CN110305980A - 一种抗根肿病高油酸油菜的选育方法及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于油菜育种技术领域，尤其涉及一种抗根肿病高油酸油菜的选育方法及其应用。其技术要点包括：将高油酸品系植株与含抗根肿病基因的植株杂交，获得同时含有高油酸和CRb抗病位点的复合F1油菜种子；种植上述复合F1油菜种子，分别用高油酸和抗根肿病分子标记鉴定相关的基因位点，并选择含有上述位点的个体与轮回亲本杂交；对回交并自交得到的后代群体进行高油酸和抗根肿病分子标记分析，筛选纯合高油酸抗根肿病品种。本发明为选育优良抗病高油酸油菜品种提供了一种简单、快速、有效的方法。该选育方法可以在育种过程中的任何时期根据基因型对单株进行有效选择，提高了选择效率、缩短育种年限。

Description

一种抗根肿病高油酸油菜的选育方法及其应用
技术领域
本发明属于油菜育种技术领域，尤其涉及一种抗根肿病高油酸油菜的选育方法及其应用。更具体地说，涉及利用根肿病室内接菌鉴定、分子标记辅助选择选育优良抗根肿病高油酸甘蓝型油菜品系的方法。
背景技术
油菜种子中脂肪酸组成直接决定菜籽油的食用品质和营养价值。油酸是一种十八碳单不饱和脂肪酸。普通油菜种子中油酸含量为17-65％，本发明中高油酸油菜是指种子及菜籽油脂肪酸中油酸的比例大于75％的油菜品种及其衍生的菜籽油。
高油酸食用油，包括高油酸菜籽油，在食用油和工业上有很高的应用价值。高油酸食用油的氧化稳定性高，在煎炸食物时，高油酸食用油高温不起烟，能够缩短煎炸时间，减少油吸收过量(Miller等,Genetic control of high oleic acid content in sunfloweroil.Crop Sciences,1987,27:923-926.)。在日常饮食中，高油酸可降低血液中的低密度脂蛋白胆固醇的含量，从而有利于阻止动脉血管硬化(Chang等,Effects of the ratio ofpolyunsaturated and monounsaturated fatty acid on rat plasma and liver lipidconcentration.Lipids,1998,33:481-487)。由于油酸的十八碳链长度与柴油组分相似，高油酸菜籽油可用于生产优质生物柴油，是重要的可再生性能源原料(Piazza等，Rapeseedoil for oleo chemical uses.Eur J Lipid Sci Techno l,2001,103:405-454.)。
根肿病是由土壤中根肿菌(Plasmodiophora brassicae)侵染十字花科作物引起且传染性广以及危害性较强的土传病害，是世界范围内十字花科作物主要的毁灭性病害之一。根肿病名称的由来是源于发病植株明显的地下部症状，即根部形成根瘤乃至大的肿块。肿块有纺锤形、球形、指形或者棍棒形等不规则形状，侧根形成肿瘤后会逐渐相互连结而形成一个覆盖整个根部的大肿瘤，肿瘤前期表面光滑，后期逐渐粗糙直至破裂，形成的伤口会让其他微生物进一步感染根部组织引起腐烂，直至植株死亡(Howard R J,Strelkov S E,Harding M W.Clubroot of cruciferous crops–new perspectives on an old disease[J].Canadian Journal of Plant Pathology,2010,32(1):43-57.)。近年来，根肿病在我国发展很快，给十字花科作物生产造成了巨大损失。
在常规油菜抗根肿病品种转育过程中，每代都需要采用田间接种根肿病菌的方法来鉴定中间材料的基因型，并且温度、湿度以及病原菌的田间分布等因素会影响到接种发病率，进而影响抗病材料的正确选择及转育进程。
发明内容
针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种抗根肿病高油酸油菜的选育方法及其应用。
本发明是这样实现的，一种抗根肿病高油酸油菜的选育方法，包括以下步骤：
S1：将高油酸品系植株与含抗根肿病基因的植株杂交，获得同时含有高油酸和CRb抗病位点的复合F1油菜种子；
S2：种植上述复合F1油菜种子，分别用高油酸和抗根肿病分子标记鉴定相关的基因位点，并选择含有上述位点的个体与轮回亲本杂交；
S3：对回交并自交得到的后代群体进行高油酸和抗根肿病分子标记分析，筛选纯合高油酸抗根肿病品种。
进一步，在步骤S3后面增加步骤S4，利用甘蓝型油菜6K基因芯片对纯合高油酸抗根肿病植株进行全基因组基因分型，分析遗传背景回复率。
进一步，抗根肿病分子标记cnu_SSR492引物序列分别见SEQ ID NO:1和SEQ IDNO:2。
进一步，油酸位点分子标记YQ2d引物序列见SEQ ID NO:3至SEQ ID NO:6。
进一步，利用分子标记Gap-4筛选纯合高油酸抗根肿病品种，所述分子标记Gap-4引物序列见SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8。
进一步，所述含抗根肿病基因的植株为丙409品系。
进一步，所述高油酸品系由普通油酸含量品系与高油酸含量甘蓝型油菜品系杂交获得。
进一步，所述普通油酸含量品系为甘蓝型油菜优良品种中双11号。
进一步，所述高油酸含量甘蓝型油菜品系为甲A254。
如权利要求1-8任一所述的一种抗根肿病高油酸油菜的选育方法在油菜育种的应用。
综上所述，本发明的优点及积极效果为：
本发明利用油酸含量大于75％的品系，通过与油酸含量小于69％的优良油菜品系或品种杂交，利用高油酸分子标记进行选择，可以提前分离出高油酸基因型，减少育种工作量。
本发明利用抗根肿病材料与高油酸材料杂交并进行回交，利用分子标记辅助选择对回交群体世代进行基因型鉴定，最终获得纯合抗病高油酸材料。
本发明为选育优良抗病高油酸油菜品种提供了一种简单、快速、有效的方法。利用该方法可进一步改良菜籽油的品质，提高菜籽油的市场价值，为高端食用油生产企业提供优质原料，通过降低生产成本，提高企业经济效益和市场竞争力。且该选育方法可以在育种过程中的任何时期根据基因型对单株进行有效选择，提高了选择效率、缩短育种年限。
附图说明
图1是根肿病育种技术路线；
图2是抗病材料室内接菌后其根部发病情况调查；
图3是利用引物cnu_SSR492检测抗根肿病CRb基因；
图4是利用引物Gap-4对CRb基因进行基因型鉴定；
图5是CRb抗病位点田间抗性鉴定-标记选择效果；
图6是110份抗病高油酸材料亲缘关系图；
图7是110份抗病高油酸材料基于不同SNP标记的主成分分析。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
本发明披露了一种抗根肿病高油酸油菜的选育方法及其应用，具体如下各实施例所示。
实施例1利用分子标记快速聚合高油酸和抗根肿病基因
1.配置普通油酸含量和高油酸含量的F1组合
选择甘蓝型油菜优良品种中双11号(原育种单位为中国农业科学院油料作物研究所；全国农作物品种审定委员会审定，国审油2008030；2012年测定该品种种子油酸含量为68％)为母本，与高油酸含量甘蓝型油菜品系甲A254(2012年测定的油酸含量为78％，该材料的种子已于2009年11月20日送交湖北省武汉市武汉大学内的中国典型培养物保藏中心保藏，其保藏号为CCTCC-P200909；且已在专利号为ZL 2009102734352，名称为甘蓝型油菜高油酸分子标记及制备方法与应用的中国发明授权专利中公开)为父本，通过人工去雄杂交获得F1代种子。
2.F1后代群体中高油酸系筛选及鉴定
将上步所得的F1单株和其亲本(中双11号，甲A254)种植在湖北省武汉市华中农业大学试验田。每一个株系种1行，每行11株，株距24cm，行间距30cm。自交F1代植株获得F2种子。
苗期采集300个株系及双亲的叶片提取基因组DNA(基因组DNA的提取方法参考李佳等，一种有效提取油菜叶片总DNA的方法，华中农业大学学报，1994，13(5)：521-523)。利用申请人的发明专利授权(专利号ZL 2009102734352)公开的分子标记及实验方案对筛选材料进行标记分析，获得各株系的油酸含量基因型。
3.配制抗根肿病与高油酸的F1组合
将含CRb(抗根肿病基因)抗病位点的丙409品系与第2步中获得的不抗病的优良材料杂交获得不同杂交组合。
4.抗根肿病高油酸油菜的选育
育种路线如图1所示，根据回交育种的需要，花期选择长势良好的F1植株与轮回亲本进行回交并自交，获得BC1F1和F2种子于同年10月在武汉播种。
BC1F1群体中共选择332株单株，利用与CRb连锁的分子标记cnu_SSR492对目标基因进行检测。
本实施例所用分子标记引物cnu_SSR492序列如下：
cnu_SSR492F：5'-TCGAGGTGGTTACAATCCAA-3'，见SEQ ID NO:1；
cnu_SSR492R：5'-CAATGCGGATCTACCTCTCA-3'，见SEQ ID NO:2。
其中植株叶片DNA提取方法为：
(1)将样品放入96孔板中，加入2粒钢珠和500μl快速提取buffer，在磨样机上研磨6-8min，直到叶片粉碎；
(2)95℃水浴锅中水浴10min；水浴完冷却后，
(3)3800r/min离心10min；
(4)吸取20μl上清液于PCR板中，加入100μl超纯水，混匀后于-20℃贮存。
表1抗病鉴定PCR反应体系
PCR程序：94℃变性30sec，退火温度55℃，时间30sec，72℃延伸1min，35个循环。PCR反应完成后扩增产物至于4℃低温冰箱保存，用6％变性PAGE检测。
电泳检测部分结果显示，183株不含抗病位点，149株含CRb抗病位点且为杂合基因型。卡方检验χ2＝3.48<3.84(χ20.05,1)符合群体符合群体分离比1:1。
选择含CRb抗病位点的F1群体套袋自交产生F2群体，利用分子标记cnu_SSR492，对不同组合的515株单株的基因型进行标记分析，验证F2群体世代的基因分离比，其中不含抗病位点的株数为122株，杂合基因型为244株，含抗病位点的株数为149株，卡方检验χ2＝4.25<5.99(χ20.05,2)符合1:2:1分离比。
实施例2回交世代标记辅助选择筛选纯合抗病高油酸优良单株
1.筛选不同加系材料进行室内接菌鉴定：选择枝江地区的根肿病植株菌根磨碎后拌入营养土形成菌土。然后于室内播种调查其根部发病情况，鉴定其对根肿病的抗性。每组材料对照(亲本)发病率为100％，抗病材料发病率为0％。部分检测结果如图2所示，检测结果说明此方法可以有效的检测抗病材料对病源的抗性。
2.用cnu_SSR492引物对BC2F2群体中不同品系(具有不同的轮回亲本来源背景)通过PAGE胶检测方法进行目标基因的筛选鉴定，具体试验方案参照实施例1，共有254个单株为纯合抗病基因型(供体亲本基因型记为A)，233株为不携带抗病基因的野生型(轮回亲本基因型记为B)，490株为杂合基因型(记为H)。部分材料电泳检测结果如图3所示，其中A代表纯合抗病基因型，B代表野生型，H代表抗病杂合基因型。卡方测验表明，χ2＝0.91<5.99(χ20.05,2)，符合1:2:1分离比。
3.在含有抗病基因(CRb)的基础上，对A5油酸位点进行琼脂糖凝胶电泳鉴定，共有14个株系(主要是华双5号背景)、146个单株为纯合高油酸材料(鉴定结果全为纯合高油酸基因型)。油酸位点鉴定PCR体系及程序如下：
表2油酸位点鉴定PCR反应体系
PCR程序：94℃变性30sec，退火温度56℃，时间30sec，72℃延伸37sec；32个循环。
其中YQ2d2R-1序列为：GATCCCAAACATAACAGCGATG，见SEQ ID NO:3；
YQ2d2F-1序列为：CAGTTCACTCTCGGCGGG，见SEQ ID NO:4；
YQ2d1R-1序列为：CCCAAACATAACAGCGATG，见SEQ ID NO:5；
YQ2d2F序列为：CAGTTCACTCTCGGCTCG，见SEQ ID NO:6。
4.在BC2F3群体中用Gap-4引物对221个株系、2178个单株通过琼脂糖凝胶电泳检测进行目标基因的筛选，PCR体系及程序如下：
表3Gap-4-反应体系
PCR程序：94℃变性30sec，退火温度58℃，时间30sec，72℃延伸1min，32个循环。反应产物用1％琼脂糖凝胶电泳检测。
本实施例所用分子标记引物Gap-4序列如下：
Gap-4F：5'-ATATTGATCGGAAGGGCCGTTAG-3'，见SEQ ID NO:7；
Gap-4R：5'-GCAAACATTGGAGCTTTCTGG-3'，见SEQ ID NO:8。
部分材料电泳结果如图4所示，其中，P1：抗病亲本；P2：感病(野生型)亲本；图中剩余泳道为相关样品检测。检测结果显示所有株系中纯合抗病基因型材料共有134个株系，根据上一代基因型鉴定结果，利用第3部中的YQ2d系列引物确认了4个纯合高油酸(纯合抗病)品系，分别是18苗329、18苗330、18苗331和18苗336。在BC2F3群体中对华双5号、阳光2009、圣光77等不同背景来源的材料进行油酸位点鉴定，共取样247株，筛选出了97株纯合抗病高油酸优良单株(株高、整齐度一致)。
实施例3CRb抗病位点田间抗性鉴定-标记选择效果
将实施例2中筛选的抗根肿病高油酸品系种植于湖北荆门、安徽黄山两个根肿病发病严重的田块。试验设置三个重复，每个重复中种植三个对照品种，同年12中旬进行基因型取样鉴定和田间抗性调查。
根肿病病害分级标准
0级：无任何病害症状；
1级：仅在须根末梢上有少量且较小根瘤；
2级：侧根上有根瘤出现；
3级：须根及侧根根瘤大且主根末梢有小的根瘤；
4级：主根全部肿大，根上根肿部分开始龟裂腐烂、植株出现萎焉症状或已死亡。
在苗期进行田间发病情况调查，获得在两病区均表现为全抗病的品系共8个，对这些品系取样利用Gap-4引物进行水平胶检测，基因型鉴定为纯合抗病高油酸基因型。实验方案如实施例2。部分抗病鉴定结果如图5所示，其中，A：抗病株系；B：华双5R(抗病对照)；C：华油杂9号(感病对照)；D：分离株系(0-4级)。
实施例4回交群体后代遗传背景回复率分析
1.利用甘蓝型油菜6K基因芯片对中选单株(纯合高油酸、抗病材料)进行全基因组基因分型。数据处理及分析参照文献中相关方法(Cai G,Yang Q,Yi B,Fan C,Edwards D,Jacqueline Batley,Zhou Y*(2014)A Complex Recombination Pattern in the Genomeof Allotetraploid Brassica napus as Revealed by a High-Density GeneticMap.PloS One 9(10):e109910.；Liu S，Fan C，Li J，Guangqin Cai，Yang Q，Wu J，Yi X，Zhang C，Zhou Y*(2016)，A genome wide association study reveals novel eliteallelic variations in seed oil content of Brassica napus，Theor Appl Genet，129:1203–1215)。
2.回交后代材料的理论背景回复率表示为G(g)＝1-0.5g+1，实际背景回复率计算公式为：G(g)＝[L+X(g)]/2L，其中g表示回交世代，X(g)表示回交g代中与轮回亲本带型相同的分子标记数，L为具有多态性的分子标记数。
表4CRb抗病位点株系背景回复率
A：高油酸背景；B：低油酸背景
在BC2F3群体中，不同背景来源材料的背景回复率均大于理论值，其中中双11号背景来源的材料回复率最高可达到93.77％。
实施例5新育成抗病优良品系的遗传多样性分析
对四种不同背景来源材料(华双5号、圣光77、中双11、阳光2009)的遗传多样性进行分析，共可分为2类，华双5号背景的材料为同一类(共49份)；圣光77、中双11以及阳光2009三种背景来源的材料统归为一类，分别有35、9、17份，见图6。
对这110份抗根肿病高油酸材料进行主成分分析(PCA)。华双5号、圣光77、中双11来源的材料分别聚合在一起，阳光2009来源的材料中有一个单株与其他单株距离较远，这个单株是后期选择的与轮回亲本具有相同背景来源的生产上主栽品种阳光2009，并不是回交时所用的直系轮回亲本，但是与回交后代属于相同背景来源，见图7。
综上所述，通过分子标记辅助选择可以快速准确选育出抗病品种，进而获得高油酸抗根肿病新品种。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 华中农业大学
<120> 一种抗根肿病高油酸油菜的选育方法及其应用
<160> 8
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(cnu_SSR492F)
<400> 1
tcgaggtggt tacaatccaa 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(cnu_SSR492R)
<400> 2
caatgcggat ctacctctca 20
<210> 3
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(YQ2d2R-1)
<400> 3
gatcccaaac ataacagcga tg 22
<210> 4
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(YQ2d2F-1)
<400> 4
cagttcactc tcggcggg 18
<210> 5
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(YQ2d1R-1)
<400> 5
cccaaacata acagcgatg 19
<210> 6
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(YQ2d2F)
<400> 6
cagttcactc tcggctcg 18
<210> 7
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Gap-4F)
<400> 7
atattgatcg gaagggccgt tag 23
<210> 8
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Gap-4R)
<400> 8
gcaaacattg gagctttctg g 21

Claims (10)

1.一种抗根肿病高油酸油菜的选育方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1：将高油酸品系植株与含抗根肿病基因的植株杂交，获得同时含有高油酸和CRb抗病位点的复合F1油菜种子；
S2：种植上述复合F1油菜种子，分别用高油酸和抗根肿病分子标记鉴定相关的基因位点，并选择含有上述位点的个体与轮回亲本杂交；
S3：对回交并自交得到的后代群体进行高油酸和抗根肿病分子标记分析，筛选纯合高油酸抗根肿病品种。
2.根据权利要求1所述的一种抗根肿病高油酸油菜的选育方法，其特征在于：在步骤S3后面增加步骤S4，利用甘蓝型油菜6K基因芯片对纯合高油酸抗根肿病植株进行全基因组基因分型，分析遗传背景回复率。
3.根据权利要求1所述的一种抗根肿病高油酸油菜的选育方法，其特征在于：抗根肿病分子标记cnu_SSR492引物序列分别见SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2。
4.根据权利要求1所述的一种抗根肿病高油酸油菜的选育方法，其特征在于：油酸位点分子标记YQ2d引物序列见SEQ ID NO:3至SEQ ID NO:6。
5.根据权利要求1所述的一种抗根肿病高油酸油菜的选育方法，其特征在于：利用分子标记Gap-4筛选纯合高油酸抗根肿病品种，所述分子标记Gap-4引物序列见SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8。
6.根据权利要求1所述的一种抗根肿病高油酸油菜的选育方法，其特征在于：所述含抗根肿病基因的植株为丙409品系。
7.根据权利要求1所述的一种抗根肿病高油酸油菜的选育方法，其特征在于：所述高油酸品系由普通油酸含量品系与高油酸含量甘蓝型油菜品系杂交获得。
8.根据权利要求7所述的一种抗根肿病高油酸油菜的选育方法，其特征在于：所述普通油酸含量品系为甘蓝型油菜优良品种中双11号。
9.根据权利要求7所述的一种抗根肿病高油酸油菜的选育方法，其特征在于：所述高油酸含量甘蓝型油菜品系为甲A254。
10.如权利要求1-9任一所述的一种抗根肿病高油酸油菜的选育方法在油菜育种的应用。
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