CN102304513B - 一种水稻库源新基因(ss1)的紧密连锁分子标记 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种水稻库源新基因SS1的分子标记方法，属于水稻超高产育种和分子遗传学领域。本发明实质是根据连锁分离规律，利用携带SS1杂合片段的近等基因系自交所构建的F2次级分离群体为试材，构建一套目标区段的跨叠系，结合表现型对目标基因进行高精确度的连锁分析，经过两年两点的重复鉴定，最终将SS1精细定位到第4染色体上55Kb的区间内，并获得了与之紧密连锁的基于PCR的分子标记FL41。将本发明应用于水稻超高产育种，能够快速准确的鉴定出同时影响库(每穗粒数)源(剑叶叶宽和叶面积)性状的基因型个体，进行育种材料的早世代选择，大大加速水稻超高产分子育种的进程。
Description
技术领域
本发明涉及一种控制水稻库源新基因SS1的紧密连锁分子标记，属于水稻超高产育种和分子遗传学领域，适用于在水稻高产育种中引入新的产量相关基因SS1，并利用紧密连锁分子标记对该基因进行水稻库源相关性状的辅助选择育种。
背景技术
水稻产量的高低主要取决于源、库、流三者的强弱及其相互间的协调程度，其中穗部性状特别是每穗总粒数是光合产物积累的主要库性状，倒三叶尤其是剑叶大小是光合产物生产的主要源性状，穗茎中的大维管束数量通常被作为从叶片向穗部输送同化物的一个“流”性状。剑叶是穗部最重要的同化产物来源，其大小与每穗粒数、小穗育性、高容重籽粒、千粒重及籽粒产量密切相关。在不同条件下，源、库、流三者之一都有可能成为作物产量的限制因素，因而单方面强调源或库对产量的重要性都是不全面的。要获得高产，不仅源、库要协调，还要考虑到流(运转)的协调，即源要足、库要大和运转通畅。由此可见，源、库、流三者之间是相互促进、相互影响、相互制约的关系。目前一般采用源/库、源/流和流/库“三比”来评价源、库、流三者间的平衡关系，进而分析“三比”变化对水稻产量及生理的影响，从而找出水稻高产所需的最佳“三比”值。尽管人们已经认识到充足而且彼此协调的库源关系是水稻高产理想株型和超高产育种的重要目标，但至今对库源性状的遗传特别是两者间的分子调控机制还缺少研究。因此，鉴定影响库源性状的重要基因，通过分子标记辅助选择培育库源协调的高产品种进而解析库源性状调控的分子机制，意义重大。
数量性状基因座(QTL)定位的应用极大的促进了对包括产量在内的许多重要复杂性状遗传机理的认识。鉴定影响库、源和流及产量性状的QTL有助于增加对这些复杂性状相互关系的理解，从而达到通过遗传操纵改良这些性状并最终提高产量的目的。Cui等(2003)利用珍汕97与明恢63的重组自交系群体，定位了剑叶、倒二叶和倒三叶(源性状)、每穗总粒数(库性状)、茎中大维管束数量(流性状)及三者衍生的比例性状与籽粒产量及产量相关性状(结实率和千粒重)的QTL，在定位影响库-源-流的25个主效QTL中，其中有8个与影响产量性状的QTL定位在相同或相近的区域，认为一因多效或紧密连锁是籽粒产量与库、源、流之间相关的遗传基础。Li等(1998)在美国德州生态条件下种植Lemont/特青的早世代(F4)重组自交系群体，研究了水稻剑叶和倒二叶与库容量之间的遗传关系，发现作为主要库容量的每穗粒重有50％的变异是由剑叶大小引起，并利用分子标记鉴定出位于第4染色体RG143-RG214区间同时影响库性状(每穗粒数和每穗粒重)和源(剑叶和倒二叶的叶面积和叶宽)性状的1个主效QTL(QLw4)，分别解释剑叶叶宽、倒二叶叶宽和每穗粒数表型变异的20％、19％和16％，是一个影响库源性状的重要主效QTL。该基因座上来自Lemont的等位基因能够在增加叶宽和叶面积的同时增加每穗粒数和穗粒重，一因多效是该基因控制库源性状的遗传基础。Xu等(2004)在菲律宾热带条件下种植Lemont/特青的高世代(F13)重组自交系群体，在第4染色体的RM317-RM255区间检测到影响每穗粒数的主效QTL，其增加每穗粒数的等位基因也同样来自Lemont。经比较作图分析发现，与该QTL紧密连锁的分子标记RM255正好落在RG143-RG214区间。因此，推断该QTL与Li等(1998)定位到影响库源性状的QLw4很可能是同一个位点。在此基础上，申请人又进一步利用Lemont/特青的双向回交导入系群体，分别在北京和海南的种植条件下检测到影响每穗粒数和剑叶宽度的主效QTL(所在区间为RM317-RM255)，该位点上增加叶宽和每穗粒数的等位基因都来自亲本Lemont。由此证明RM317-RM255区间确实存在一个在不同的生态条件下稳定表达的影响库源性状的基因，暂且将该基因命名为SS1(Source-sink 1)。
水稻库源性状是水稻产量形成的农学基础。库源相关性状(如剑叶长、宽及叶面积，每穗粒数及粒重)的QTL定位研究表明，影响水稻库源相关性状的QTL(基因位点)大致分成3种类型，一是同时控制叶片源性状和穗部库性状，二是只控制叶片源性状，三是只控制穗部库性状。在这3种类型中，只有第一种基因，对水稻库源协调起关键作用，是通过库源协调培育超高产品种的重要遗传基础。虽然通过常规的表型鉴定，可以对叶片宽窄和叶片大小等源性状进行选择，但是却无法对不同类型的库源相关基因位点加以区别利用；只有通过分子标记的方法，对于同时控制库性状和源性状的基因位点进行有针对性的选择，才能实现库源协调超高产品种的高效选育。因此，鉴定和精细定位水稻库源性状的重要基因，寻找与其紧密连锁的分子标记，对于通过标记辅助选择技术培育水稻超高产新品种具有重要的现实意义。
发明内容
(一)技术问题
本发明针对上述研究背景，从特青背景的高代回交导入系中选择出带有影响源(剑叶叶宽)、库(每穗粒数)性状SS1基因的回交导入系GG253，其轮回亲本背景恢复率为98.9％，进一步以特青作为轮回亲本与GG253进行2次回交，通过分子标记辅助选择的方法筛选到目标区段为SS1基因杂合导入、背景完全恢复为轮回亲本特青的近等基因系，利用该近等基因系所构建的F2次级分离群体为试材，筛选目标染色体区段的交换单株，从而构建了一套亚区间的跨叠系，并结合表现型对目标基因进行高精确度的连锁分析，将SS1基因精细定位到一个55kb的区间内；获得与之紧密连锁的基于PCR的分子标记FL41，借助该标记可以有效筛选到带有SS1基因的宽剑叶且每穗粒数多的库源充足且协调的水稻新品种(系)，主要应用于培育水稻超产新品种。
(二)技术方案
控制水稻库源新基因紧密连锁的分子标记方法，其特征在于：
用一对特异扩增水稻位于第4染色体上控制水稻库源新基因(SS1)的紧密连锁分子标记的引物FL41，其中正向引物序列为：AAACCCTGGCATTACATT；反向引物序列为：CATAGACATAAGAACCCT，共同扩增目标区段为杂合导入的近等基因系(携带有一个包含SS1的55kb杂合片段)自交所衍生的F2分离群体中各单株的基因组DNA，然后用Ddel限制性内切酶37℃酶切2小时，电泳分离出2种分子量大小的片段，其中与Lemont亲本相同片段的分子量大小为171bp，与特青相同片段的分子量大小为115bp(图1)。如果FL41的引物扩增后酶切获得与亲本Lemont大小相同或者杂合片段的单株，那么这些单株带有SS1高产等位基因，表现型表现为剑叶增宽且穗粒数增多，反之，则不带有SS1高产等位基因，表现剑叶较窄且穗粒数较少。
具体实施方式
下面结合具体实施实例，进一步阐述本发明。其中所用方法如无特别说明均为常规方法。
(一)控制水稻库源新基因的初步定位
1.供试材料
以美国南部的优质粳稻品种Lemont和我国广东的高产籼稻品种特青所构建的双向回交导入系为主要研究材料。其构建过程如下：将Lemont与特青配制杂种F1，F1植株分别与双亲回交，分别形成Lemont和特青背景的双向回交BC1F1群体，在双向回交后代随机选单株分别与各自的轮回亲本进行2-4次不等的连续回交并经自交多代稳定，最后分别获得了201个Lemont背景导入系(LT-ILs)和252个特青背景的导入系(TQ-ILs)。另一套材料是来自同一个杂交组合(Lemont/特青)的294个高世代重组自交系(RILs)。
2.DNA提取、PCR扩增及凝胶电泳
参考Temnykh等(2000年)的DNA提取方法，对各株系的代表单株分别混合提取基因组DNA。根据参考图谱，选取均匀分布于全基因组的142个SSR标记，合成引物。以各个株系的基因组DNA为模板进行，聚合酶链式(PCR)反应。PCR反应的产物通过8％非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分离，genefinder染色后，在凝胶成像系统下成像。参考双亲的扩增条带，对后代株系的带型进行判别记录。
3.完备区间作图分析
根据后代株系的扩增条带所表示的基因型，将其对应的库(每穗粒数)和源(剑叶宽度)相关性状调查的结果作为表型值，输入由中国农业科学院作物科学研究所王建康课题组所发展的完备区间作图软件(ICIMapping V3.0，免费软件)，进行数据分析，获得与水稻库源相关的候选区间及相关标记。
我们鉴定出1个在不同遗传背景下(特青背景导入系、Lemont背景导入系和重组自交系)不同环境下(北京和海南)均能稳定表达的同时影响库源性状的主效QTL(表1)，即位于第4染色RM255标记附近同时影响每穗粒数(库性状)和剑叶叶宽(源性状)的主效QTL(SS1)，该基因座上来自Lemont的等位基因增加剑叶叶宽的同时增加每穗粒数，一因多效是控制该库源性状的遗传基础。
表1利用292个Lemont/特青重组自交系(RILs)、254个特青背景导入系(TQ-ILs)和201个Lemont背景导入系(LT-ILs)定位影响剑叶叶宽(FLW，厘米)和每穗粒数(SNP，粒/穗)的主效QTL
1)下划线标记表示更靠近QTL的一侧标记
2)特青的背景导入系的加性效应为特青等位基因被Lemont等位基因代替的效应，Lemont背景正好相反；重组自交系的加性效应系指特青等位基因被Lemont等位基因代替的效应。
(二)控制水稻库源新基因的精细定位
1.供试材料
从特青背景的高代回交导入系中选择出带有影响源(剑叶叶宽)、库(每穗粒数)性状SS1基因的回交导入系GG253，其轮回亲本背景恢复率为98.9％，进一步以特青作为轮回亲本与GG253进行2次回交，通过分子标记辅助选择的方法筛选到目标区段为SS1基因杂合导入，背景完全恢复为轮回亲本特青的近等基因系，利用该近等基因系自交构建的F2次级分离群体作为SS1基因精细定位的供试材料。
2.精细定位方法
2.1引物开发
通过Gramene网站上公布的SSR引物以及根据生物信息学比对已经测序的粳稻品种日本晴和籼稻品种9311在这一区间的序列差异，进一步设计的InDel和CAPS引物扩增SS1纯合近等基因系NIL和特青，筛选获得多态性分子标记。
2.2精细定位方法及紧密连锁分子标记的获得
利用从近等基因系构建的6000株次级分离群体为试材，筛选该目标染色体区段的交换单株，从而构建一套亚区间的跨叠系，结合表现型对目标基因进行高精确度的连锁分析。经过两年两点的重复鉴定，最终将SS1精细定位到一个55Kb的区间，并获得了与SS1紧密连锁的分子标记FL41和只带有来自Lemont品种单个导入片段(片段大小为55Kb)的纯合近等基因系(NIL)，该近等基因系除剑叶宽、剑叶面积、二次枝梗数和每穗粒数显著高于轮回亲本特青外，其余性状与特青无显著差异(表2)。
表2亲本和近等基因系的重要农艺性状比较
RPP-单株有效穗数，PH-株高，PBN-一次枝梗数，SBN-二次枝梗数，TGW-千粒重，FLL-剑叶叶长，FLW-剑叶叶宽，FLA-剑叶叶面积，SNP-每穗粒数
*、**和***分别表示近等基因系NIL与特青相比在P≤0.05、0.01和0.001水平的差异显著性
(三)利用SS1杂合NIL所衍生的F2分离群体进行FL41标记的验证
1.供试材料
利用携带有SS1基因的55Kb杂合区段且背景完全恢复为轮回亲本(特青)的近等基因系自交所获得的F2分离群体(240株)为供试材料。
2.DNA提取、PCR扩增及凝胶电泳
参照(一)中株系基因组DNA的提取方法和PCR扩增方法，提取240株的基因组DNA并利用SS1基因的紧密连锁标记FL41进行PCR扩增，PCR产物用Ddel限制性内切酶37℃酶切2小时。反应产物在8％非变性聚丙烯酰胺上电泳，用genefinder染料染色。
3.结果分析
FL41的引物扩增后酶切获得与Lemont大小相同的片段的单株数为58株，表现型均表现为宽剑叶(平均数为1.97cm，变幅为1.9-2.1cm)并且穗粒数增多(平均数为257.4粒，变幅为220-278.5粒)；与特青扩增片段大小相同的单株数为64株，表现型均表现为窄剑叶(平均数为1.68cm，变幅为1.6-1.75cm)并且穗粒数较少(平均数为209.1粒，变幅为202-219.5粒)；扩增出杂合基因型单株数为118株，剑叶叶宽度平均为1.89cm，变幅为1.83-1.98cm，每穗粒数平均为249.8粒，变幅为213.5-276.5粒。表明依据FL41引物扩增出与Lemont大小相同或杂合片段，推测该单株带有SS1高产等位基因，表现为宽剑叶并且穗粒数增多，反之，则剑叶较窄，穗粒数较少(图1)。表明通过FL41标记基因型鉴定可以很好的鉴别SS1基因型，预测SS1基因的表现型。
上述实施不以任何形式限定本发明。
附图说明：
图1利用FL41引物鉴定杂合近等基因系后代SS1基因的分离及各个体的剑叶叶宽(FLW)和穗粒数(SNP)表现。电泳图上方编号1-20的数字代表群体中随机抽取的20个单株，特青为轮回亲本，Lemont为供体亲本，M代表标准分子量标记。利用与SS1基因紧密连锁标记FL41进行PCR扩增，PCR产物用Ddel限制性内切酶37℃酶切2小时，反应产物在8％非变性聚丙烯酰胺上电泳，经genefinder染料染色，群体中各个体分离出两条带型，3种基因型，其中一条分子量为171bp的带型，来自亲本Lemont，另一条分子量为115bp的带型来自特青。各单株基因型及对应的剑叶叶宽和每穗粒数表现如下。
Claims (2)
1.水稻库源新基因SS1紧密连锁分子标记FL41引物对的获得方法，其特征在于：以特青作为轮回亲本与特青背景回交导入系GG253进行2次回交，通过分子标记辅助选择的方法筛选到目标区段为SS1基因杂合导入、背景完全恢复为轮回亲本特青的近等基因系，利用该近等基因系所构建的F2次级分离群体为试材，筛选目标染色体区段的交换单株，从而构建了一套亚区间的跨叠系，结合表现型对目标基因进行高精确度的连锁分析，将SS1基因精细定位到一个55Kb的区间内，获得与库源新基因SS1紧密连锁的基于PCR的分子标记引物对FL41，其中正向引物序列为：AAACCCTGGCATTACATT；反向引物序列为：CATAGACATAAGAACCCT。
2.按照权利要求1所获得一种与水稻库源新基因SS1紧密连锁分子标记FL41引物对的应用，其特征在于：用一对特异扩增水稻位于第4染色体上控制水稻库源新基因SS1的紧密连锁分子标记的引物对FL41，其中正向引物序列为：AAACCCTGGCATTACATT；反向引物序列为：CATAGACATAAGAACCCT，共同扩增携带有一个包含SS1的55kb杂合片段的近等基因系自交所衍生的F2分离群体中各单株的基因组DNA，然后用Ddel限制性内切酶37℃酶切2小时，电泳分离出2种分子量大小的片段，其中与Lemont亲本相同片段的分子量大小为171bp，与特青相同片段的分子量大小为115bp；如果某个单株的基因组DNA在FL41引物对扩增并酶切后通过电泳获得与Lemont品种大小相同的片段，那么这些单株带有SS1高产等位基因，表现型表现为剑叶增宽且穗粒数增多；反之，则不带有SS1高产等位基因，表现剑叶较窄且穗粒数较少。
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