CN109234428A - 一种甘蓝型油菜高芥酸基因的分子标记及选育方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种甘蓝型油菜高芥酸基因的分子标记及选育方法，涉及生物选育领域，包括S1、构建分离群体；S2、用CTAB法提取待测材料基因组DNA；S3、进行PCR扩增；S4、使用标记引物对Pb1、Pb2、Fa1、Fa2检测分离群体中单株是否含有根肿病抗性位点PbBa8.1或低芥酸基因fae1并分类；S5、以含有根肿病抗性位点PbBa8.1且高芥酸的甘蓝型油菜为亲本与不抗病低芥酸亲本杂交后再不断自交，并结合标记辅助选择抗病位点和低芥酸基因纯合的油菜新品种。本发明的抗根肿病且籽粒低芥酸的甘蓝型油菜选育方法可在苗期对存在遗传连锁的根肿病抗性位点PbBa8.1和低芥酸基因fae1进行辅助选择，基因特异标记的理论准确率达到100％，提高了抗根肿病且籽粒低芥酸的甘蓝型油菜的选育效率，缩短了育种进程。

Description

一种甘蓝型油菜高芥酸基因的分子标记及选育方法

技术领域

本发明涉及育种技术领域，具体涉及一种甘蓝型油菜高芥酸基因的分子标记及选育方法。

背景技术

十字花科根肿病是由芸薹根肿菌(Plasmodiophora brassicae Woron.)感染导致的世界性病害，近年来在我国油菜产区蔓延迅速。随着农业机械化水平的不断提高，根肿病的扩散将会更加迅猛，严重威胁我国油菜产业的安全。寄主被根肿菌侵染后最开始在侧根出现小瘤，随着病情发展主根会出现肿大的白色组织，严重感染的植物主根可能被完全破坏，造成木质部细胞受损和水分运输中断，从而导致发育迟缓及一系列地上症状如枯萎、黄化、叶片花青素着色和早熟，严重时可导致作物绝收(HWANG S F,STRELKOV S E,FENG J,etal. Plasmodiophora brassicae:a review of an emerging pathogen of the Canadiancanola(Brassica napus)crop[J].Molecular Plant Pathology, 2011,13(2):105-13.)。培育并种植抗根肿病油菜新品种是控制病情蔓延、稳定油菜产量、保障产业安全的最有效措施。

芥酸(化学名称为顺-13-二十二碳烯酸，C22：1 13)是一种22 碳超长链脂肪酸，广泛存在于甘蓝型油菜(Brassica napus)、芥菜 (Brassica juncea)、甘蓝(Brassicaoleracea)等十字花科芸苔属植物种子中，占比达30-60％。实验证明，老鼠等动物食用芥酸会导致心肌脂肪沉积症，大量食用时还会发生心肌纤维化和坏死。(Erucic Acid in Food:A Toxicological Review and Risk Assessment FSAN Zealand- 2003-TechnicalReport Series)而食用低芥酸菜籽油相比常规饮食的人群胆固醇总量低15-20％，心血管疾病发病率也相应减少。并且含有高芥酸的植物油中，营养价值更高的油酸、亚油酸相应的含量会降低，芥酸含量在2％以下的低芥酸菜籽油成为受消费者青睐的市场主流。

油菜中控制芥酸合成的关键和限速基因是脂肪酸延长酶(Fatty Acid Elongase1FAE1)，其在甘蓝型油菜当中有两个基因位点，一个位于A08染色体，一个位于C03染色体，在种子发育过程中特异表达。目前生产上使用的甘蓝型油菜品种大部分为低芥酸品种，其低芥酸性状多由第一个低芥酸油菜品种ORO转育而来。也有研究者利用转基因技术创制出低芥酸材料，但目前我国尚未允许转基因油菜的大面积种植，因此很难在生产中利用。油菜种子芥酸含量的测定一般是通过近红外光谱分析仪扫描(Near Infrared SpectrumInstrument， NIRS)或者通过提取成熟种子总脂肪酸利用气相色谱(Gas ChromatographyGC)进行测定。

2015年有研究以抗病芜菁ECD04(AA，2n＝20)为供体，把对根肿菌4号生理小种有抗性的A8染色体上的位点PbBa8.1定向地转育到油菜常规品种华双5号的遗传背景中育成我国首个甘蓝型油菜根肿病抗性品种——华双5R。(战宗祥，江莹芬，朱紫媛等.与位点PbBa8.1紧密连锁分子标记的开发及甘蓝型油菜根肿病抗性育种[J]. 中国油料作物学报,2015,37(6):766-771.)该品种对多个油菜产区的根肿病具有免疫抗性，并已作为优良抗源材料提供给全国各油菜育种单位。

但在实际育种过程中，我们发现ECD0与华双5号的杂交后代其种子芥酸含量很难降到低芥酸水平。InDel标记即插入缺失标记，指的是两种亲本中在全基因组中的差异，相对另一个亲本而言，其中一个亲本的基因组中有一定数量的核苷酸插入或缺失(Jander G,Last R L.Arabidopsis map-based cloning in the post-genome era.[J].PlantPhysiology,2002,129(2):440-50.)。前期本实验室开发了与PbBa8.1紧密连锁的InDel标记A08-300(图1)(张椿雨,战宗祥,朴钟云等.一种甘蓝型油菜抗根肿病基因的分子标记及其在抗根肿病育种中的应用，CN 105063033 A[P].2015.)。

A08-300标记与PbBa8.1位点物理距离为20.7kb连锁紧密，在一定大小群体的情况下能够有效选育出抗根肿病材料，但是理论上该标记与PbBa8.1之间仍可能发生交换，在群体足够大时造成假阳性。在育种过程在对抗根肿病位点PbBa8.1进行转育的同时，若要除去与之连锁的高芥酸一般需要种植较大的分离群体，会占用较多空间土地，加上自然接种或人工接种鉴定，鉴别工作量大，准确率低；并且芥酸性状需收获种子后鉴定，这些都极大降低了抗病育种效率。

发明内容

针对现有技术中存在的缺陷，本发明的目的在于提供一种与芜菁抗根肿病基因位点PbBa8.1紧密连锁的分子标记高芥酸基因FAE1的序列，其序列为SEQ ID NO.1所示。

本发明的另一个目的在于提供了用于检测油菜A08染色体根肿病抗性位点PbBa8.1/油菜A08染色体低芥酸基因fae1/油菜A08染色体高芥酸基因FAE1的特异性引物。

本发明的最后一个目的在于提供了一种抗根肿病且籽粒低芥酸的甘蓝型油菜选育方法，适用范围广、基因特异标记理论准确率达到 100％，提高了抗根肿病且籽粒低芥酸的甘蓝型油菜的选育效率，缩短了育种进程。

为达到以上目的，本发明采取的技术方案是：

一种与芜菁抗根肿病基因位点PbBa8.1紧密连锁的分子标记高芥酸基因FAE1的序列，其序列如SEQ ID NO.1所示：

SEQ ID NO.1

atgacgtccgttaacgtaaagctcctttaccattacgtcataaccaaccttttcaacctttgcttctttc cgttaacggcgatcgtcgccggaaaagcctatcggcttaccatagacgatcttcaccacttatactattcctatctccaacacaacctcataaccatcgctccactctttgccttcaccgttttcggttcggttctctacatcgca acccggcccaaaccggtttacctcgttgagtactcatgctaccttccaccaacgcattgtagatcaagtatc tccaaggtcatggatatcttttatcaagtaagaaaagctgatccttctcggaacggcacgtgcgatgactc gtcgtggcttgacttcttgaggaagattcaagaacgttcaggtctaggcgatgaaactcacgggcccgag gggctgcttcaggtccctccccggaagacttttgcggcggcgcgtgaagagacggagcaagttatcatt ggtgcgctagaaaatctattcaagaacaccaacgttaaccctaaagatataggtatacttgtggtgaactc aagcatgtttaatccaactccatcgctctccgcgatggtcgttaacactttcaagctccgaagcaacgtaa gaagctttaaccttggtggcatgggttgtagtgccggcgttatagccattgatctagcaaaggacttgttgc atgtccataaaaatacgtatgctcttgtggtgagcacagagaacatcacttataacatttacgctggtgata ataggtccatgatggtttcaaattgcttgttccgtgttggtggggccgctattttgctctccaacaagcctgg agatcgtagacggtccaagtacgagctagttcacacggttcgaacgcataccggagctgacgacaagt cttttcgttgcgtgcaacaaggagacgatgagaacggcaaaatcggagtgagtttgtccaaggacataa ccgatgttgctggtcgaacggttaagaaaaacatagcaacgttgggtccgttgattcttccgttaagcgag aaacttctttttttcgttaccttcatgggcaagaaacttttcaaagataaaatcaaacattactacgtcccggat ttcaaacttgctattgaccatttttgtatacatgccggaggcagagccgtgattgatgtgctagagaagaac ctagccctagcaccgatcgatgtagaggcatcaagatcaacgttacatagatttggaaacacttcatctag ctcaatatggtatgagttggcatacatagaagcaaaaggaaggatgaagaaaggtaataaagtttggca gattgctttagggtcaggctttaagtgtaacagtgcagtttgggtggctctaaacaatgtcaaagcttcgac aaatagtccttgggaacactgcatcgacagatacccggtcaaaattgattctgattcaggtaagtcagaga ctcgtgtccaaaacggtcggtcctaa。

本发明还提供检测如上所述的油菜A08染色体根肿病抗性位点 PbBa8.1存在的引物对Pb1，该引物为：

正向引物序列为5’-tccccatatgatggttttcgaa-3’；

反向引物序列为5’-caagaaactcttctactttgttaat-3’。

本发明还提供检测如上所述的油菜A08染色体根肿病抗性位点 PbBa8.1不存在的引物对Pb2，该引物为：

正向引物序列为5’-tccccatatgatggttttgggg-3’，

反向引物序列为5’-caagaaactcttctactttgtctg-3’。

本发明还提供检测如上所述的油菜A08染色体低芥酸基因fae1 存在的引物对fa1，该引物为：

正向引物序列为5’-ggccgctattttgctcac-3’，

反向引物序列为5’-gtgttcccaaggactatttgac-3’。

本发明还提供检测如上所述的油菜A08染色体高芥酸基因fae1 不存在的引物对fa2，该引物为：

正向引物序列为5’-gggccgctattttgctatt-3’

反向引物序列为5’-gtgttcccaaggactatttgac-3’。

本发明还提供一种抗根肿病且籽粒低芥酸的甘蓝型油菜选育方法，包括：

S1、含根肿病抗性位点PbBa8.1高芥酸亲本WZ491与不抗病低芥酸亲本华双5号杂交，再自交获得F2代，对分离群体中296个单株进行根肿病抗性位点PbBa8.1以及高芥酸基因FAE1和低芥酸基因 fae1的分子标记鉴定；

S2、用CTAB法对待测材料进行基因组DNA的提取

S3、PCR扩增：

a.反应体系：20μL体系，各组分物质的含量分别为15ng模板 DNA；5pmol·L^-1引物；1.0mmol·L^-1脱氧核糖核苷三磷酸；1.0uL 10 ×PCR缓冲液；0.5U Taq DNA聚合酶；ddH₂O补齐20μL，混匀，离心；

b.扩增程序：预变性94℃/5min；94℃/30s；55℃/30s；72℃/1mins； 35个循环后；72℃延伸10min；最后4℃保存；

c.电泳：

将PCR扩增产物与等体积的上样缓冲液混合(98％甲酰胺，10mM EDTA，0.001％二甲苯腈蓝和溴酚蓝)；之后在琼脂糖凝胶电泳仪上进行琼脂糖凝胶(1％)电泳，100V条件下电泳30分钟；电泳结束后，在紫外灯下观察、成像。

S4、使用标记引物对Pb1、Pb2、Fa1、Fa2检测扩增结果是否含有根肿病抗性位点PbBa8.1及高、低芥酸基因并分类；

S5、以含有根肿病抗性位点PbBa8.1且高芥酸的甘蓝型油菜为亲本，常规易感根肿病的低芥酸甘蓝型油菜品种为亲本杂交并自交，或回交后代播种于育苗穴盘；育苗期提取叶片DNA并利用分子标记筛选出含有根肿病抗性位点和低芥酸基因的单株后移栽入大田后续选择农艺性状优良的单株不断自交；结合标记辅助选择抗病位点和低芥酸基因纯合的新品种。

在上述技术方案的基础上，步骤S4包括：

①在使用Pb1引物对扩增结果中如果能够检测到278bp条带，则带有278bp条带的材料含有根肿病抗性位点PbBa8.1，记为B，否则记为A；

②在使用Pb2引物对扩增结果中如果能够检测到278bp条带，则带有278bp条带的材料不含根肿病抗性位点PbBa8.1，记为B，否则记为A；

③在使用Fa1引物对扩增结果中如果能够检测到616bp条带，则带有616bp条带的材料含有低芥酸基因fae1，记为B，否则记为A；

④在使用Fa2引物对扩增结果中如果能检测到616bp条带，则带有616bp条带的材料含有高芥酸基因FAE1，记为B，否则记为A。

与现有技术相比，本发明的优点在于：

(1)本发明的甘蓝型油菜高芥酸基因的分子标记中，标记Pb1 和Pb2与甘蓝型油菜抗根肿病位点PbBa8.1紧密连锁(完全共分离)， Fa1是脂肪酸延长酶基因FAE1的基因标记，Fa2是脂肪酸延长酶突变基因fae1的基因标记，可广泛应用于分子标记辅助选择抗根肿病且籽粒低芥酸的甘蓝型油菜育种。

(2)本发明的抗根肿病且籽粒低芥酸的甘蓝型油菜选育方法可在苗期对存在遗传连锁的根肿病抗性位点PbBa8.1和低芥酸基因fae1 进行分子标记辅助选择，相比现有技术中提到的InDel标记A08-300，利用基因特异标记理论准确率达到100％，极大的提高了抗根肿病且籽粒低芥酸的甘蓝型油菜的选育效率，缩短了育种进程。

附图说明

图1为本发明实施例中PbBa8.1与FAE1附近的物理图谱；

图2a为本发明实施例中ECD04种子脂肪酸气相色谱图；

图2b为本发明实施例中华双五号种子脂肪酸气相色谱图；

图3为本发明实施例中ECD04和华双5号的FAE1基因序列比对及差异位点；

图4为本发明实施例中Pb1、Pb2、Fa1、Fa2在亲本、F1及部分 F2代个体中的扩增结果；

图5为本发明实施例中Pb1、Pb2、Fa1、Fa2在对照以及F3代个体中的扩增结果。

具体实施方式

以下结合附图及实施例对本发明作进一步详细说明。

参见图1-5所示，本发明实施例提供一种抗根肿病且籽粒低芥酸的甘蓝型油菜选育方法，包括：

S1、构建分离群体：将含根肿病抗性位点PbBa8.1高芥酸亲本 WZ491与感病低芥酸亲本华双5号杂交，再自交获得F2代，对分离群体中296个单株进行根肿病抗性位点PbBa8.1是我有无以及高芥酸基因FAE1和低芥酸基因fae1的分子标记鉴定；

S2、用CTAB法对待测材料进行基因组DNA的提取，具体步骤为：

1、在1.5ml离心管中加入498uL 1×CTAB提取液(2％CTAB， 100mmol/L Tris-HCl，20mmol/L EDTA，1.4mol/L NaCl，)以及2uLβ -巯基乙醇，摇匀；

2、取0.2g幼嫩叶片，在液氮条件下研磨至粉末，加入到含有 CTAB提取液和β-巯基乙醇的离心管中，摇匀；

3、随后将离心管放入65℃水浴中，每隔5分钟摇一次，水浴 30min；

4、取出离心管，加入等体积的氯仿:异戊醇混合物(24:1)，摇晃 10min后，常温下12000r/min离心10min；

5、将上清液转移到另一离心管中，加入等体积的氯仿:异戊醇 (24:1)，摇晃10min后，常温下12000r/min离心10min；

6、将上清液移至另一离心管当中，加入2倍体积事先预冷的无水乙醇，混匀后，将抱团的DNA挑入到装有400uL TE缓冲液的离心管中溶解；

7、加入1.5uL RNaseA(10ug/uL),混匀后37℃保存30min；

8、重复步骤5；

9、将上清液转移到另一离心管中，向离心管中加入50uL 3mol/L NaAC溶液和预冷的等体积的异丙醇，-20℃沉淀20min；4℃条件下 12000r/m离心10min，弃掉上清液，加入75％的乙醇清洗2次；

10、在超净工作台上风干DNA，加入50μL TE(Tris-EDTA) 溶解DNA，-20℃冰箱中保存。

S3、PCR扩增：

a.反应体系：20μL体系，各组分物质的含量分别为15ng模板 DNA；5pmol·L^-1扩增引物；1.0mmol·L^-1脱氧核糖核苷三磷酸；1.0uL 10×PCR Buffer；0.5U Taq DNA聚合酶；使用ddH₂O补齐20μL，混匀，离心；

b.扩增程序：预变性94℃/5min；94℃/30s；55℃/30s；72℃/1mins； 35个循环后；72℃延伸10min；最后4℃保存；

c.电泳：

将PCR扩增产物与等体积的上样缓冲液混合(98％甲酰胺，10mM EDTA，0.001％二甲苯腈蓝和溴酚蓝)；之后在琼脂糖凝胶电泳仪上进行琼脂糖凝胶(1％)电泳，100V条件下电泳30分钟；电泳结束后，在紫外灯下观察、成像。

S4、使用标记引物对Pb1、Pb2、Fa1、Fa2检测扩增结果是否含有根肿病抗性位点PbBa8.1及高、低芥酸基因fae1并分类；

在一个实施例中，步骤S4具体包括：

①在使用Pb1引物对扩增结果中如果能够检测到278bp条带，则带有278bp条带的材料含有根肿病抗性位点PbBa8.1，记为B，否则记为A；

②在使用Pb2引物对扩增结果中如果能够检测到278bp条带，则带有278bp条带的材料不含根肿病抗性位点PbBa8.1，记为B，否则记为A；

③在使用Fa1引物对扩增结果中如果能够检测到616bp条带，则带有616bp条带的材料含有低芥酸基因fae1，记为B，否则记为A；

④在使用Fa2引物对扩增结果中如果能检测到616bp条带，则带有616bp条带的材料含有高芥酸基因FAE1，记为B，否则记为A。

此内容中，A或B仅用来记录标记带型，有条带记为B,无条带记为A，这对不同标记来说是一致的。具体A或者B的意义要结合对应的标记理解，如上述实验中①和②中B均代表有条带，A均代表无条带。

296个单株各类型比例如下：

抗病高芥酸：抗病低芥酸：感病高芥酸：感病低芥酸＝212：4：2： 78

经卡方测验不符合9：3：3：1的孟德尔独立分配规律 (χ²＝617.42>χ² _0.05,3＝7.81)。以上结果表明：根肿病抗性位点PbBa8.1 与高芥酸基因FAE1之间存在遗传连锁，经计算其重组频率1.86％。这说明在抗病基因为杂合状态下，欲获得抗病低芥酸的1.86个个体，所需群体需含100个或以上的单株，这为后续的抗根肿病育种设计提供了重要的理论支撑。

S5、以含有根肿病抗性位点PbBa8.1且高芥酸的甘蓝型油菜为亲本，常规易感根肿病的低芥酸甘蓝型油菜品种为亲本杂交并自交，或回交后代播种于育苗穴盘；育苗期提取叶片DNA并利用分子标记筛选出含有根肿病抗性位点和低芥酸基因的单株后移栽入大田后续选择农艺性状优良的单株不断自交；结合标记辅助选择抗病位点和低芥酸基因纯合的新品种。

利用分子标记辅助选择抗根肿病且籽粒低芥酸的甘蓝型油菜

以含抗根肿病位点PbBa8.1的甘蓝型油菜‘CZ491’为父本，10 份易感染根肿病的优良甘蓝型油菜自交系为母本杂交获得F1，选择单株F1自交构建F2分离群体。于2016年9月26日种植于湖北省枝江市问安镇根肿病重灾区，同年12月17日进行抗病性鉴定，12个系F2群体全部出现抗感分离，取其中两个系统计发病情况并取样标记鉴定，结果如表1所示：

表1 F2群体抗病性田间接种鉴定结果

F2群体的抗感分离比符合3：1。(χ²＜χ²0.05(1)＝3.84)。收获抗病单株自交种第二年9月播种在育苗穴盘，在苗期利用本发明提供引物序列对F3群体进行基因型分析选择同时含有根肿病抗性位点 PbBa8.1和低芥酸基因fae1的单株移栽到大田，选择生育期一致、农艺性状表现良好的抗根肿病且籽粒低芥酸的材料。利用近红外扫描仪测得4个低芥酸株系芥酸含量如表2所示，同时对该4个株系进行接种鉴定均符合3：1的抗感分离比如图5所示，这说明本申请专利中所设计的基因特性标记可以较完美地应用于抗根肿病低芥酸育种过程中。

表2 F3代抗根肿病低芥酸株系芥酸含量及标记结果

注：B表示有条带，A表示无条带

本发明不局限于上述实施方式，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也视为本发明的保护范围之内。本说明书中未作详细描述的内容属于本领域专业技术人员公知的现有技术。

序列表

<110> 华中农业大学

<120> 一种甘蓝型油菜高芥酸基因的分子标记及选育方法

<141> 2018-07-25

<160> 9

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1521

<212> DNA

<213> 甘蓝型油菜(Brassica napus)

<400> 1

atgacgtccg ttaacgtaaa gctcctttac cattacgtca taaccaacct tttcaacctt 60

tgcttctttc cgttaacggc gatcgtcgcc ggaaaagcct atcggcttac catagacgat 120

cttcaccact tatactattc ctatctccaa cacaacctca taaccatcgc tccactcttt 180

gccttcaccg ttttcggttc ggttctctac atcgcaaccc ggcccaaacc ggtttacctc 240

gttgagtact catgctacct tccaccaacg cattgtagat caagtatctc caaggtcatg 300

gatatctttt atcaagtaag aaaagctgat ccttctcgga acggcacgtg cgatgactcg 360

tcgtggcttg acttcttgag gaagattcaa gaacgttcag gtctaggcga tgaaactcac 420

gggcccgagg ggctgcttca ggtccctccc cggaagactt ttgcggcggc gcgtgaagag 480

acggagcaag ttatcattgg tgcgctagaa aatctattca agaacaccaa cgttaaccct 540

aaagatatag gtatacttgt ggtgaactca agcatgttta atccaactcc atcgctctcc 600

gcgatggtcg ttaacacttt caagctccga agcaacgtaa gaagctttaa ccttggtggc 660

atgggttgta gtgccggcgt tatagccatt gatctagcaa aggacttgtt gcatgtccat 720

aaaaatacgt atgctcttgt ggtgagcaca gagaacatca cttataacat ttacgctggt 780

gataataggt ccatgatggt ttcaaattgc ttgttccgtg ttggtggggc cgctattttg 840

ctctccaaca agcctggaga tcgtagacgg tccaagtacg agctagttca cacggttcga 900

acgcataccg gagctgacga caagtctttt cgttgcgtgc aacaaggaga cgatgagaac 960

ggcaaaatcg gagtgagttt gtccaaggac ataaccgatg ttgctggtcg aacggttaag 1020

aaaaacatag caacgttggg tccgttgatt cttccgttaa gcgagaaact tctttttttc 1080

gttaccttca tgggcaagaa acttttcaaa gataaaatca aacattacta cgtcccggat 1140

ttcaaacttg ctattgacca tttttgtata catgccggag gcagagccgt gattgatgtg 1200

ctagagaaga acctagccct agcaccgatc gatgtagagg catcaagatc aacgttacat 1260

agatttggaa acacttcatc tagctcaata tggtatgagt tggcatacat agaagcaaaa 1320

ggaaggatga agaaaggtaa taaagtttgg cagattgctt tagggtcagg ctttaagtgt 1380

aacagtgcag tttgggtggc tctaaacaat gtcaaagctt cgacaaatag tccttgggaa 1440

cactgcatcg acagataccc ggtcaaaatt gattctgatt caggtaagtc agagactcgt 1500

gtccaaaacg gtcggtccta a 1521

<210> 2

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

tccccatatg atggttttcg aa 22

<210> 3

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

caagaaactc ttctactttg ttaat 25

<210> 4

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

tccccatatg atggttttgg gg 22

<210> 5

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

caagaaactc ttctactttg tctg 24

<210> 6

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

ggccgctatt ttgctcac 18

<210> 7

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

gtgttcccaa ggactatttg ac 22

<210> 8

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

gggccgctat tttgctatt 19

<210> 9

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

gtgttcccaa ggactatttg ac 22

Claims (7)

1.一种与芜菁抗根肿病基因位点PbBa8.1紧密连锁的分子标记高芥酸基因FAE1的序列，其序列为SEQ ID NO.1所示。

2.检测如权利要求1所述的油菜A08染色体根肿病抗性位点PbBa8.1存在的引物对Pb1，其特征在于，该引物为：

正向引物序列为5’-tccccatatgatggttttcgaa-3’；

反向引物序列为5’-caagaaactcttctactttgttaat-3’。

3.检测如权利要求1所述的油菜A08染色体根肿病抗性位点PbBa8.1不存在的引物对Pb2，其特征在于，该引物为：

正向引物序列为5’-tccccatatgatggttttgggg-3’，

反向引物序列为5’-caagaaactcttctactttgtctg-3’。

4.检测如权利要求1所述的油菜A08染色体低芥酸基因fae1存在的引物对Fa1，其特征在于，该引物为：

正向引物序列为5’-ggccgctattttgctcac-3’，

反向引物序列为5’-gtgttcccaaggactatttgac-3’。

5.检测如权利要求1所述的油菜A08染色体高芥酸基因FAE1不存在的引物对Fa2，其特征在于，该引物为：

正向引物序列为5’-gggccgctattttgctatt-3’

反向引物序列为5’-gtgttcccaaggactatttgac-3’。

6.一种抗根肿病且籽粒低芥酸的甘蓝型油菜选育方法，其特征在于，包括：

S1、含根肿病抗性位点PbBa8.1高芥酸亲本WZ491与不抗病低芥酸亲本华双5号杂交，再自交获得F2代，对分离群体中296个单株进行根肿病抗性位点PbBa8.1以及高芥酸基因FAE1和低芥酸基因fae1的分子标记鉴定；

S2、用CTAB法对待测材料进行基因组DNA的提取

S3、PCR扩增：

a.反应体系：20μL体系，各组分物质的含量分别为15ng模板DNA；5pmol·L^-1引物；1.0mmol·L^-1脱氧核糖核苷三磷酸；1.0uL 10×PCR缓冲液；0.5U Taq DNA聚合酶；ddH₂O补齐20μL，混匀，离心；

b.扩增程序：预变性94℃/5min；94℃/30s；55℃/30s；72℃/1mins；35个循环后；72℃延伸10min；最后4℃保存；

c.电泳：

将PCR扩增产物与等体积的上样缓冲液混合(98％甲酰胺，10mM EDTA，0.001％二甲苯腈蓝和溴酚蓝)；之后在琼脂糖凝胶电泳仪上进行琼脂糖凝胶(1％)电泳，100V条件下电泳30分钟；电泳结束后，在紫外灯下观察、成像。

S4、使用标记引物对Pb1、Pb2、Fa1、Fa2检测扩增结果是否含有根肿病抗性位点PbBa8.1及高、低芥酸基因并分类；

S5、以含有根肿病抗性位点PbBa8.1且高芥酸的甘蓝型油菜为亲本，常规易感根肿病的低芥酸甘蓝型油菜品种为亲本杂交并自交，或回交后代播种于育苗穴盘；育苗期提取叶片DNA并利用分子标记筛选出含有根肿病抗性位点和低芥酸基因的单株后移栽入大田后续选择农艺性状优良的单株不断自交；结合标记辅助选择抗病位点和低芥酸基因纯合的新品种。

7.如权利要求6所述的抗根肿病且籽粒低芥酸的甘蓝型油菜选育方法，其特征在于，步骤S4包括：

①在使用Pb1引物对扩增结果中如果能够检测到278bp条带，则带有278bp条带的材料含有根肿病抗性位点PbBa8.1，记为B，否则记为A；

②在使用Pb2引物对扩增结果中如果能够检测到278bp条带，则带有278bp条带的材料不含根肿病抗性位点PbBa8.1，记为B，否则记为A；

③在使用Fa1引物对扩增结果中如果能够检测到616bp条带，则带有616bp条带的材料含有低芥酸基因fae1，记为B，否则记为A；

④在使用Fa2引物对扩增结果中如果能检测到616bp条带，则带有616bp条带的材料含有高芥酸基因FAE1，记为B，否则记为A。