CN116103432B - 根肿病抗性分子标记及其检测引物和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于油菜育种技术领域，尤其涉及根肿病抗性分子标记及其检测引物和应用。所述根肿病抗性分子标记位于甘蓝型油菜A8染色体19017764bp处，该处的核苷酸为A或者C。本发明基于抗病材料和感病材料在A8染色体19017764bp的SNP变异为培育遗传稳定的抗根肿病油菜新品种提供了新的根肿病抗性分子标记，该分子标记位点在感病材料基因组中为腺嘌呤，而在抗病材料中突变为了胞嘧啶，能从基因型水平有效区分抗感材料，且与表现型一致性高，可在育种过程中的任何时期根据例如PCR扩增检测基因型对甘蓝型油菜进行分型，提高了抗病品系的筛选效率，有利于缩短育种年限，大大减少抗病品种选育时间与工作量。
Description
技术领域
本发明涉及油菜育种技术领域，特别涉及根肿病抗性分子标记及其检测引物和应用。
背景技术
油菜是一种种植范围大、用途广、经济价值高、发展潜力大的油料作物，是我国乃至全世界的主要油料作物之一，在我国的国民经济中占有重要的地位。近年来，我国油菜主产区根肿病频发，导致我国部分地区油菜产量和品质严重下降，成为制约优质菜籽油供给的主要因素之一。根肿病，俗称十字花科“癌症”，是由芸苔根肿菌(Plasmo-diophorabrassicae Wor.)引起的专性侵染十字花科作物的土传病害。油菜受感染后，通常会造成苗期根部肿大，萎蔫死亡或生长迟缓，矮小减产、重则绝产，种子含油量下降4.7-6.1％，造成年经济损失高达1.3亿余元。迄今为止，国内外主要采用传统的化学方法来防治根肿病，但不能从根本上解决油菜根肿病传播，同时也带来了环境的污染，不利于农业的可持续发展。选育抗病品种被认为是防治根肿病最为安全、经济和有效的措施。
虽然在甘蓝型油菜祖先种白菜中已有30多个抗根肿病(Clubroot Resistance，CR)基因被定位，但仅克隆到3个抗根肿病基因：CRa、Crr1a以及CRb，均被鉴定为TIR-NBS-LRR家族抗性基因，且通过序列比较和功能分析发现，CRa和CRb实际上是同一个基因。目前，甘蓝型油菜材料中抗根肿病种质资源实际比较稀少，导致其抗病研究相对滞后，且甘蓝型油菜材料抗根肿病基因位点信息也极少，难以满足甘蓝型油菜根肿病抗性育种的要求。近年来，部分团队通过回交转育等方法在油菜抗病品种筛选及培育方面取得了一定的进展，华中农业大学张椿雨教授团队以ECD04为供体，将其中抗4号生理小种的位点PbB8.1采用回交及分子标记辅助选择方法定向地转育到油菜常规品种‘华双5号’中，由此培育出了抗根肿病常规新品种‘华双5R’，已成为大规模种植的商品种；通过含抗病基因CRb白菜与杂交种“华油杂62”的恢复系品种间的杂交、回交以及前景标记和背景标记筛选等过程最终培育出了‘华油杂62R’是我国首个抗根肿病油菜新杂交种，对四川、安徽等地的根肿菌田间抗病性鉴定结果表明该品种均表现出免疫抗性。但前述报道中公开的育种手段存在周期长、效率低下的问题。
基于基因型选择的现代分子标记辅助育种技术，可以大大提高性状选择的效率，加速育种进程。单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism，SNP)是植物基因组内数量最多、分布最广的分子标记，通过筛选有效的分子标记用于新品种选育，有助于打破遗传连锁、提高育种效率。当前，我国甘蓝型油菜抗根肿病种质资源缺乏，抗根肿病的油菜品种少，开发更多有利于对资源筛选鉴定和辅助育种的分子标记对于我国甘蓝型油菜抗根肿病育种来说具有十分重要的战略意义。
发明内容
针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种根肿病抗性分子标记，并提供了用于检测该根肿病抗性分子标记的检测引物，以及该检测引物在油菜育种中的应用，尤其是在甘蓝型油菜根肿病抗性检测中的应用，目的在于解决现有技术中的一部分问题或至少缓解现有技术中的一部分问题。
本发明具体通过以下技术方案实现：
本发明的第一方面提供了一种根肿病抗性分子标记，所述根肿病抗性分子标记位于甘蓝型油菜A8染色体19017764bp处，该处的核苷酸为A或者C。
进一步地，所述根肿病抗性分子标记的基因型包括AA、CC和AC/CA；其中，基因型为AA时，所述甘蓝型油菜表现为感病，基因型为CC时，所述甘蓝型油菜表现为抗病，基因型为AC/CA时，其为杂合型。
本发明的第二方面提供了一种检测引物，用于检测如上所述的根肿病抗性分子标记，所述检测引物包括上游引物和下游引物；所述上游引物包括CR-317-F1和CR-317-F2，核苷酸序列分别如SEQ ID NO：1-2所示；所述下游引物包括CR-317-R，核苷酸序列如SEQ IDNO：3所示。
进一步地，所述上游引物的一端连接有荧光基团。
进一步地，CR-317-F1、CR-317-F2和CR-317-R的质量比为6：6：15。
本发明的第三方面提供了一种试剂盒，用于检测如上所述的根肿病抗性分子标记，所述试剂盒包括如上所述的用于检测根肿病抗性分子标记的检测引物。
进一步地，所述试剂盒还包括Master Mix。
本发明的第四方面提供了如上所述的检测引物在油菜育种中的应用，所述应用包括筛选和培育抗根肿病油菜品系。
本发明的第五方面提供了一种甘蓝型油菜根肿病抗性检测方法，包括以下步骤：
S1、提取待检测油菜的基因组DNA；
S2、利用如SEQ ID NO：1-3所示的检测引物进行PCR扩增，检测扩增时的荧光信号，根据所述荧光信号判断所述待检测油菜的抗性类型。
进一步地，所述PCR扩增的反应体系以10μL计，包含2μL基因组DNA、5μL 2×MasterMix、1.4μL Primer Mix和1.6μL ddH2O；所述Primer Mix包含CR-317-F1、CR-317-F2、CR-317-R和ddH2O，其中，CR-317-F1、CR-317-F2、CR-317-R和ddH2O质量比为6：6：15：23。
进一步地，所述PCR扩增的反应程序包括：94℃预变性15min；采取降落PCR方式，94℃变性20s，60℃退火1min，60℃降落到48℃，每个循环降低1.2℃，循环10次；94℃变性20s，55℃延伸1min，循环30次；37℃保温1min，最后1s采集荧光信号。
本发明的优点及积极效果为：
本发明基于抗病材料和感病材料在A8染色体19017764bp的SNP变异为培育遗传稳定的抗根肿病油菜新品种提供了新的根肿病抗性分子标记，该根肿病抗性分子标记位点在感病材料基因组中为腺嘌呤，而在抗病材料中突变为了胞嘧啶，由此导致精氨酸突变为丝氨酸，这极有可能导致蛋白质功能发生改变，从而使甘蓝型油菜从感病变为抗病表型。本发明的根肿病抗性分子标记能从基因型水平有效区分抗感材料，且与表现型一致性高，可在育种过程中的任何时期根据例如PCR扩增检测基因型对甘蓝型油菜进行分型，提高了抗病品系的筛选效率，有利于缩短育种年限，大大减少抗病品种选育时间与工作量。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单的介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明实施例基于根肿病抗性分子标记对138份甘蓝型油菜的基因分型图；
图2为本发明实施例基于根肿病抗性分子标记对138份甘蓝型油菜进行基因分型后的不同基因型间的表型差异图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例对本发明进行进一步详细说明，各实施例及试验例中所用的设备和试剂如无特殊说明，均可从商业途径得到。此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
根据本申请包含的信息，对于本领域技术人员来说可以轻而易举地对本发明的精确描述进行各种改变，而不会偏离所附权利要求的精神和范围。应该理解，本发明的范围不局限于所限定的过程、性质或组分，因为这些实施方案以及其他的描述仅仅是为了示意性说明本发明的特定方面。实际上，本领域或相关领域的技术人员明显能够对本发明实施方式作出的各种改变都涵盖在所附权利要求的范围内。
为了更好地理解本发明而不是限制本发明的范围，在本申请中所用的表示用量、百分比的所有数字、以及其他数值，在所有情况下都应理解为以词语“大约”所修饰。因此，除非特别说明，否则在说明书和所附权利要求书中所列出的数字参数都是近似值，其可能会根据试图获得的理想性质的不同而加以改变。各个数字参数至少应被看作是根据所报告的有效数字和通过常规的四舍五入方法而获得的。
为使本发明的上述目的、特征和优点能够更为明显易懂，下面结合附图对本发明的具体实施例做详细说明。
本发明实施例提供了一种根肿病抗性分子标记，所述根肿病抗性分子标记位于甘蓝型油菜A8染色体19017764bp处，该处的核苷酸为A或者C。即，在A8染色体19017764bp处存在单核苷酸多态性(SNP)，该处的核苷酸具有一个A/C的等位基因突变，导致该SNP位点的基因型呈现为AA、CC和AC/CA。其中，基因型为AA时，甘蓝型油菜表现为感病，基因型为CC时，甘蓝型油菜表现为抗病，基因型为AC/CA时，其为杂合型。
本发明在不同环境下的近2000份甘蓝型油菜中筛选获得了1份高抗辽宁新民根肿菌的种质资源，命名为317，利用该抗病种质资源317与另一份感病甘蓝型油菜材料中双11杂交，构建了包含300个单株的F2分离群体，并对该分离群体按单株取叶片置于-20℃冰箱留存，且套袋自交获得F2：3株系，对群体中63个F2：3株系通过菌土法进行温室人工接种根肿菌鉴定，每个株系鉴定15-18个单株。根据抗性表型鉴定结果，在表现极端抗病(完全抗病)和感病(抗性分级中1-3级)的F2单株中分别筛选14株和15株混池测序(BSA)，通过BSA分析，在A8染色体19017764bp(BnaA08G0126600ZS)处鉴定到了一个与甘蓝型油菜根肿病抗性显著关联的单核苷酸多态性位点，该SNP位点在中双11参考基因组中为腺嘌呤(A)，而在抗病种质资源317以及抗病材料R-Pool中突变为了胞嘧啶(C)，该碱基突变将导致精氨酸突变为丝氨酸，这极有可能导致该基因编码的蛋白质功能发生改变，从而使甘蓝型油菜从感病变为抗病。经群体验证，本发明提供的SNP位点能将138个单株划分成三种类型Genotype A(基因型为纯合型AA)、Genotype B(基因型为纯合型CC)、Genotype C(基因型为杂合型AC/CA)，三种类型间对根肿菌的抗性反应(病情指数)差异达到极显著水平，能从基因型水平有效区分抗感材料。因此，本发明所提供的根肿病抗性分子标记可以作为甘蓝型油菜育种标记辅助抗根肿病品种的筛选和培育，为培育遗传稳定的抗根肿病油菜新品种提供了新的分子标记，丰富了抗根肿病的种质资源；而且其从基因水平区分抗感材料，可在育种过程中的任何时期根据例如PCR扩增检测基因型对甘蓝型油菜单株进行有效筛选，提高了抗菌品系的筛选效率，有利于缩短育种年限，大大减少选育时间与工作量。
本发明实施例还提供了用于检测上述所述的根肿病抗性分子标记的检测引物，所述检测引物包括上游引物和下游引物，所述上游引物包括2条特异性引物(CR-317-F1和CR-317-F2)，所述下游引物包括1条通用性引物(CR-317-R)，具体的核苷酸序列如下：
CR-317-F1：GAAGGTCGGAGTCAACGGATTGCGTTATCCTCAACACCAGA(见SEQ ID
NO：1)；
CR-317-F2：GAAGGTGACCAAGTTCATGCTGCGTTATCCTCAACACCAGC(见SEQ ID NO：2)；
CR-317-R：TAGCGGCATCGCAGGCACAT(见SEQ ID NO：3)。
本发明基于竞争性等位基因特异性PCR(Kompetitive Allele-Specific PCR，KASP)技术，利用根肿病抗性分子标记位点及上、下游特异序列设计检测引物组，上游引物的一端设有用于连接荧光基团的特异性接头序列，利用该引物组扩增待检测样本，再通过计算机记录并分析PCR扩增过程中产生的荧光信号，可以实现对SNP位点的单核苷酸变异进行监测。示例性地，引物CR-317-F1带红色荧光，引物CR-317-F2带绿色荧光，当只检测到红色荧光，则说明A8染色体19017764bp处核苷酸只为A，则判定甘蓝型油菜样品的SNP位点为感病等位基因，基因型定义为AA，若只检测到绿色荧光，则说明A8染色体19017764bp处核苷酸只为C，则判定该位点为抗病等位基因，基因型定义为CC，若检测位点同时检测到红色荧光和绿色荧光，则说明SNP位点同时存在A和C，则判定为杂合体，基因型定义为AC/CA。本发明的检测结果与待检测样本抗感病的表现型一致性高，经群体验证，利用上述引物的扩增效果最佳，可以明显、有效区分出甘蓝型油菜中SNP位点的基因型，实现快速、精确检测上述的核苷酸突变位点，为油菜抗根肿病品种选育提供一种准确快速有效的方法。
可选地，所述上游引物的一端连接荧光基团，所述荧光基团包括但不限于FAM和HEX。
可选地，所述上游引物和所述下游引物的质量比为：CR-317-F1：CR-317-F2：CR-317-R＝6：6：15。
本发明另一实施例提供了一种用于检测上述所述的根肿病抗性分子标记的试剂盒，所述试剂盒包括如上所述的检测引物。
所述试剂盒相对于现有技术的优势与如上所述的检测引物相对于现有技术所具有的优势相同，在此不再赘述。
可选地，所述试剂盒还包括Master Mix，其主要包含50mM MgCl2和DMSO，购置于英国，货号为：KBS-1050-122。
本发明又一实施例提供给了如上所述的试剂盒或如上所述的检测引物在油菜育种中的应用，尤其是在筛选和培育抗根肿病油菜品系中的应用。
所述应用相对于现有技术的优势与如上所述的试剂盒或如上所述的检测引物相对于现有技术所具有的优势相同，在此不再赘述。
本发明再一实施例提供给了一种甘蓝型油菜根肿病抗性检测方法，包括以下步骤：
S1、提取待检测油菜的基因组DNA；
S2、利用如SEQ ID NO：1-3所示的检测引物进行PCR扩增，检测扩增时的荧光信号，根据所述荧光信号判断所述待检测油菜的抗性类型。
本发明只需PCR扩增和荧光检测两个步骤，即可实现在基因水平区分SNP变异，成本低、通量高、特异性强，特别适用于育种群体中不同抗性基因型的分类筛选与鉴定。
可选地，所述PCR扩增的反应体系以10μL计，包含2μL基因组DNA、5μL 2×MasterMix、1.4μL Primer Mix和1.6μL ddH2O；所述Primer Mix包含CR-317-F1、CR-317-F2、CR-317-R和ddH2O，其中，CR-317-F1、CR-317-F2、CR-317-R和ddH2O质量比为6：6：15：23。
可选地，所述PCR扩增的反应程序包括：94℃预变性15min；采取降落PCR方式，94℃变性20s，60℃退火1min，60℃降落到48℃，每个循环降低1.2℃，循环10次；94℃变性20s，55℃延伸1min，循环30次；37℃保温1min，最后1s采集荧光信号。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照制造厂商所建议的条件。
1、资源筛选
在不同环境下通过多次鉴定，在近2000份甘蓝型油菜中筛选获得了1份抗根肿病种质资源，命名为：CR-317。
2、群体构建
利用抗根肿病种质资源CR-317与另一份感病甘蓝型油菜材料中双11杂交，构建包含300个单株的F2分离群体，并对该分离群体按单株取叶片置于-20℃冰箱留存，且套袋自交获得F2：3株系。
3、根肿病抗性鉴定和SNP多态性位点筛选
对63个F2：3株系在温室中利用菌土法接种带有辽宁新民田间根肿菌的病根，每个株系接种15-18个单株。菌土法的具体操作如下：将田间采集的感染根肿病的新鲜病根洗净，经过一定的腐烂后用破碎机将其破碎，并用八层纱布过滤，得到根肿菌孢子悬浮液。利用血球计数板计算悬浮液母液孢子浓度，之后将浓度稀释至1×106个/mL，利用稀释后的孢子悬浮液拌营养土，直至菌土达到握之成形落地而散的状态。将在培养皿发芽7天后的甘蓝型油菜材料移栽至前述菌土中，接种后40天拔苗，通过肉眼观察其对根肿菌的抗性。抗性分级标准如下：
0级：根部未见根肿出现；
1级：仅在侧根部见少量肿瘤；
2级：2/3侧根现肿瘤或小于2/3主根呈现膨大；
3级：主根>2/3部分呈现膨大甚至溃烂。
根据抗性表型观察结果，在表现极端抗病(完全抗病，分级为0级)和感病(分级包含1-3级)的F2单株中分别筛选14株和15株混样，进行混池测序(BSA)。
通过BSA分析发现，在A8染色体19017764bp(BnaA08G0126600ZS)处鉴定到了一个与甘蓝型油菜根肿病抗性显著关联的单核苷酸多态性(SNP)位点，即为本发明的根肿病抗性分子标记。该位点在中双11(Brassica_napus.ZS11.v0.genome.fa)(分级为3级)参考基因组中为腺嘌呤(A)，而在抗病材料317以及抗病R-Pool中突变为了胞嘧啶(C)，从而导致精氨酸突变为丝氨酸，该突变极有可能导致该基因编码的蛋白质功能发生改变。
4、检测引物设计和KASP标记开发
针对上述SNP等位变异，设计了2条特异性上游引物和一条通用下游引物，每条上游引物上游有特异性序列(下划线所示)，可与荧光基团结合，不同颜色荧光即反映了不同的SNP等位变异，使用荧光定量PCR仪对实验结果进行检测即能够分辨不同的等位变异。检测引物的核苷酸序列如下：
CR-317-F1：GAAGGTCGGAGTCAACGGATTGCGTTATCCTCAACACCAGA(HEX)(见SEQ ID NO：1)；
CR-317-F2：GAAGGTGACCAAGTTCATGCTGCGTTATCCTCAACACCAGC(FAM)(见SEQ ID NO：2)；
CR-317-R：TAGCGGCATCGCAGGCACAT(见SEQ ID NO：3)。
引物CR-317-F1和引物CR-317-F2的最后一个核苷酸位点为SNP突变位点，引物CR-317-F1只能在识别最后一个核苷酸为A时，基因序列才能全部被扩增，根据引物CR-317-F1的“GAAGGTCGGAGTCAACGGATT”接枝的荧光基团在荧光定量PCR仪上显现出对应的颜色，可以区分SNP突变位点的核苷酸类型。引物CR-317-F2同理。
5、群体验证
利用抗根肿病种质资源CR-317与另一份感病甘蓝型油菜材料中双11杂交产生F1，对该F1进行自交产生的F2单株进行基因型鉴定。提取F2单株的基因组DNA，利用上述的检测引物进行PCR扩增和荧光检测，反应体系以10μL计，包含2μL基因组DNA、5μL 2×MasterMix、1.4μL Primer Mix和1.6μL ddH2O；所述Primer Mix包含CR-317-F1、CR-317-F2、CR-317-R和ddH2O，其中，CR-317-F1、CR-317-F2、CR-317-R和ddH2O质量比为6：6：15：23；反应程序包括：94℃预变性15min；采取降落PCR方式，94℃变性20s，60℃退火1min，60℃降落到48℃，每个循环降低1.2℃，循环10次；94℃变性20s，55℃延伸1min，循环30次；37℃保温1min，最后1s采集荧光信号。其中红色荧光表示感病基因型，绿色荧光表示抗病基因型，蓝色表示中间型，结果见图1-2。需要说明的是，具体的荧光信号颜色可根据实验需要进行针对性的选择。
同时对F2群体进行根肿病抗性鉴定，根肿菌的接种方法同上，之后肉眼观察F2群体中不同单株对根肿菌的抗性分级情况。
从图1可以看出，本发明提供的根肿病抗性分子标记能将138个单株划分成三种类型Genotype A、Genotype B、Genotype C，Genotype A为感病等位变异(AA)，Genotype C为抗病等位变异(CC)，而Genotype B则为杂合型(AC/CA)，三种类型间对根肿菌的抗性反应(病情指数)差异达到极显著水平(见图2)，病情指数＝(∑(各级病株数×该病级值)/(调查总株数×最高病级))×100，且基因型与抗性分级标准进行表型鉴定的结果一致，这说明本发明的根肿病抗性分子标记能从基因型水平有效区分抗感材料，为鉴定种质资源的抗病性带来便捷。
综上，本发明基于抗病材料和感病材料在A8染色体19017764bp的SNP变异为培育遗传稳定的抗根肿病油菜新品种提供了新的分子标记，该分子标记能从基因型水平有效区分抗感材料，且与表现型一致性高，通过PCR扩增检测基因型的分型效果良好，有利于大大提高育种效率，缩短育种进程。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (8)
1.一种竞争性等位基因特异性PCR检测引物，其特征在于，用于检测甘蓝型油菜根肿病抗性分子标记，所述检测引物包括上游引物和下游引物；
所述上游引物为CR-317-F1和CR-317-F2，核苷酸序列分别如SEQ ID NO：1-2所示；
所述下游引物为CR-317-R，核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示。
2.根据权利要求1所述的竞争性等位基因特异性PCR检测引物，其特征在于，所述上游引物的一端连接有荧光基团。
3.根据权利要求1所述的竞争性等位基因特异性PCR检测引物，其特征在于，CR-317-F1、CR-317-F2和CR-317-R的质量比为6：6：15。
4.一种试剂盒，其特征在于，用于检测甘蓝型油菜根肿病抗性分子标记，所述试剂盒包括如权利要求1-3任一项所述的竞争性等位基因特异性PCR检测引物。
5. 根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，还包括Master Mix。
6.如权利要求1-3任一项所述的竞争性等位基因特异性PCR检测引物在甘蓝型油菜育种中的应用，其特征在于，所述甘蓝型油菜育种为筛选和培育抗根肿病甘蓝型油菜品系；
其中，CR-317-F1和CR-317-F2的一端连接有荧光基团；当仅检测到CR-317-F1连接的荧光基团的荧光信号时，判定所述甘蓝型油菜表现为感病，当仅检测到CR-317-F2连接的荧光基团的荧光信号时，判定所述甘蓝型油菜表现为抗病，当同时检测到CR-317-F1和CR-317-F2连接的荧光基团的荧光信号时，判定所述甘蓝型油菜表现为杂合型。
7.一种甘蓝型油菜根肿病抗性检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、提取待检测甘蓝型油菜的基因组DNA；
S2、利用如权利要求1-3任一项所述的竞争性等位基因特异性PCR检测引物进行PCR扩增，检测扩增时的荧光信号，根据所述荧光信号判断所述待检测甘蓝型油菜的抗性类型；
其中，CR-317-F1和CR-317-F2的一端连接有荧光基团；当仅检测到CR-317-F1连接的荧光基团的荧光信号时，判定所述甘蓝型油菜表现为感病，当仅检测到CR-317-F2连接的荧光基团的荧光信号时，判定所述甘蓝型油菜表现为抗病，当同时检测到CR-317-F1和CR-317-F2连接的荧光基团的荧光信号时，判定所述甘蓝型油菜表现为杂合型。
8. 根据权利要求7所述的甘蓝型油菜根肿病抗性检测方法，其特征在于，所述PCR扩增的反应体系以10μL计，包含2μL基因组DNA、5μL 2× Master Mix、1.4μL Primer Mix和1.6μL ddH2O；所述Primer Mix包含CR-317-F1、CR-317-F2、CR-317-R和ddH2O，其中，CR-317-F1、CR-317-F2、CR-317-R和ddH2O质量比为6：6：15：23；
所述PCR扩增的反应程序包括：94℃预变性15min；采取降落PCR方式，94℃变性20s，60℃退火1min，60℃降落到48℃，每个循环降低1.2℃，循环10次；94℃变性20s，55℃延伸1min，循环30次；37℃保温1min，最后1s采集荧光信号。
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