CN112725523B - 一种甘蓝型油菜根肿病抗性特异分子标记及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于油菜分子育种技术领域，尤其涉及一种甘蓝型油菜根肿病抗性特异分子标记及其应用。本发明鉴定到一个与甘蓝型油菜根肿病抗性显著关联的多态性位点，位于A3染色体21,271,455bp处，存在T/C突变，针对该突变位点开发了KASP标记，经群体验证，该标记能将94个单株划分成三种类型GenotypeⅠ、GenotypeⅡ、GenotypeⅢ，三种类型间对根肿菌的抗性反应(病情指数)差异达到极显著水平，能从基因型水平有效区分抗感材料。本发明所提供的分子标记可以作为抗根肿病甘蓝型油菜育种标记辅助选择，为培育遗传稳定的抗根肿病油菜新品种提供新的分子标记。

Description

一种甘蓝型油菜根肿病抗性特异分子标记及其应用

技术领域

本发明属于油菜分子育种技术领域，尤其涉及一种甘蓝型油菜根肿病抗性特异分子标记及其应用。

背景技术

油菜作为我国第一大油料作物，年产量达540万吨(FAO，2019)，且双低菜籽油在大宗食用植物油中脂肪酸组成最为合理，被公认为是最健康的保健型食用油(王汉中，2018)，因此油菜安全生产对保障我国食用油供给安全至关重要。然而近年来，我国油菜主产区根肿病大面积爆发，致使我国部分地区油菜产量和品质严重下降，严重威胁优质菜油供给。根肿病，俗称十字花科“癌症”，是由根肿菌(Plasmodiophora brassicae Wor.)引起的一种专性寄生于十字花科植物的世界性土传病害。研究表明甘蓝型油菜感染根肿菌后可致产量下降30-100％(Hwang et al.,2012)，种子含油量下降4.7-6.1％(Engqvist,1994)，造成年经济损失达1.3亿余元(贾茹，2019)。因此，筛选抗病资源，开发抗病标记是有效防控油菜根肿病，确保我国油菜产业可持续发展的重大需求。

目前在甘蓝型油菜祖先种白菜中已克隆到3个抗根肿病基因：CRa(A3,Ueno etal.,2012)、Crr1a(A8,Hatakeyama et al.,2013)以及CRb(A3,Hatakeyama et al.,2017)，均被鉴定为TIR-NB-LRR家族抗性基因，通过序列比较和功能分析发现，CRa和CRb实际上是同一个基因(Hatakeyama et al.,2017)。甘蓝型油菜中抗根肿病资源匮乏，抗病研究相对滞后，严重阻碍了抗根肿病育种的进展。华中农业大学张椿雨教授课题组通过回交和分子标记辅助选择，将ECD04(芜菁)抗性位点PbBa8.1以及白菜抗病基因CRb分别定向转育到油菜常规品种“华双5号”及杂交种“华油杂62”的恢复系中，成功培育出了我国首个甘蓝型油菜抗根肿病常规新品种“华双5R”(战宗祥等，2015)及杂交新品种“华油杂62R”(江莹芬等，2018)。在天然的甘蓝型油菜中开发更多用于资源筛选鉴定和辅助育种的分子标记对于我国甘蓝型油菜抗根肿病育种来说迫在眉睫。

发明内容

针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种甘蓝型油菜根肿病抗性特异分子标记及其应用，目的在于解决现有技术中的一部分问题或至少缓解现有技术中的一部分问题。

本发明是这样实现的，一种甘蓝型油菜根肿病抗性特异分子标记，所述分子标记为在甘蓝型油菜A3染色体21,271,455bp处存在的T/C突变。

本发明还提供了一种甘蓝型油菜根肿病抗性检测KASP标记，所述KASP标记的引物序列为：

CR-28669-F1：GAAGGTCGGAGTCAACGGATTAGCTGCTACACACTCGGCCT(HEX)；

CR-28669-F2：GAAGGTGACCAAGTTCATGCTAGCTGCTACACACTCGGCCC(FAM)；

CR-28669-R：GCTGGGGAAAGTTGTTCAATATG。

本发明还提供了一种甘蓝型油菜根肿病抗性检测方法，利用上述的引物对样品DNA进行扩增，根据荧光信号判断样品抗性类型。

进一步地，所述扩增的PCR反应体系为5μL，包含1μL DNA模板，2.5μL 2×MasterMix，0.7μL Primer Mix，0.8μL ddH₂O。

进一步地，所述扩增的PCR扩增程序为：94℃15min；采取降落PCR方式，94℃20s，60℃1min，60℃降落到48℃，每个循环降低1.2℃，循环10次；94℃20s，55℃1min，循环30次；37℃1min，最后1s采集荧光信号。

本发明还提供了如上述的分子标记，或上述的KASP标记，或上述的检测方法在抗根肿病甘蓝型油菜材料选育中的应用。

综上所述，本发明的优点及积极效果为：

本发明在不同环境下通过多次鉴定在近2000份甘蓝型油菜中筛选获得了1份抗根肿病资源，利用该抗病资源与另一份感病甘蓝型油菜材料Janpol杂交，构建了包含144个单株的F₂分离群体，并对该分离群体按单株取样留存，且套袋自交获得F2：3株系，对群体中50个F2：3株系进行了温室人工接种鉴定，每个株系鉴定12-15个单株。根据抗性表型鉴定结果，在表现极端抗病(完全抗病)和感病的F₂单株中分别筛选10株混池送样测序，通过BSA分析在A3染色体21,271,455bp(BnaA03g42350D)处鉴定到了一个与甘蓝型油菜根肿病抗性显著关联的多态性位点。该位点在Darmor参考基因组为胸腺嘧啶(T)，而在抗病材料28669以及抗病R-Pool中突变为了胞嘧啶(C)，从而导致苯丙氨酸突变为亮氨酸，该突变极有可能导致该基因编码的蛋白质功能发生改变。并进一步开发了KASP标记，经群体验证，该标记能将94个单株划分成三种类型GenotypeⅠ、GenotypeⅡ、GenotypeⅢ，三种类型间对根肿菌的抗性反应(病情指数)差异达到极显著水平，能从基因型水平有效区分抗感材料。本发明所提供的分子标记可以作为抗根肿病甘蓝型油菜育种标记辅助选择，为培育遗传稳定的抗根肿病油菜新品种提供新的分子标记。

附图说明

图1是开发的KASP标记对96份甘蓝型油菜分型图；

图2是基于KASP标记分型后的三个基因型间的表型差异图。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例对本发明进行进一步详细说明，各实施例及试验例中所用的设备和试剂如无特殊说明，均可从商业途径得到。此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

根据本申请包含的信息，对于本领域技术人员来说可以轻而易举地对本发明的精确描述进行各种改变，而不会偏离所附权利要求的精神和范围。应该理解，本发明的范围不局限于所限定的过程、性质或组分，因为这些实施方案以及其他的描述仅仅是为了示意性说明本发明的特定方面。实际上，本领域或相关领域的技术人员明显能够对本发明实施方式作出的各种改变都涵盖在所附权利要求的范围内。

为了更好地理解本发明而不是限制本发明的范围，在本申请中所用的表示用量、百分比的所有数字、以及其他数值，在所有情况下都应理解为以词语“大约”所修饰。因此，除非特别说明，否则在说明书和所附权利要求书中所列出的数字参数都是近似值，其可能会根据试图获得的理想性质的不同而加以改变。各个数字参数至少应被看作是根据所报告的有效数字和通过常规的四舍五入方法而获得的。本发明中，“约”指给定值或范围的10％以内，优选为5％以内。

本发明披露了一种甘蓝型油菜根肿病抗性特异分子标记及其应用，具体如下实施例所示。

实施例

1、资源筛选

开发者在不同环境下通过多次鉴定在近2000份甘蓝型油菜中筛选获得了1份抗根肿病资源CR-28669。

2、群体构建

开发者利用该抗病资源CR-28669与另一份感病甘蓝型油菜材料Janpol杂交，构建了包含144个单株的F₂分离群体，并对该分离群体按单株取样留存，且套袋自交获得F2：3株系。

3、根肿病抗性鉴定

开发者对上述群体中50个F2：3株系进行了温室人工接种鉴定，每个株系鉴定12-15个单株。温室人工接种鉴定采用菌土法，菌株来自四川广汉田间病根。

菌土法：将田间采集的新鲜根肿洗净经过一定的腐烂后用破碎机将其破碎，并用四层纱布过滤，得到根肿菌孢子悬浮液。利用血球计数板计算悬浮液母液孢子浓度，将浓度稀释至1*10⁶个/mL，利用稀释后的孢子悬浮液拌营养土，直至菌土达到握之成形而不散的状态。将在培养皿发芽后的材料移栽至菌土中，接种后40天拔苗鉴定其抗性。

抗性分级标准如下：

0级：根部未见根肿出现；

1级：仅在侧根部见少量肿瘤；

2级：2/3侧根现肿瘤或小于2/3主根呈现膨大；

3级：主根>2/3部分呈现膨大甚至溃烂；

4、BSA送样测序及多态性位点鉴定。

根据抗性表型鉴定结果，在表现极端抗病(完全抗病)和感病的F₂单株中分别筛选10株混池送样测序，通过BSA分析在A3染色体21,271,455bp(BnaA03g42350D)处鉴定到了一个与甘蓝型油菜根肿病抗性显著关联的多态性位点。该位点在Darmor参考基因组为胸腺嘧啶(T)，而在抗病材料28669以及抗病R-Pool中突变为了胞嘧啶(C)，从而导致苯丙氨酸突变为亮氨酸，该突变极有可能导致该基因编码的蛋白质功能发生改变。

5、KASP标记开发

针对该等位变异，开发者设计开发了2条正向引物和一个通用反向引物：

CR-28669-F1：GAAGGTCGGAGTCAACGGATTAGCTGCTACACACTCGGCCT(HEX)

CR-28669-F2：GAAGGTGACCAAGTTCATGCTAGCTGCTACACACTCGGCCC(FAM)

CR-28669-R：GCTGGGGAAAGTTGTTCAATATG

每条正向引物尾部有特异性序列，可与荧光标记结合。不同颜色荧光即反映了不同的等位变异，使用荧光定量PCR仪对实验结果进行检测即能够分辨不同的等位变异。

6、群体验证

利用该标记对94个CR-28669×Janpol延伸的F₂单株进行了基因型鉴定，同时对这些材料进行了根肿病抗性人工接种鉴定，接种方法同上。结果显示该标记能将94个单株划分成三种类型GenotypeⅠ、GenotypeⅡ、GenotypeⅢ(图1)。GenotypeⅠ为感病等位变异(TT)，GenotypeⅢ为抗病等位变异(CC)，而GenotypeⅡ则为杂合型(TC/CT)，三种类型间对根肿菌的抗性反应(病情指数)差异达到极显著水平(图2)，能从基因型水平有效区分抗感材料。KASP实验反应体系和反应程序如下：

PCR反应体系为5μL，包含1μL DNA模板，2.5μL 2×Master Mix，0.7μL PrimerMix，(Primer Mix比例如下：CR-28669-F1:CR-28669-F2:CR-28669-R:ddH2O＝12:12:30:46＝6:6:15:23)，0.8μLddH2O。

PCR扩增的反应程序：94℃15min；采取降落PCR方式，94℃20s，60℃1min，60℃降落到48℃，每个循环降低1.2℃，循环10次；94℃20s，55℃1min，循环30次；37℃1min，最后1s采集荧光信号，红色荧光表示感病基因型，绿色荧光表示抗病基因型，蓝色表示中间型(具体的荧光信号颜色可根据实验需要选择)。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 中国农业科学院油料作物研究所

<120> 一种甘蓝型油菜根肿病抗性特异分子标记及其应用

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 41

<212> DNA

<213> CR-28669-F1

<400> 1

gaaggtcgga gtcaacggat tagctgctac acactcggcc t 41

<210> 2

<211> 41

<212> DNA

<213> CR-28669- F2

<400> 2

gaaggtgacc aagttcatgc tagctgctac acactcggcc c 41

<210> 3

<211> 23

<212> DNA

<213> CR-28669-R

<400> 3

gctggggaaa gttgttcaat atg 23

Claims (5)

1.一种甘蓝型油菜根肿病抗性检测KASP标记引物，其特征在于，所述KASP标记引物序列为：

CR-28669-F1：GAAGGTCGGAGTCAACGGATTAGCTGCTACACACTCGGCCT-HEX；

CR-28669- F2：GAAGGTGACCAAGTTCATGCTAGCTGCTACACACTCGGCCC-FAM；

CR-28669-R：GCTGGGGAAAGTTGTTCAATATG。

2.一种甘蓝型油菜根肿病抗性检测方法，其特征在于，利用权利要求1中所述的甘蓝型油菜根肿病抗性检测KASP标记引物对样品DNA进行扩增，根据荧光信号判断样品抗性类型。

3.根据权利要求2所述的一种甘蓝型油菜根肿病抗性检测方法，其特征在于：所述扩增的PCR反应体系为5μL，包含1μL DNA模板，2.5μL 2×Master Mix，0.7μL Primer Mix；Primer Mix比例为：CR-28669-F1:CR-28669-F2:CR-28669-R:ddH2O = 6:6:15:23，0.8μLddH₂O。

4.根据权利要求2所述的一种甘蓝型油菜根肿病抗性检测方法，其特征在于：所述扩增的PCR扩增程序为：94℃15min；采取降落PCR方式，94℃20s，60℃1min，60℃降落到48℃，每个循环降低1.2℃，循环10次；94℃20s，55℃1min，循环30次；37℃1min，最后1s采集荧光信号。

5.如权利要求1所述的甘蓝型油菜根肿病抗性检测KASP标记引物，或权利要求2-4任一所述的检测方法在抗根肿病甘蓝型油菜材料选育中的应用。

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