛋白中该结构域的序列是ToMV1抗性所必需的，并且与公知的TM-1来源多毛番茄种质PI126445-6的区域相同(Ishibash et al.,2012)。
SOURCE01除了Tm-1抗性基因外，包含旁系同源的Rug-1抗性基因，其与来自ToMV1敏感的多毛番茄种质的Tm-1抗性基因类似但不相同。然而，RUG 1蛋白中的对应结构域与ToMV1敏感多毛番茄种质的TM-1氨基酸序列的类似。相较于SGN/NCBI数据库中的其他已知TM-1氨基酸序列，还有许多RUG-1蛋白特有的残基：Q29、Y30、A259、E379、L394、V428和K624。所述特有的氨基酸残基的作用可能是造成特定结构特征的原因，该特定结构特征增强该蛋白质对ToBRFV复制蛋白的结合亲和力并减少病毒传播。
序列表
<110> Nunhems B.V.
<120> 具有改进的烟草花叶病毒抗性的番茄植物
<130> 200037WO01
<150> EP20171136.3
<151> 2020-04-23
<160> 22
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 101
<212> DNA
<213> 番茄(Solanum lycopersicum)
<400> 1
atcttaattt gaaatattta taagagagca tatcttatat cttatatgta atcaaaggaa 60
aataaatgtc agaagatgtt tgtgatctct tatataacaa g 101
<210> 2
<211> 101
<212> DNA
<213> 番茄(Solanum lycopersicum)
<400> 2
ggcacaaatc ccacagcagt ggcacctttt gaaccagtga gctttatctt aaaaaattgt 60
aaagttccta taattcaatc cttgtatagt ctactacagc g 101
<210> 3
<211> 105
<212> DNA
<213> 番茄(Solanum lycopersicum)
<400> 3
atagacaact tgcttaagtc atcaacaacc atattagtct tacctaggtg gcaaagaatg 60
ctcatgtcat aatgcttgag caattctaac catctccttt atgta 105
<210> 4
<211> 101
<212> DNA
<213> 番茄(Solanum lycopersicum)
<400> 4
ctacttgagt tctacaatcg actgaggaat aacaggcatg aagccagttg ataccagtat 60
gacatcaaag tctaccatgt ctaactcaat taaatcgatc a 101
<210> 5
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<212> DNA
<213> 番茄(Solanum lycopersicum)
<400> 5
gtttttttat gtgaggtgat ctttaatttt tgtcattaaa tatgtgtcgc agtctaaccc 60
actgagtcgt gcaggcagct attctaacgg ctaagtagga g 101
<210> 6
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<212> DNA
<213> 番茄(Solanum lycopersicum)
<400> 6
tcggggatct agtctacaca ggaataagag ctactaagag tacaaggtat gacaaaaata 60
taagtgacgc aactcctacc atgcgaaagg aaaagtagaa g 101
<210> 7
<211> 101
<212> DNA
<213> 番茄(Solanum lycopersicum)
<400> 7
ctagtcatgc acagagttat ggtcagtagg aagtccaaca agtgtaagaa ggcctttgct 60
cttgttgctt ttccacgttt gtagtgatag gcatcaacgt t 101
<210> 8
<211> 101
<212> DNA
<213> 番茄(Solanum lycopersicum)
<400> 8
cagaaataat agaaaatcag aaagaaaaat cagctttcta aatggaaaag acgatggcac 60
tatgtttgaa gttttaagca acttttctga agtcccaaaa g 101
<210> 9
<211> 101
<212> DNA
<213> 番茄(Solanum lycopersicum)
<400> 9
aaggaagctg ggtatttagt tgttaggtta atcctagttt cattgtaacc tgctgtccgc 60
cgataccaac caccacccca tcatgtccgt tcagagattc t 101
<210> 10
<211> 101
<212> DNA
<213> 番茄(Solanum lycopersicum)
<400> 10
agtcggaaaa gggttccagt gtagtgtcta taaatagggt cttaatttaa taatttatat 60
actcaattta ataatattct tcacatatat ttctcacacc a 101
<210> 11
<211> 101
<212> DNA
<213> 番茄(Solanum lycopersicum)
<400> 11
aatttagttt caggagattc aatgtttaca aaatcattgc aagatacttc aatctgaaac 60
ttctcagtct aatcagacac atttcactca tattttctca a 101
<210> 12
<211> 101
<212> DNA
<213> 番茄(Solanum lycopersicum)
<400> 12
gttaggatgc gatatatgta ctattaattg tttatgtgtt acgttgctat taatgaggat 60
atcgtaaatc cactcctatc cagaaatttc cagaagatat a 101
<210> 13
<211> 101
<212> DNA
<213> 番茄(Solanum lycopersicum)
<400> 13
actctaaatc attgaccatc ttaatgtggt tcgaaaccac catcttagat tgatcgtggg 60
caagcaacaa agaatggacg aacaaactat ggagcacttc a 101
<210> 14
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<212> DNA
<213> 番茄(Solanum lycopersicum)
<400> 14
ccagtgttac tgatgcgaga tttggcatta aagatacgat agaattaagc cttaaaagcc 60
aaggtggaaa aatggttttt tttttgcaga ttgatttcca t 101
<210> 15
<211> 101
<212> DNA
<213> 番茄(Solanum lycopersicum)
<400> 15
ttaaatcaca actcttcata aaagtcgcaa ctcttcattt tccattcaca tcttttagaa 60
ccaacaatct cccacatgaa tggggaatga cttcaagaca a 101
<210> 16
<211> 754
<212> PRT
<213> 番茄(Solanum lycopersicum)
<400> 16
Met Ala Ser Ala Gln Ser Asn Ser Pro Arg Val Phe Cys Ile Gly Thr
1 5 10 15
Ala Asp Thr Lys Phe Asp Glu Leu Arg Phe Leu Ser Gln Tyr Val Arg
20 25 30
Ser Ser Leu Asn Ser Phe Ser Asn Lys Ser Ser Phe Lys Val Gly Val
35 40 45
Thr Val Val Asp Val Ser Thr Ser Leu Lys Glu Thr Asn Gly Cys Ala
50 55 60
Asp Phe Asp Phe Val Pro Arg Lys Asp Val Leu Ser Cys Tyr Ala Gln
65 70 75 80
Gly Gly Glu Ser Val Val Gln Leu Pro Asp Asp Arg Gly Gln Ala Ile
85 90 95
Ala Ile Met Asn Lys Ala Phe Gln Thr Phe Leu Ser Lys Ala Asn Gly
100 105 110
Glu Gln Asn Leu Ala Gly Val Ile Gly Leu Gly Gly Ser Gly Gly Thr
115 120 125
Ser Leu Leu Ser Ser Ala Phe Arg Ser Leu Pro Ile Gly Ile Pro Lys
130 135 140
Val Ile Ile Ser Thr Val Ala Ser Gly Gln Thr Glu Ser Tyr Ile Gly
145 150 155 160
Thr Ser Asp Leu Val Leu Phe Pro Ser Val Val Asp Ile Cys Gly Ile
165 170 175
Asn Asn Val Ser Lys Val Ile Leu Ser Asn Ala Gly Ala Ala Phe Ala
180 185 190
Gly Met Val Ile Gly Arg Leu Glu Thr Ser Lys Glu Asn Ser Ile Thr
195 200 205
Thr Gly Lys Phe Thr Val Gly Val Thr Met Phe Gly Val Thr Thr Pro
210 215 220
Cys Val Asn Ala Val Lys Glu Arg Leu Val Lys Glu Gly Tyr Glu Thr
225 230 235 240
Leu Val Phe His Ala Thr Gly Val Gly Gly Arg Ala Met Glu Asp Leu
245 250 255
Val Arg Ala Gly Phe Ile Gln Gly Val Leu Asp Ile Thr Thr Thr Glu
260 265 270
Val Ala Asp Tyr Val Val Gly Gly Val Met Ala Cys Asp Ser Ser Arg
275 280 285
Phe Asp Ala Ile Leu Glu Lys Lys Ile Pro Leu Val Leu Ser Val Gly
290 295 300
Ala Leu Asp Met Val Asn Phe Gly Pro Lys Thr Thr Ile Pro Pro Glu
305 310 315 320
Phe Gln Gln Arg Lys Ile His Gln His Asn Glu Gln Val Ser Ile Met
325 330 335
Arg Thr Thr Val Gly Glu Asn Lys Lys Phe Ala Ala Phe Ile Ala Glu
340 345 350
Lys Leu Asn Lys Ala Ser Ser Ser Val Cys Val Cys Leu Pro Glu Lys
355 360 365
Gly Val Ser Ala Leu Asp Ala Pro Gly Lys Glu Phe Tyr Asp Pro Glu
370 375 380
Ala Thr Ser Cys Leu Thr His Glu Leu Leu Met Leu Leu Glu Asn Asn
385 390 395 400
Glu Arg Cys Gln Val Lys Val Phe Pro Cys His Ile Asn Asp Ala Glu
405 410 415
Phe Ala Asn Ala Leu Val Asp Ser Phe Leu Glu Val Ser Pro Lys Ser
420 425 430
Arg His Val Glu Cys Gln Pro Ala Glu Ser Lys Cys Ile Gln Asp Ile
435 440 445
Gln Asn Asp Asn Ala Val Leu Glu Lys Tyr Pro Ser Cys Asn Gly Lys
450 455 460
Asn Phe Ser Arg Leu Asn Asp Phe Pro Asn Ala Lys Pro Glu Thr Leu
465 470 475 480
Gln Lys Arg Thr Val Ile Leu Gln Lys Leu Lys Asp Gln Ile Ser Lys
485 490 495
Gly Lys Pro Ile Ile Gly Ala Gly Ala Gly Thr Gly Ile Ser Ala Lys
500 505 510
Phe Glu Glu Ala Gly Gly Val Asp Leu Ile Val Leu Tyr Asn Ser Gly
515 520 525
Arg Phe Arg Met Ala Gly Arg Gly Ser Leu Ala Gly Leu Leu Pro Phe
530 535 540
Ala Asp Ala Asn Ala Ile Val Leu Glu Met Ala Asn Glu Val Leu Pro
545 550 555 560
Val Val Lys Glu Val Ala Val Leu Ala Gly Val Cys Ala Thr Asp Pro
565 570 575
Phe Arg Arg Met Asp Asn Phe Leu Lys Gln Leu Glu Ser Val Gly Phe
580 585 590
Cys Gly Val Gln Asn Phe Pro Thr Val Gly Leu Phe Asp Gly Asn Phe
595 600 605
Arg Gln Asn Leu Glu Glu Thr Gly Met Gly Tyr Gly Leu Glu Val Lys
610 615 620
Met Ile Ala Thr Ala His Arg Met Gly Leu Leu Thr Thr Pro Tyr Ala
625 630 635 640
Phe Cys Pro Asp Glu Ala Val Ala Met Ala Glu Ala Gly Ala Asp Ile
645 650 655
Ile Val Ala His Met Gly Leu Thr Thr Ser Gly Ser Ile Gly Ala Lys
660 665 670
Thr Ala Val Ser Leu Glu Glu Ser Val Thr Cys Val Gln Ala Ile Ala
675 680 685
Asp Ala Thr His Arg Ile Asn Pro Asp Ala Ile Val Leu Cys His Gly
690 695 700
Gly Pro Ile Ser Ser Pro Glu Glu Ala Ala Tyr Val Leu Lys Arg Thr
705 710 715 720
Thr Gly Val His Gly Phe Tyr Gly Ala Ser Ser Met Glu Arg Leu Pro
725 730 735
Val Glu Gln Ala Ile Thr Ala Thr Val Gln Gln Tyr Lys Ser Ile Ser
740 745 750
Met Glu
<210> 17
<211> 2265
<212> DNA
<213> 番茄(Solanum lycopersicum)
<400> 17
atggcaagtg cacagagtaa ttctcctcga gttttctgta ttggaacagc tgatactaaa 60
ttcgacgagc ttcgtttcct ctcccaatat gtgagatcca gtcttaacag cttctccaat 120
aaatcctcat tcaaggtcgg agtcacagtt gttgatgtct caaccagcct aaaggagaca 180
aatggttgtg ctgattttga ttttgtgccg aggaaggatg tgctgtcctg ctatgcacaa 240
gggggagaat ctgtggtcca gcttccagat gatagaggcc aagctattgc aatcatgaac 300
aaagcttttc aaactttcct aagcaaagct aatggtgaac agaatcttgc tggagtgatt 360
ggccttgggg gtagtggagg aacatctcta ttgtcatctg ccttccgatc tcttccaatt 420
ggaatcccaa aagttataat atctacagtt gccagtggtc aaactgaatc ttatattgga 480
acatcagact tggtattgtt tccttcagtt gtagatattt gtgggattaa caatgttagt 540
aaggttattc tatctaatgc gggtgcagca tttgctggaa tggtgatcgg aaggcttgaa 600
acttcaaaag agaatagcat cactactgga aagtttacag ttggtgtaac tatgtttggg 660
gttacgactc cttgtgttaa tgctgtcaaa gaaagattag tgaaagaagg atatgagact 720
ttggttttcc atgccacggg tgtcgggggc agggccatgg aggatcttgt tagagcaggt 780
tttatacagg gcgtgctgga tattacgaca actgaggttg cagattacgt agttggagga 840
gtaatggcat gtgatagttc ccgatttgat gcaatattag agaagaaaat tcctttggtt 900
ctgagtgtgg gagcactgga tatggtgaat tttggtccta aaactaccat accacctgag 960
tttcagcaaa gaaagattca tcaacataat gagcaggttt ccataatgcg tactacagta 1020
ggtgaaaata agaaatttgc tgcatttata gctgaaaagt tgaacaaggc atcatcaagt 1080
gtatgtgttt gcttgccaga gaaaggtgtg tctgcattgg atgcaccggg gaaagaattt 1140
tatgatcctg aggcaactag ttgtcttaca catgagctac tgatgcttct tgaaaacaat 1200
gaacgttgtc aggttaaggt cttcccttgc catatcaatg atgcggagtt tgcaaatgct 1260
ttagttgatt cattcttgga agtctctccg aaatctagac acgtagaatg tcagccagct 1320
gagtccaaat gtatccaaga cattcagaat gataatgctg ttctagagaa atatccctca 1380
tgcaacggga aaaacttttc tcgcctgaat gactttccaa atgcaaaacc agaaactttg 1440
cagaaaagaa ctgtgatact gcagaaattg aaagatcaaa taagtaaggg caagcctatt 1500
attggggctg gagctggtac aggtatttct gctaagtttg aggaagctgg tggtgtggat 1560
ttgattgtct tgtacaactc agggcgcttt aggatggcag gaaggggatc cttagctggt 1620
ctattgccct ttgctgatgc aaatgccatt gtacttgaga tggccaacga agtattgccg 1680
gtggttaagg aagtggcagt tctggctgga gtttgtgcaa ctgatccttt ccgcaggatg 1740
gacaacttcc tgaagcagtt ggaatccgtt ggattctgtg gggtgcaaaa ctttccaact 1800
gttggtctgt ttgacggtaa cttcagacaa aatttggaag agactggaat gggttatggc 1860
ttggaggtta agatgattgc aacagctcac aggatgggcc ttttgacaac cccatatgct 1920
ttctgcccag atgaagcagt tgctatggca gaagctggtg ccgacatcat agttgctcat 1980
atggggctta caacatctgg ttcaattggt gcaaaaacag ctgtctcatt ggaggaaagt 2040
gtaacttgcg tccaagctat tgcagatgct actcatagga taaatcctga tgcaattgtg 2100
ctctgccatg gaggccctat atcttcccct gaagaagcag catatgtact gaagagaacc 2160
acaggagttc atggatttta tggcgcttca agcatggaaa gactaccagt tgagcaagct 2220
ataactgcaa ctgtccagca gtacaagtct atttctatgg agtga 2265
<210> 18
<211> 101
<212> DNA
<213> 番茄(Solanum lycopersicum)
<400> 18
actcctccaa ctacgtaatc tgcaacctca gttgtcgtaa tatccagcac gccctaaaat 60
aagttcagta acaggtgagt attaagcgtt atccagaaat a 101
<210> 19
<211> 101
<212> DNA
<213> 番茄(Solanum lycopersicum)
<400> 19
tgaatcacct gctcattatg ttgatgaatc tttctttgct gaaactcagg tggtatggta 60
gttttaggac caaaattcac catatccagt gctcccacac t 101
<210> 20
<211> 101
<212> DNA
<213> 番茄(Solanum lycopersicum)
<400> 20
taagattcag tttgaccact ggcaactgta gatattataa cttttgggat tccaattgga 60
agagatcgga aggcagatga caatagagat gttcctccac t 101
<210> 21
<211> 754
<212> PRT
<213> 番茄(Solanum lycopersicum)
<400> 21
Met Ala Thr Ala Gln Ser Asn Ser Pro Arg Val Phe Cys Ile Gly Thr
1 5 10 15
Ala Asp Thr Lys Phe Asp Glu Leu Arg Phe Leu Ser Glu His Val Arg
20 25 30
Ser Ser Leu Asn Ser Phe Ser Asn Lys Ser Ser Phe Lys Val Gly Val
35 40 45
Thr Val Val Asp Val Ser Thr Ser Trp Lys Glu Thr Asn Ser Cys Ala
50 55 60
Asp Phe Asp Phe Val Pro Ser Lys Asp Val Leu Ser Cys His Thr Leu
65 70 75 80
Gly Glu Glu Thr Met Gly Thr Phe Ala Asp Thr Arg Gly Leu Ala Ile
85 90 95
Ala Ile Met Ser Lys Ala Leu Glu Thr Phe Leu Ser Ile Ala Asn Asp
100 105 110
Glu Gln Asn Leu Ala Gly Val Ile Gly Leu Gly Gly Ser Gly Gly Thr
115 120 125
Ser Leu Leu Ser Ser Ala Phe Arg Ser Leu Pro Ile Gly Ile Pro Lys
130 135 140
Val Ile Ile Ser Thr Val Ala Ser Gly Gln Thr Glu Ser Tyr Ile Gly
145 150 155 160
Thr Ser Asp Leu Val Leu Phe Pro Ser Val Val Asp Ile Cys Gly Ile
165 170 175
Asn Asn Val Ser Lys Val Val Leu Ser Asn Ala Gly Ala Ala Phe Ala
180 185 190
Gly Met Val Ile Gly Arg Leu Glu Ser Ser Lys Glu His Ser Ile Thr
195 200 205
Asn Gly Lys Phe Thr Val Gly Val Thr Met Phe Gly Val Thr Thr Pro
210 215 220
Cys Val Asn Ala Val Lys Glu Arg Leu Val Lys Glu Gly Tyr Glu Thr
225 230 235 240
Leu Val Phe His Ala Thr Gly Val Gly Gly Arg Ala Met Glu Asp Leu
245 250 255
Val Arg Gly Gly Phe Ile Gln Gly Val Leu Asp Ile Thr Thr Thr Glu
260 265 270
Val Ala Asp Tyr Val Val Gly Gly Val Met Ala Cys Asp Ser Ser Arg
275 280 285
Phe Asp Ala Ile Leu Glu Lys Lys Ile Pro Leu Val Leu Ser Val Gly
290 295 300
Ala Leu Asp Met Val Asn Phe Gly Pro Lys Thr Thr Ile Pro Pro Glu
305 310 315 320
Phe Gln Gln Arg Lys Ile His Glu His Asn Glu Gln Val Ser Leu Met
325 330 335
Arg Thr Thr Val Gly Glu Asn Lys Lys Phe Ala Ala Phe Ile Ala Glu
340 345 350
Lys Leu Asn Lys Ala Ser Ser Ser Val Cys Val Cys Leu Pro Glu Lys
355 360 365
Gly Val Ser Ala Leu Asp Ala Pro Gly Lys Asp Phe Tyr Asp Pro Glu
370 375 380
Ala Thr Ser Cys Leu Thr Arg Glu Leu Gln Met Leu Leu Glu Asn Asn
385 390 395 400
Glu Arg Cys Gln Val Lys Val Leu Pro Tyr His Ile Asn Asp Ala Glu
405 410 415
Phe Ala Asn Ala Leu Val Asp Ser Phe Leu Glu Ile Ser Pro Lys Ser
420 425 430
Arg His Val Glu Cys Gln Pro Ala Glu Ser Lys Ser Ile Gln Asp Ile
435 440 445
Gln Asn Asp Asn Ala Val Leu Glu Lys Tyr Pro Ser Cys Asn Gly Lys
450 455 460
Asn Phe Ser Arg Leu Asn Asp Phe Pro Asn Ala Lys Pro Glu Thr Leu
465 470 475 480
Gln Lys Arg Thr Val Ile Leu Gln Lys Leu Lys Asp Gln Ile Ser Lys
485 490 495
Gly Lys Pro Ile Ile Gly Ala Gly Ala Gly Thr Gly Ile Ser Ala Lys
500 505 510
Phe Glu Glu Ala Gly Gly Val Asp Leu Ile Val Leu Tyr Asn Ser Gly
515 520 525
Arg Phe Arg Met Ala Gly Arg Gly Ser Leu Ala Gly Leu Leu Pro Phe
530 535 540
Ala Asp Ala Asn Ala Ile Val Leu Glu Met Ala Asn Glu Val Leu Pro
545 550 555 560
Val Val Lys Glu Val Ala Val Leu Ala Gly Val Cys Ala Thr Asp Pro
565 570 575
Phe Arg Arg Met Asp Asn Phe Leu Lys Gln Leu Glu Ser Val Gly Phe
580 585 590
Cys Gly Val Gln Asn Phe Pro Thr Val Gly Leu Phe Asp Gly Asn Phe
595 600 605
Arg Gln Asn Leu Glu Glu Thr Gly Met Gly Tyr Gly Leu Glu Val Glu
610 615 620
Met Ile Ala Ala Ala His Arg Met Gly Leu Leu Thr Thr Pro Tyr Ala
625 630 635 640
Phe Cys Pro Asp Glu Ala Val Ala Met Ala Glu Ala Gly Ala Asp Ile
645 650 655
Ile Val Ala His Met Gly Leu Thr Thr Ser Gly Ser Ile Gly Ala Lys
660 665 670
Thr Ala Val Ser Leu Glu Glu Ser Val Thr Cys Val Gln Ala Ile Ala
675 680 685
Asp Ala Thr His Arg Ile Tyr Pro Asp Ala Ile Val Leu Cys His Gly
690 695 700
Gly Pro Ile Ser Ser Pro Glu Glu Ala Ala Tyr Val Leu Lys Arg Thr
705 710 715 720
Thr Gly Val His Gly Phe Tyr Gly Ala Ser Ser Met Glu Arg Leu Pro
725 730 735
Val Glu Gln Ala Ile Thr Ala Thr Val Gln Gln Tyr Lys Ser Ile Ser
740 745 750
Met Glu
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<211> 2265
<212> DNA
<213> 番茄(Solanum lycopersicum)
<400> 22
atggcaactg cacagagtaa ttctcctcga gttttctgta tcggaacagc tgatacaaaa 60
ttcgacgagc ttcgtttcct ctccgagcat gtgagatcca gtcttaacag cttttccaat 120
aaatcctcat tcaaggtagg agtgacagtt gttgatgtct caaccagctg gaaggagaca 180
aatagttgtg ctgattttga ttttgtaccg agtaaggatg tgctgtcatg ccatacacta 240
ggggaagaaa ctatgggcac gtttgcagat actagaggcc tagctattgc aatcatgagc 300
aaagctcttg aaactttcct aagtatagct aatgatgaac agaatcttgc tggagtaatt 360
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gggatcccaa aagttataat atctacagtt gccagtggtc aaactgaatc ttatattgga 480
acatcagact tggtattgtt tccttcagtt gtagatattt gtgggattaa caatgtcagt 540
aaggttgttc tatctaatgc gggtgcagca tttgctggaa tggtgattgg gaggcttgaa 600
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gttacgactc cttgtgttaa tgctgtcaaa gaaagattag tgaaagaagg atatgagact 720
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tttatacagg gtgtgctgga tattacgaca actgaggttg cagattacgt agttggagga 840
gtaatggcat gtgatagttc ccgatttgat gcaatattag agaagaaaat tcctttggtt 900
ctgagtgtgg gagcactgga tatggtgaat tttggtccta aaactaccat acctcctgag 960
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ggtgaaaata agaaatttgc tgcatttata gcagaaaagt tgaacaaggc atcatcaagt 1080
gtatgtgttt gcttgccaga gaaaggcgtg tctgcattgg atgcacccgg gaaagacttt 1140
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tgcaacggga aaaacttttc tcgcctgaat gactttccaa atgcaaaacc agaaactttg 1440
cagaaaagaa ctgtgatact gcagaaattg aaagatcaaa taagtaaggg caagcctatt 1500
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gacaacttcc tgaagcagtt ggaatccgtt ggattctgtg gggtgcaaaa ctttccaact 1800
gttggtctgt ttgacggtaa cttcagacaa aatttggaag agactggaat gggttatggc 1860
ttggaggttg agatgattgc agcagctcac aggatgggcc ttttgacaac cccatatgct 1920
ttctgcccag atgaagcagt tgctatggca gaagctggtg ccgacatcat agttgctcat 1980
atggggctta caacatctgg ttcaattggt gcaaaaacag ccgtctcatt ggaggaaagt 2040
gtaacttgcg ttcaagctat tgcagatgct actcatagga tatatcctga tgcaattgtg 2100
ctctgccatg gaggccctat atcttcccct gaagaagcag catatgtact gaagagaacc 2160
acaggagttc atggatttta tggcgcttca agcatggaaa gactaccagt tgagcaagct 2220
ataactgcaa ctgtccagca gtacaagtct atatctatgg agtga 2265
Claims (18)
1.一种杂种番茄植物，在其基因组中包括至少一个拷贝的Rug-1抗性基因，
其中所述Rug-1抗性基因赋予番茄褐色皱果病毒(ToBRFV)耐受性/抗性表型，并且
其中所述Rug-1抗性基因编码包括与SEQ ID NO:16的至少95％氨基酸序列同一性的蛋白质。
2.根据权利要求1所述的杂种番茄植物，其中所述Rug-1抗性基因以纯合形式存在。
3.根据权利要求1或2所述的杂种番茄植物，其中所述Rug-1抗性基因存在于，或可获自，或获自，或包括在名为PAR02001的番茄植物的基因组中，所述PAR02001的番茄植物的代表性数量的种子已经以保藏号NCIMB 43590保藏。
4.根据前述权利要求中任一项所述的杂种番茄植物，其中所述植物进一步包括位于11号染色体上SEQ ID NO:1与SEQ ID NO:13之间的数量性状基因座QTL11，并且其中所述QTL11当以纯合形式存在时能够赋予番茄褐色皱果病毒(ToBRFV)耐受性/抗性表型。
5.根据权利要求4所述的杂种番茄植物，其中QTL11包括在基因渗入片段中，并且其中所述包括QTL11的基因渗入片段包括一种或多种选自以下的SNP标记物的单倍型：
位于SEQ ID NO:1的第51位核苷酸处或位于包括与SEQ ID NO:1的至少97％的序列同一性的序列的第51位核苷酸处的SNP_01的腺嘌呤；
位于SEQ ID NO:2的第51位核苷酸处或位于包括与SEQ ID NO:2的至少97％的序列同一性的序列的第51位核苷酸处的SNP_02的腺嘌呤；
位于SEQ ID NO:3的第51位核苷酸处或位于包括与SEQ ID NO:3的至少97％的序列同一性的序列的第51位核苷酸处的SNP_03的鸟嘌呤；
位于SEQ ID NO:4的第51位核苷酸处或位于包括与SEQ ID NO:4的至少97％的序列同一性的序列的第51位核苷酸处的SNP_04的腺嘌呤；
位于SEQ ID NO:5的第51位核苷酸处或位于包括与SEQ ID NO:5的至少97％的序列同一性的序列的第51位核苷酸处的SNP_05的腺嘌呤；
位于SEQ ID NO:6的第51位核苷酸处或位于包括与SEQ ID NO:6的至少97％的序列同一性的序列的第51位核苷酸处的SNP_06的鸟嘌呤；
位于SEQ ID NO:7的第51位核苷酸处或位于包括与SEQ ID NO:7的至少97％的序列同一性的序列的第51位核苷酸处的SNP_07的鸟嘌呤；
位于SEQ ID NO:8的第51位核苷酸处或位于包括与SEQ ID NO:8的至少97％的序列同一性的序列的第51位核苷酸处的SNP_08的腺嘌呤；
位于SEQ ID NO:9的第51位核苷酸处或位于包括与SEQ ID NO:9的至少97％的序列同一性的序列的第51位核苷酸处的SNP_09的胸腺嘧啶；
位于SEQ ID NO:10的第51位核苷酸处或位于包括与SEQ ID NO:10的至少97％的序列同一性的序列第51位核苷酸处的的SNP_10的胸腺嘧啶；
位于SEQ ID NO:11的第51位核苷酸处或位于包括与SEQ ID NO:11的至少97％的序列同一性的序列的第51位核苷酸处的SNP_11的腺嘌呤；
位于SEQ ID NO:12的第51位核苷酸处或位于包括与SEQ ID NO:12的至少97％的序列同一性的序列的第51位核苷酸处的SNP_12的胸腺嘧啶；
位于SEQ ID NO:13的第51位核苷酸处或位于包括与SEQ ID NO:13的至少97％的序列同一性的序列的第51位核苷酸处的SNP_13的胸腺嘧啶；
位于SEQ ID NO:14的第51位核苷酸处或位于包括与SEQ ID NO:14的至少97％的序列同一性的序列的第51位核苷酸处的SNP_14的胞嘧啶；和
位于SEQ ID NO:15的第51位核苷酸处或位于包括与SEQ ID NO:15的至少97％的序列同一性的序列的第51位核苷酸处的SNP_15的胸腺嘧啶。
6.根据权利要求4或5所述的杂种番茄植物，其中QTL11以纯合形式存在。
7.根据权利要求4至6中任一项所述的杂种番茄植物，其中QTL11存在于，或可获自，或获自，或包括在名为PAR02001的番茄植物的基因组中，所述PAR02001的番茄植物的代表性数量的种子已经以保藏号NCIMB 43590保藏。
8.根据前述权利要求中任一项所述的杂种番茄植物，其中所述植物进一步包括Tm-1抗性基因。
9.根据前述权利要求中任一项所述的杂种番茄植物，其中所述植物是单交F1杂种。
10.由根据前述权利要求中任一项所述的杂种番茄植物生产的种子，其中所述种子包括权利要求1至3中任一项所限定的Rug-1抗性基因。
11.一种种子，由其可以生长出根据权利要求1至9中任一项所述的杂种番茄植物。
12.根据权利要求1至9中任一项所述的杂种番茄植物的植物细胞、组织或植物部分，或根据权利要求10或11所述的种子，其包括权利要求1至3中任一项所限定的Rug-1抗性基因。
13.一种单倍体植物或双单倍体植物，其来源自根据权利要求1至9中任一项所述的杂种植物。
14.一种用于鉴定和/或选择番茄植物或植物部分的方法，包括确定所述植物或植物部分是否在其基因组中包括权利要求1至3中任一项所限定的Rug-1抗性基因。
15.一种用于生产具有番茄褐色皱果病毒(ToBRFV)耐受性/抗性表型的番茄植物的方法，所述方法包括以下步骤：
(i)将第一种番茄植物和第二种植物杂交，其中第一种番茄植物在其基因组中包括权利要求1至3中任一项所限定的Rug-1抗性基因；
(ii)任选地从(i)的杂交中收获种子并选择在其基因组中包括Rug-1抗性基因的种子。
16.用于增强番茄植物的番茄褐色皱果病毒(ToBRFV)耐受性/抗性表型的方法，所述方法包括将权利要求1至3中任一项所限定的Rug-1抗性基因渗入到所述番茄植物中。
17.权利要求1至3中任一项所限定的Rug-1抗性基因用于增强番茄植物中的番茄褐色皱果病毒(ToBRFV)耐受性/抗性表型的用途。
18.权利要求1至3中任一项所限定的Rug-1抗性基因的特异性遗传标记物用于选择具有增强的番茄褐色皱果病毒(ToBRFV)耐受性/抗性表型的番茄植物的用途。
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