CN102433334B - 一种水稻库源新基因(ss2)的紧密连锁分子标记 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种水稻库源新基因SS2的分子标记方法，属于水稻超高产育种和分子遗传学领域。本发明实质是根据连锁分离规律，利用携带SS2杂合片段的近等基因系自交所构建的F2次级分离群体为试材，构建一套目标区段的跨叠系，结合表现型对目标基因进行高精确度的连锁分析，经过两年两点的重复鉴定，最终将SS2精细定位到第3染色体上104Kb的区间内，并获得了与之紧密连锁的基于PCR的分子标记SL14。将本发明应用于水稻超高产育种，能够快速准确的鉴定出同时影响库(每穗粒数)源(剑叶叶长)性状的基因型个体，进行育种材料的早世代选择，大大加速水稻超高产分子育种的进程。

Description

一种水稻库源新基因(SS2)的紧密连锁分子标记

技术领域

本发明涉及一种控制水稻库(每穗粒数)源(剑叶大小)新基因SS2的紧密连锁分子标记，属于水稻超高产育种和分子遗传学领域，适用于在水稻高产育种中引入新的产量相关基因SS2，并利用紧密连锁分子标记对该基因进行水稻库源相关性状的辅助选择育种。

背景技术

从我国水稻育种历史分析，源、库、流三者的平衡对水稻产量潜力的提高发挥了重要作用。无论20世纪50年代的矮化育种，70年代的杂交水稻育种，还是近年的超级稻育种，每一次水稻产量的大幅度提高无不伴随着源、库、流状况的改善及新型源库平衡关系的建立。现已明确，水稻产量的高低主要取决于源、库、流三者的强弱及其相互间的协调程度，其中穗部性状特别是每穗总粒数是光合产物积累的主要库性状，倒三叶尤其是剑叶是光合产物生产的主要源性状，穗茎中的大维管束数量通常被作为从叶片向穗部输送同化物的一个“流”性状。剑叶是穗部最重要的同化产物来源，其大小与每穗粒数、小穗育性、高容重籽粒、千粒重及籽粒产量密切相关。在不同条件下，源、库、流三者之一都有可能成为作物产量的限制因素，因而单方面强调源或库对产量的重要性都是不全面的。要获得高产，不仅源、库要协调，还要考虑到流(运转)的协调，即源要足、库要大和运转通畅。由此可见，源、库、流三者之间是相互促进、相互影响、相互制约的关系。目前一般采用源/库、源/流和流/库“三比”来评价源、库、流三者间的平衡关系，进而分析“三比”变化对水稻产量及生理的影响，从而找出水稻高产所需的最佳“三比”值。尽管人们已经认识到充足而且彼此协调的源库关系是水稻高产理想株型和超高产育种的重要目标，但至今对库源性状的遗传特别是两者间的分子调控机制还缺少研究。因此，鉴定影响库源性状的重要基因，通过分子标记辅助选择培育库源协调的高产品种进而解析库源性状调控的分子机制将具有重要意义。

数量性状基因座(QTL)定位的应用极大地促进了对包括产量在内的许多重要复杂性状遗传机理的认识。鉴定影响库、源和流及产量性状的QTL有助于增加对这些复杂性状相互关系的理解，从而达到通过遗传操纵改良这些性状并最终提高产量的目的。一些学者利用不同的作图群体检测到影响源相关性状(剑叶、倒二叶和倒三叶)的QTL与库相关性状，诸如每穗总粒数，千粒重及单株产量的QTL定位在相同或相近的区域，认为一因多效或紧密连锁是籽粒产量与库、源之间相关的遗传基础(Erik等.2002；Cui等.2003；Ishimaru 2003；Thomson等.2003；Yoon等.2006)。Li等(1997；1998)在美国德州生态条件下种植利用粳稻Lemont与籼稻特青培育的早世代重组自交系群体，研究了水稻剑叶和倒二叶与库容量之间的遗传关系，发现作为主要库容量的每穗粒重有50％的变异是由剑叶大小引起，并利用分子标记鉴定出位于第3染色体RG910a-RG418区间同时影响库(每穗粒数和每穗粒重)、源(剑叶和倒二叶的叶面积和叶长度)性状的1个主效QTL(QLl3b)，该基因座特青等位基因增加叶长和叶面积同时增加每穗粒数和每穗粒重，被认为是一个影响源库性状的重要主效QTL，并认为一因多效是控制源库性状的遗传基础。Mei等(2005)利用Lemont/特青BC₁F₁群体，在第3染色体的G249-RG418b区间检测到影响剑叶长度的主效QTL，贡献率为8.1％，其增加剑叶长度的等位基因也同样来自特青。申请人进一步在北京和海南两个不同的生态区下利用Lemont与特青培育的双向导入系群体及在北京环境下利用Lemont/特青F₁₃重组自交系群体，在第3染色体的RM227-RM85区间均检测到影响每穗粒数和剑叶长度的主效QTL，该QTL增加叶长和每穗粒数的等位基因均来自亲本特青(未发表)。经比较作图，与该QTL紧密连锁的RM227和RM85正好落在RG910a-RG418区间。因此，可以推断该QTL与Li等(1998)定位到影响源库性状的QLl3b位于同一染色体区间。由此表明，RM227-RM85区间确实存在一个在不同的生态条件下稳定表达的影响源库性状的基因，暂且将该基因命名为SS2(Source-sink 2)。

水稻库源性状是水稻产量形成的农学基础。库源相关性状(如剑叶长、宽及叶面积，每穗粒数及粒重)的QTL定位研究表明，影响水稻库源相关性状的QTL大致分成3种类型，一是同时控制叶片源性状和穗部库性状，二是只控制叶片源性状，三是只控制穗部库性状。在这3种类型中，只有第一种基因，对水稻库源协调起关键作用，是通过库源协调培育超高产品种的重要遗传基础。虽然叶片长短和叶片大小等源性状易于常规选择，但常规选择无法分辨影响源性状的不同基因位点，而只有通过标记辅助，有针对性地选择影响库源性状的基因(即上述的第一类基因)，才能快速有效地选育库源协调的超高产品种。因此，鉴定和精细定位水稻库源性状的重要基因，寻找与其紧密连锁的分子标记，通过标记辅助选择技术培育水稻超高产新品种具有重要的现实意义。

发明内容

(一)技术问题

本发明针对上述研究背景，从Lemont背景的高代回交导入系中选择出带有影响源(剑叶叶长)、库(每穗粒数)性状SS2的近等基因导入系GG306，其轮回亲本背景恢复率为91.1％，进一步以Lemont作为轮回亲本与GG306进行3次回交，通过分子标记辅助选择的方法筛选到目标区段为SS2基因杂合导入、背景完全恢复为轮回亲本Lemont的近等基因系，利用该近等基因系所构建的F₂次级分离群体为试材，筛选目标染色体区段的交换单株，从而构建了一套亚区间的跨叠系，并结合表现型对目标基因进行高精确度的连锁分析，将SS2基因精细定位到一个104kb的区间内；获得与之紧密连锁的基于PCR的分子标记SL14，借助该标记可以有效筛选到带有SS2基因的长剑叶且每穗粒数多的个体，主要应用于库源充足且协调的水稻超产新品种的培育。

(二)技术方案

控制水稻库源新基因紧密连锁的分子标记方法，其特征在于：

用两对特异扩增水稻位于第3染色体上控制水稻库源新基因(SS2)的紧密连锁分子标记的引物SL14，其中正向引物序列为：CTCATAATCGTTGCTACTCATC，反向引物序列为：CATGCAGACACGGAAATAC。共同扩增目标区段为杂合导入的近等基因系(携带有一个包含SS2的104kb杂合片段)自交所衍生的F₂分离群体中各单株的基因组DNA，电泳分离出2种分子量大小的片段，其中与Lemont亲本相同片段的分子量大小为183bp，与特青相同片段的分子量大小为166bp(图1)。如果SL14的引物扩增后获得与亲本特青大小相同片段或者带有双亲杂合片段的单株，那么这些单株带有SS2高产等位基因，在性状上表现为剑叶增长且穗粒数增多，反之，则不带有SS2高产等位基因，表现剑叶较短且穗粒数较少。

具体实施方式

下面结合具体实施实例，进一步阐述本发明。其中所用方法如无特别说明均为常规方法。

(一)控制水稻库源新基因的初步定位

1.供试材料

以美国南部的优质粳稻品种Lemont和我国广东的高产籼稻品种特青所构建的双向回交导入系为主要研究材料。其构建过程如下：将Lemont与特青配制杂种F₁，F₁植株分别与双亲回交，分别形成Lemont和特青背景的双向回交BC₁F₁群体，在双向回交后代随机选单株分别与各自的轮回亲本进行2-4次不等的连续回交并经自交多代稳定，最后分别获得了201个Lemont背景导入系(LT-ILs)和252个特青背景的导入系(TQ-ILs)。另一套材料是来自同一个杂交组合(Lemont/特青)的294个高世代重组自交系(RILs)。

2.DNA提取、PCR扩增及凝胶电泳

参考Temnykh等(2000年)的DNA提取方法，对各株系的代表单株分别混合提取基因组DNA。根据参考图谱，选取均匀分布于全基因组的142个双亲间有多态的SSR标记，合成引物。以各个株系的基因组DNA为模板进行聚合酶链式(PCR)反应。PCR反应的产物通过8％非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分离，genefinder染色后，在凝胶成像系统下成像。参考双亲的扩增条带，对后代株系的带型进行判别记录。

3.完备区间作图分析

根据后代株系的扩增条带所表示的基因型，将其对应的库(每穗粒数)和源(剑叶长度)相关性状调查的结果作为表型值，输入由中国农业科学院作物科学研究所王建康课题组所发展的完备区间作图软件(ICIMapping V3.0，免费软件)，进行数据分析，获得与水稻库源相关的候选区间及相关标记。

我们鉴定出1个在不同遗传背景(特青背景导入系、Lemont背景导入系和重组自交系)和不同环境(北京和海南)下均能稳定表达的同时影响库源性状的主效QTL，即位于第3染色RM85标记附近同时影响每穗粒数(库性状)和剑叶叶长(源性状)的主效QTL(SS2)，该基因座上来自特青的等位基因增加剑叶叶长的同时增加每穗粒数，一因多效是控制该库源性状的遗传基础。

表1 利用294个Lemont/特青重组自交系(RILs)、252个特青背景导入系(TQ-ILs)和201个Lemont背景导入系(LT-ILs)定位影响剑叶叶长(FLL，厘米)和每穗粒数(SNP，粒/穗)的主效QTL

¹⁾下划线标记表示更靠近QTL的一侧标记

²⁾特青的背景导入系的加性效应为特青等位基因被Lemont等位基因代替的效应，Lemont背景正好相反；重组自交系的加性效应系指特青等位基因被Lemont等位基因代替的效应。

(二)控制水稻库源新基因的精细定位

1.供试材料

从Lemont背景的高代回交导入系中选择出带有影响源(剑叶叶长)、库(每穗粒数)性状SS2的近等基因导入系GG306，其轮回亲本背景恢复率为91.1％，进一步以Lemont作为轮回亲本与GG306进行3次回交，通过分子标记辅助选择的方法筛选到目标区段为SS2基因杂合导入，背景完全恢复为轮回亲本特青的近等基因系，自交所构建的F₂次级分离群体为供试材料。

2.精细定位方法

2.1引物开发

通过Gramene网站上公布的SSR引物以及根据生物信息学比对已经测序的粳稻品种日本晴和籼稻品种9311在这一区间的序列差异，进一步设计的InDel和CAPS引物扩增SS2纯合近等基因系NIL和Lemont，筛选获得多态性分子标记。

2.2精细定位方法及紧密连锁分子标记的获得

利用从近等基因系构建的次级分离群体为试材，筛选该目标染色体区段的交换单株，从而构建一套亚区间的跨叠系，结合表现型对目标基因进行高精确度的连锁分析。经过两年两点的重复鉴定，最终将SS2基因精细定位到一个104Kb的区间，并获得了与SS2紧密连锁的分子标记SL14以及只带有来自特青品种单个导入片段(片段大小为104Kb)的近等基因系(NIL)。

表2 亲本和近等基因系的重要农艺性状比较

GWP-单株实粒重，RPP-单株有效穗数，PH-株高，PBN-一次枝梗数，SBN-二次枝梗数，TGW-千粒重，FLL-剑叶叶长，FLW-剑叶叶宽，FLA-剑叶叶面积，SNP-每穗粒数

^*、^**和^***分别表示近等基因系NIL与Lemont相比在P≤0.05、0.01和0.001水平的差异显著性

(三)利用SS2杂合NIL所衍生的F₂分离群体进行SL14标记的验证

1.供试材料

利用携带有SS2基因的104Kb杂合区段且背景完全恢复为轮回亲本(Lemont)的近等基因系自交所获得的F₂分离群体(250株)为供试材料。

2.DNA提取、PCR扩增及凝胶电泳

参照(一)中株系基因组DNA的提取方法和PCR扩增方法，提取250株的基因组DNA并利用SS2基因的紧密连锁标记SL14进行PCR扩增。反应产物在8％非变性聚丙烯酰胺上电泳，用genefinder染料染色。

3.结果分析

SL14的引物扩增后获得与特青大小相同的片段的单株数为63株，表现型均表现为长剑叶(平均数为35.5cm，变幅为30.3.3-45.0cm)并且穗粒数增多(平均数为227.9粒，变幅为200-268粒)；与Lemont扩增片段大小相同的单株数为60株，表现型均表现为短剑叶(平均数为22.5cm，变幅为18.0-26.5cm)并且穗粒数较少(平均数为155.7粒，变幅为102-191粒)；扩增出杂合基因型单株数为127株，剑叶叶长度平均为32.2cm，变幅为28.3-39.3cm，每穗粒数平均为206.5粒，变幅为198-254粒。表明依据SL14引物扩增出与特青大小相同或杂合片段，推测该单株带有SS2高产等位基因，表现为长剑叶并且穗粒数增多，反之，则剑叶较短，穗粒数较少(图1)。表明通过SL14标记基因型鉴定可以很好地鉴别SS2基因型，预测SS2基因的表现型。

上述实施不以任何形式限定本发明。

附图说明：

图1利用SL14引物鉴定杂合近等基因系后代SS2基因的分离及各个体的剑叶叶长(FLL)和穗粒数(SNP)表现。电泳图上方编号1-20的数字代表群体中随机抽取的20个单株，Lemont为轮回亲本，特青为供体亲本，M代表标准分子量标记。利用与SS2基因紧密连锁标记SL14进行PCR扩增，反应产物在8％非变性聚丙烯酰胺上电泳，经genefinder染料染色，群体中各个体分离出两条带型，3种基因型，其中一条分子量为183bp的带型，来自亲本Lemont，另一条分子量为166bp的带型来自特青。各单株基因型及对应的剑叶叶长和每穗粒数表现如下。

Claims (1)

1.一种分子标记引物对，其正向引物序列为：CTCATAATCGTTGCTACTCATC，反向引物序列为：CATGCAGACACGGAAATAC。

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