CN103848906B - 水稻抗高温相关基因OsZFP、筛选标记及其分离方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种经分离的水稻内源抗高温基因（简称OsZFP基因）及其所编码的多肽；包含本发明的抗高温基因或其所编码的多肽的优选水稻细胞以及所述植物细胞的制备方法。并进一步提供选育作物抗高温新品种的新方法和新技术包括抗高温相关的调控序列和标定所述抗高温基因的紧密连锁分子标记及其序列。

Description

水稻抗高温相关基因OsZFP、筛选标记及其分离方法

技术领域

本发明涉及植物基因工程和分子育种技术领域。具体地说，更具体而言，涉及植物抗高温基因的定位、分离、功能分析、序列特征化、调控序列鉴定和共分离分子标记筛选与创造及其在改良水稻等作物的抗逆性方面的应用水稻中的一种抗高温基因的遗传转化和分子标记辅助选择方法与程序。此外本发明还涉及借助所述利用抗高温基因来改良水稻等作物的抗逆性方面的应用。

背景技术

水稻是最重要的粮食农作物，而且是世界上一半以上人口的主要食物来源（Khush, 2005），报道显示，水稻产量以每年0.6-0.9%增长速率才能在2050 年满足人们生活的需求（Carriger and Vallee, 2007）。作物产量的增加依赖农田，农业生产的可持续发展需要避免环境的恶化、生态平衡的破坏以及生物多样性的丧失（Cassman, 1999; Tilmanet al., 2002）。作物产量主要是由光合作用和呼吸作用决定的，然而，光合作用和呼吸作用均对温度敏感（Yoshida, 1981），此外还受空气中CO2 浓度（Baker et al., 1990）、臭氧层（Maggs and Ashmore, 1998）的影响，这些因素也和温室效应有关（Rosenzweig andParry, 1994）。

气候的持续变暖已经给水稻生产带来灾难性的影响。2006 和2007 年, 中国长江中下游的重庆、湖北、湖南、安徽、浙江和广东等省区连续两年出现大范围持续38℃以上的高温天气，导致水稻等粮食作物大面积减产，严重的使其结实率不到50%。因此，育种上迫切需要可资利用的抗高温遗传资源用以应对全球升温给水稻生产带来的严重威胁。因此，广泛开展耐热研究、深入挖掘抗高温遗传资源，努力从植物耐热新品种选育角度应对全球升温给水稻生产带来的严重威胁无疑在理论上和实践上都有重要意义。

近年来，国内外就水稻孕穗期（赵志刚等，2006）、抽穗期（张永生等，2009; Zhanget al., 2009）、开花期（曹立勇等，2003，2002；盘毅等，2005；陈庆全等，2008；张涛等，2008；奎丽梅等，2008； Zhang et al., 2009；Jagadish et al., 2010;）、灌浆期（朱昌兰等，2005）以及稻米直链淀粉含量合成和胶稠度形成（朱昌兰等，2006）等时期的抗高温特性进行了大量的遗传分析和染色体定位，定位到的耐热水稻数量形状（简称QTL）涉及水稻的每一条染色体，其中，遗传效应最显著的一个QTL 位点是来自巴基斯坦的品系Bala，其对表型变异的解释率达18%。然而，由于不同的研究者使用的试验材料和高温处理程序与方法的不同，所获得的实验数据彼此难以相互印证和重演，所定位的QTL区间相对较大，以致无法确定候选基因和进行相关的分子克隆及功能互补验证。因此，对上述定位的耐热QTL而言，不仅在理论上缺乏必要的数据支持，而且在生产实践上也难以有效利用。

此外，一些研究者还通过同源克隆法对水稻耐热相关基因进行了研究。Yamanouchi 等（2002）利用图位克隆法定位并克隆了一个关于水稻斑点基因Sp17，发现它的一个阅读框和热胁迫转录因子高度相似，在热胁迫条件下，突变体和野生型Sp17的表达量都上调。Yokotani 等（2008）把水稻编码OsHsfA2e的耐热基因转移到拟南芥中去，转基因拟南芥对环境胁迫的耐性增强。对非胁迫条件下过量表达的拟南芥植株进行芯片分析，发现与胁迫相关的一些基因表达量升高，这其中包括几类热激蛋白。

一般认为，热激蛋白（heat shock protein, HSP）与高温响应相关。已有的报道结果显示rHsp90 对盐、干旱及高温等几种胁迫均有响应，且42℃和50℃的高温处理30 分钟能使rHsp90 表达量显著增加（Liu 等，2006）。另有报道结果显示水稻中有40 个包含α-晶体的基因，其中，23 种为热激蛋白（Sarkar 等，2009）。对其进行芯片和RT-PCR 分析表明，23 个热激蛋白中的19 个在高温下表达量上调。另外， Chang 等人（2007）把水稻热激蛋白Hsp101 转到烟草中，发现过量表达的植株在高温下存活情况比野生型对照要好。Wu 等（2009）用HSP10 启动子驱动OsWRKY11 表达，发现水稻转基因植株热处理后叶片萎焉较慢，存活率高。Yokotani 等人（2011）通过在拟南芥中过量表达水稻OsCEST（叶绿体蛋白-能增强胁迫耐性）基因，发现转基因植株不仅耐盐胁迫，而且抗旱和抗高温。

锌指蛋白（Zinc finger protein）是一个庞大的转录因子家族，在基因表达调控、细胞分化、胚胎发育等生命过程中（Gerisman ﹠Pabo，1997；Laity et al.，2001），特别是在抗逆基因表达调控中起重要作用（Li ﹠ Chen，2000）。根据锌指蛋白中半胱氨酸（C）和组氨酸（H）残基的数目和位置，可将含锌指蛋白结构域的转录因子分为C2H2，C2C2，C3H，C3HC4（即RING finger），C3HC5（即LM finger）等亚类。其中，C2H2 型锌指蛋白是锌指蛋白中研究最为清楚的一类，由两个半胱氨酸和两个组氨酸与Zn2+形成配位键，进而形成一个包含β折叠和一个α螺旋的紧密指状结构。Kim 等（2001）从大豆cDNA 文库中分离到冷诱导锌指蛋白基因SCOF-1，其编码产物含有两个典型的C2H2 锌指结构，SCOF-1 的表达受低温和ABA 的特异性诱导，而不受盐胁迫诱导，转基因研究证实SCOF-1 的过量表达可以增强拟南芥和烟草的耐冷性。刘萌萌等（2007）克隆的一个大豆C2H2 型锌指蛋白转录因子基因GmC2H2 的表达与低温、ABA 的胁迫诱导相关。至于C3HC4 型兼CHY 型锌指蛋白只在拟南芥、水稻、球蒴藓、沙蒿、玉米、菠萝、大豆等几种植物中有成功分离的报道（Stone et al.，2005；Ohyanagiet al.，2006；Rensing et al.，2008；Yang et al.,2008；Alexandrov et al.，2009；杨祥燕等，2009；吴学闯等，2010）。沙蒿AdZFP1 基因是编码这类锌指蛋白的典型例子（Yang 等2008），半定量PCR 分析表明，AdZFP1 基因受外源ABA 的强烈诱导，同时在一定程度上受高盐、低温和高温的诱导。吴学闯等（2010）从大豆旱处cDNA 文库中也筛选到一个编码C3HC4型锌指蛋白基因GmRZFP1，研究结果显示，该基因主要受高温和干旱的诱导，当高温胁迫1-6小时，GmRZFP1 基因表达量与处理时间成正相关，胁迫12 小时有则所下降，到24 小时时，其表达量最高。这些研究结果因此表明GmRZFP1 基因受多种胁迫处理的诱导，可能涉及到多种逆境胁迫信号传导。

此外，Huang 等（2008）在粳稻上找到12 个A20/AN1 类型的锌指蛋白，芯片分析发现低温、干旱和H2O2分别诱导其中的四个基因（ZFP177，ZEP181，ZFP176，ZFP173）、两个基因（ZEP181 和ZFP176）和一个基因（ZFP157）表达。进一步的研究表明ZFP177 对低温和高温胁迫均有响应。对ZFP177基因进行过量表达，所获得的转基因烟草能耐2℃的低温和55℃的高温，但对盐胁迫和干旱胁迫反而更敏感，这说明ZFP177 在植物各种非生物胁迫中起着重要的作用，但是不同的胁迫作用可能有不同的响应机理。

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发明概述

为解决上述问题，本申请的发明人通过锐意研究，开发出一种优化的定位植物抗逆性基因，尤其是抗高温基因的方法，提供了多种新的基因筛选、定位标记，并精确定位了一种水稻抗高温新基因，由此提供了将温度敏感型植物恢复为非温度敏感型植物、将普通植物转化为抗高温植物的育种方法。具体而言，本发明涉及下述方面：

1）. 一种多肽，其为选自下述任一：

A）包含如SEQ ID NO.3 所示的氨基酸序列的多肽；

B）包含在如SEQ ID NO.3 所示的氨基酸序列中或经缺失、替换、插入一个或多个氨基酸所得的氨基酸序列，所述多肽具有抗高温功能;

C）具有SEQ ID NO.3 所示的氨基酸序列的多肽；

D)氨基酸序列如SEQ ID NO:3 所示的多肽。

2）. 一种基因该基因的多核苷酸序列为选自以下任一的多核苷酸序列：

A）包含如SEQ ID NO.1 所示的核苷酸序列的多核苷酸;

B）包含对应于如SEQ ID NO.1 所示的核苷酸序列中的第-1395到-1406位核苷酸为GGGGGGGGGGGG保持不变，在除此之外的核苷酸序列中经缺失、替换、插入一个或多个核苷酸所得的多核苷酸序列，其所编码的多肽具有抗高温功能；

C）具有SEQ ID NO.1 所示的核苷酸序列的多核苷酸；

D)核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示的多核苷酸；

E）编码如权利要求1所述任一种的多肽的多核苷酸序列。

3）. 包含项所述2的基因的载体。

4）. 一种宿主细胞，其特征在于所述的细胞包含项1所述的多肽，或者项2所述的基因，或者项3 所述的载体，所述宿主细胞优选真核生物细胞，更优选植物细胞和酵母细胞，所述植物细胞优选禾本科植物细胞，特别优选水稻（Oryza sativa L.）细胞。

5）. 用于筛选、定位、分离新核苷酸序列的分子标记，所述标记选自：

A）插入/缺失标记InDel5，该标记位于水稻第九染色体距短臂端9130-9150kb之间，所述标记的扩增产物具有长度多态性；

B）SNP标记，简称RBsp1407，在感高温水稻和抗高温水稻植株中，基于SEQ ID NO:1所述多核苷酸序列，所述标记对应序列分别为TGT-3060ACA 和TGG-3060ACA;

C）微卫星DNA标记RM7364，该标记位于水稻第九染色体距短臂端9440-9450kb之间，所述标记经引物的扩增产物具有长度多态性。

6）.项5所述的标记在筛选、定位、分离抗/感高温基因中的应用，其中所述的高温优选42℃或以上，45℃或以上，48℃或以上，或50℃或以上。

7）. 植物育种方法，所述方法包含应用项2所述的基因，或应用项1所述的多肽，或项3所述的载体，或项4所述的宿主细胞，或项5或6所述的标记。

8）.使温度敏感型水稻恢复为非温度敏感型水稻的方法，该方法包括通过遗传操作使温度敏感型水稻基因组第9号染色体中相应于SEQ ID NO：1第-3060位的核苷酸突变为G。

9）.诱导水稻抗高温表型的方法，该方法包括通过遗传操作使不具备抗高温表型的水稻基因组第9号染色体中相应于SEQ ID NO：1第-1394位的5′端插入G，其中，所述的高温优选42℃或以上，45℃或以上，48℃或以上，或50℃或以上。

10）.使温度敏感型水稻为抗高温型水稻的方法，该方法包括通过遗传操作使温度敏感型水稻基因组第9号染色体中相应于SEQ ID NO：1第-3060位的核苷酸突变为G，并且使其温度敏感型水稻基因组第9号染色体中第-1394位的5′端上游插入一个G，使所得核苷酸序列与SEQ ID NO.1 所示的核苷酸序列中的第-1395到-1406位核苷酸相同，即自-1395位起远离起始密码子方向序列包含连续的12个G，其中，所述的高温优选42℃或以上，45℃或以上，48℃或以上，或50℃或以上。

11）本发明涉及用于鉴定植物抗高温特性的方法，所述方法可概括如下：即以两叶一心期至三叶一心期的土培秧苗，经45-48℃高温处理79h, 恢复5d后观察温度反应结果，作为耐高温鉴定的标准程序，相对湿度和其它栽条件设置在相同水平上。

12）上述第11项所述方法，优选还包括每次所用盆栽盆的大小均为长43cm，宽33cm和高10cm，盆栽土经称量后等量加入，栽培规格为每品种5行，每行12株，周围种植1行高温材料作为保护行，以消除边际影响，保护行和正式实验材料间预留清晰的界限；处理时生长箱内的湿度设定为75%，光暗周期轮换的时长设定为12h。

附图说明

图1 高温胁迫处理试验和抗、感品种HT54 及HT13 的耐高温反应。图中所示为处在两叶一心期的土培苗经不同高温处理79 小时恢复5 天后的生长状况， A：42℃高温处理；B：45℃高温处理；C：48℃高温处理；从图中照片结果可以看出，抗高温品种HT54和感高温品种HT13 对45℃和48℃高温处理的热激反应都呈现质的存活与死亡差异。

图2为水稻抗高温基因定位建立的微卫星分子标记（SSLP）连锁遗传图。标记间的图距为物理距离。

图3 HT54 （抗）X HT13 （感）杂种F2 代抗高温位点的初步连锁群检测结果。所用的分子标记为位于水稻第九连锁群的SSR 标记RM444。图中，M表示分子量标记； RP为抗高温亲本；SP为感高温亲本；RB为抗高温极端单株DNA池；SB为感高温极端单株DNA池; F1为杂种一代植株；1-9为F2隐性感高温极端单株。

图4 抗高温基因OsHTAS在第9染色体上的连锁遗传图谱。(a)：由61株定位群体产生的连锁遗传图谱；(b)：由131株定位群体对(a)图中黑色区段精细定位产生的连锁遗传图谱。

图5 利用候选基因（ZFP）序列中于抗、感高温亲本间呈现的一个单核苷酸多态性（SNP)转换的PCR-RFLP 标记对用InDel5 和RM7364 标记定位时作图群体中出现的交换株进行检测的结果。图中，M、RP、SP、S 分别表示分子量标记（DL2000）、抗高温亲本HT54、感高温亲本HT13 和3 个交换株。

图6 ZFP 抗、感等位基因对45℃高温胁迫处理的动态表达模式分析。所用的分析方法为RT-PCR 半定量分析法。PCR 扩增数为25 个循环，并以水稻肌动蛋白基因actin 作为内标。图中，从上至下4 排分别为HT54（抗）/actin、HT13（感）/actin、HT54（抗）/ZFP 和HT13（感）/ZFP。图中可见，ZFP 在处理6 小时的抗、感高温样本中分别呈上调和下调表达。

图7抗高温基因OsZFP编码序列的亚细胞定位分析。图中显示：与对照35S-YFP相比，35S-ZFP-YFP即抗高温基因编码产物与黄色荧光蛋白的融合蛋白主要定位于细胞膜上。

图8 本申请中所涉及的抗高温基因OsZFP DNA序列、编码序列及其产物氨基酸列。

发明详述

为解决上述问题，本发明人经过锐意研究，在大量试验结果的基础上，完成了本发明。以下结合附图对本发明进行具体说明。

一，水稻苗期耐高温标准化鉴定程序

首先，发明人建立了水稻苗期耐高温标准化鉴定程序。该鉴定程序的突出优点是抗、感分型清楚、结果重衍性好、实际应用性强。因此，该程序的建立将为水稻抗高温种质资源材料的筛选、评价，抗高温基因的遗传分析、染色体定位与克隆提供良好的技术基础。具体鉴定内容请参见实施例1所述的内容。

二，水稻抗高温基因进行了分子定位

在以上试验结果的基础上，发明人利用抗高温水稻材料HT54、感高温水稻材料HT13及其杂交后代F1和F2为示例性试验材料，对水稻抗高温基因进行了分子定位。

试验方法

(1). 亲本多态性标记的筛选

水稻抗高温基因的分子定位选用多态性高和重复性好的微卫星DNA 长度多态性分子标记（SSLP）进行，所用SSR引物均根据Gramene数据库（www.gramene.org）和NCBI（www.ncbi.nlm.nih.gov）数据库上公布的引物序列，由上海生物工程技术服务公司合成。

水稻基因组DNA的抽提采用McCouch等（1988）报道的小量DNA提取法。具体方法步骤如下：1)剪取一小片叶片4-5 cm，加入700μL 1.5 × CTAB（含1.5% CTAB，75 mM Tris-HCI，15mM EDTA，1.05 M NaCl），充分研磨；2)将研磨的匀浆转入1.5 ml的离心管，56℃水浴20 min后冷却至室温；3)加入等体积的氯仿：异戊醇（24:1），摇匀；4)最高速度（13200 rpm）离心10 min；5)将上清液转入新的离心管，并加入两倍体积的预冷的100%酒精，静止20 min后离心收集DNA；6)去上清，风干DNA，加50-100 μL双蒸水，于紫外分光光度计中检测，稀释DNA浓度，制备一套DNA工作溶液，其浓度为50-100ng/μL左右，4℃冰箱保存备用。

2) 定位群体的构建

2008年秋在广东农科院水稻所试验基地以抗高温材料HT54为父本、高温敏感材料HT13为母本配制杂交组合。母本HT13以“温汤杀雄”的方法进行处理，考虑到HT13是对温度敏感的材料，温汤杀雄的温度的设定比通常情况低2℃，以避免其雌蕊受到伤害。具体做法是：于水稻抽穗期，在晴天的上午7：30左右，选好母本HT13的穗子（抽出2/3），将水温调制到43℃的暖水瓶倒置套住母穗，并用棉花塞住瓶口保温，8min后取出穗子，抖掉水珠，有部分颖花（已开花授粉或过几天才能开花）不开，应全部剪去，并立即套上纸袋，9：00左右取父本HT54的穗子，穗柄插在装有自来水的瓶中，以黑布罩住，待一个小时后，父本上的大部分小花均盛开，把花粉抖落在已进行高温杀雄并且开颖良好的母穗柱头上，重复2-3次授粉。授粉后立即给母穗套上牛皮纸袋，袋口用回形针夹住，但不要夹住穗梗，挂上牌子，记上名称及杂交日期，待8天左右可以取下纸袋，成熟时收获F1种子。

2008年冬在海南种植杂种F1，待植株长大后取叶片提取DNA，利用两亲本具有多态性的SSR标记3-4对检验植株是否为真杂种，并在植株抽穗后套袋自交收获F2种子用于后续抗高温鉴定，通过高温处理后的抗、感比进行抗高温基因的遗传分析并对抗高温基因定位。

3) 高温处理程序

按照前述秧苗培养方法和标准化的高温处理程序对亲本、F1和F2进行高温处理。具体步骤是：a.育苗盆准备，即向每盆育苗盆（大小为43cm×33cm×10cm）中加入等量的、且已经过筛、并经充分混匀的稻田土；b. 播种，即把催芽的种子点播在盆中，11行/盆，18粒/行，同时，播种亲本各1行/盘作对照，周围设置2行保护行。肥水管理同一般盆栽水稻管理;C.取样，待秧苗长至三叶期时，每株取第2片叶约2-3cm置于-80℃冰箱，用于鉴定后对敏感单株提取DNA。D.待秧苗恢复生长2天后，即第3片叶即将完全长出的前一天，移入人工气候箱进行高温处理。人工气候箱设置具体如下：33℃1h（光照Light，简写为L，下同）→ 36℃1h（L）→ 39℃1h（L）→ 42℃1h（L）→ 45℃1h（L）→ 48℃7h（L）→ 48℃12h（黑暗Dark，简写为D，下同）→ 48℃12h（L）→ 48℃12h（D）→ 48℃12h（L）→48℃12h（D）→ 48℃12h（L）。湿度75%。

(4). PCR反应程序及检测

SSR分析主要参照Wu等（1993）的方法修订而成，PCR为25 µL体系：2.5 μL 10×缓冲液(Mg2+)；0.5µl 10Mm dNTP；1.0µl 5µM 5′-引物；1.0 µl 5µM 3′-引物；0.5 µl Taq聚合酶；1.0 µl DNA; 18.5 µl ddH₂O。dNTP订购于上海生工，Taq聚合酶订购于鼎国。PCR扩增程序为： 94℃先预变性5 min，然后开始35个循环（94℃变性45s，选择引物适合的温度50-60℃退火45s，72℃延伸45s），接着72℃继续延伸10 min。扩增产物用3%的琼脂糖凝胶电泳（AGE）或4%变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）检测。

(5). 抗高温基因的初步定位

选用F2代分离群体构建作图群体，基因定位采用隐性极端群体法，所用分子标记为微卫星DNA多态性分子标记（SSLP）。其具体程序是，首先对F2分离群体进行高温处理，筛选出感高温的单株用作基因定位的作图群体。然后，从F2分离群体中，随机挑选抗、感高温类型单株各10株，将叶片等量混合后研磨抽提DNA，用于构建感、抗高温的DNA池。之后，利用亲本间具有多态性的SSLP标记（Chen et al., 1997; Temnykh et al.,2000），对两个DNA池首先进行标记分析，筛选出在两个DNA池中具有多态性的标记，籍此，初步确定基因所在的连锁群。在此基础上，再用在DNA池中获得的多态性标记对上述F2分离世代中隐性极端个体构建的作图群体逐一进行基因型测定，所获得的数据用于目标基因的初步定位。

(6). 抗高温基因的精细定位

在初步定位的基础上，进一步对定位区段进行标记加密分析，使其定位区段的长度至少，所用的SSLP标记或从禾本科基因组数据库中（http://www.gramene.org）获得，亦或是自己根据基因组序列设计合成，直到这类标记在目的基因涉及的连锁群上被用完为止。然后，利用生物学信息对标记区间（一般至少要小于或等于0.5Mb）内的编码序列进行生物学功能预测和分子特征化（包括基序、功能域、保守序列和调控序列等）分析，以便确定出候选基因。之后，针对候选基因设计特异引物，并通过TA克隆对候选基因进行克隆与测序，根据是否存在差异预测出目的基因。

(7). 遗传距离的计算

将电泳图片结果进行数值统计转换：与HT54带型一致的记为A，与HT13带型一致的记为B，同时具有两亲本带型的记为H，没有带的记为-。

连锁遗传分析采用MAPMAKER3.0软件（Lander et al, 1987）进行分析，计算遗传距离（cM），并进行遗传作图Mapdraw2.1（刘仁虎和孟金陵，2003），对抗高温基因进行定位分析。

为精确定位所述基因，发明还开发了一种新的定位标记，所述标记的制备示例请参见下文中的实施例2。

遗传分析与基因定位结果

1) 亲本多态性筛选和分子图谱建立

总共使用了2304个SSLP分子标记对亲本进行了多态性筛选，从中筛选出322个在亲本间具有多态性的SSLP标记分子，其在染色体上的分布按照物理距离度量如图6，除第9染色体和着丝点附近外，获得的多态性SSLP标记较均匀覆盖了各个染色体。

水稻抗高温基因定位建立的微卫星分子标记（SSLP）连锁遗传图如图2所示。标记间的图距为物理距离。

2) 遗传分析证实HT54在苗期的抗高温特性是受主效显性单基因控制

利用标准化的高温处理程序于两叶一心期对亲本、杂种F1和F2进行高温处理。结果表明：高温处理后的F1植株完全存活，F2群体则呈现明显的抗、感分离，其中，抗高温植株442株，感高温植株152株，抗、感分离符合3:1的分离比率（见表1），卡平方测验，P>0.05，表明差异未达显著水平。该结果因此说明HT54在苗期的抗高温特性是受主效显性单基因控制，该基因现被命名为OsHTAS （ O ryza s ativa Heat Tolerance at Seedling stage）。

表1 HT54抗高温特性的遗传分析结果

3) 初步定位显示抗高温基因位于水稻第9连锁群

在322对于亲本间有多态性的SSLP标记中，发现只有RM444检测抗高温DNA池时呈现杂合带型，且感高温DNA池和敏感亲本一致，这说明RM444可能与目标基因连锁 (参见图3)。另外，在F1的PCR扩增产物中，两个亲本带型扩增强度基本一致；抗高温DNA池带型为杂合型，但其中的HT54带型明显强于HT13的带，暗示抗高温DNA池可能包含抗高温纯合体和杂合体两种；而感高温DNA池带型基本上为HT13带型，说明该DNA池主要由感高温的隐性纯合单株的DNA组成，因而预示所用的分子标记与目标抗高温基因可能连锁。于是，从高温处理过的F2群体中选择了61株隐性极端感高温单株和40株抗高温单株构建了两个验证群体，进行RM444标记分析。结果显示：61株隐形极端感高温单株中有13株为杂合带型，43株为HT13带型，5株为无带，0株为HT54带型；而40抗高温植株中有23株为杂合带型，2株为HT13带型，15株为HT54带型。这些结果因而进一步验证了RM444标记是和抗高温基因OsHTAS连锁的。

4) 精细定位进一步将抗高温基因定位于两个分子标记 RM7364和InDel5之间，该区间的实际物理距离为420bp

从www.gramene.org网站上的数据库中搜寻第九号染色体的短臂端（即RM444上方）引物，进行亲本标记型分析，共找到3个在亲本间具有多态性的SSLP标记，它们分别是RM23687、RM23719和RGNMS2991。利用这三个标记扫描之前用过的61株定位群体后，发现RM23719和RM23687确实与抗高温的OsHTAS基因连锁（图4a），其连锁距离分别为12.2 cM和13.1 cM，而RGNM2991未能获得有效数据；另外，还发现RM23719紧邻地位于RM444的下方，两者的遗传距离为0.9 cM（图4a），但两者的实际物理距离为4.48Mb；而RM23687接近端点(两者相距1.07Mp)，与RM23719相距1.01Mb，但检测到的与抗高温基因OsHTAS间的连锁遗传距离达到17.9 cM之多。根据禾本科基因组数据库列出的水稻第9染色体上的信息，发现之所以检测到上述这种不正常的连锁遗传情况，可能是由于RM23719靠近离着丝点的缘故。由此，推测抗高温基因可能在RM444的下方，即水稻第9染色体的长臂端。

接着，从禾本科基因组数据库中搜索水稻第9染色体的长臂端（即RM444下面）引物，共找到114对SSLP引物，经亲本多态性分析，共找到10对具有亲本多态性的引物，它们分别是RM23982、RM23985、RM7364、RM24019、RM5777、RM240712、RM24075、RM24099、RM24102、以及RM24170 。对抗、感DNA池进行标记分析的结果显示：RM23982、RM23985、RM7364和RM24019在抗、感高温DNA池间也表现多态性，接着用这些标记对61株F2定位群体作进一步的标记分析，进而把抗高温基因OsHTAS定位在RM23985和RM7364 (见图8b) 之间。在未能在此区间进一步找到已知SSLP标记的情况下，转而依据籼粳稻基因组的序列信息设计了90对插入/缺失（Insertion/Deletion, InDel）标记，在对亲本进行标记分析后，共找到8对具有亲本多态性的引物，但只有InDel3和InDel5在亲本间的差异较大，且易于进行定位群体带型的辨别。

抗高温基因OsHTAS在第9染色体上的连锁遗传图谱如图4所示。

这两个插入/缺失标记的引物序列分别是，InDel3F： 5′-GTTTGCGACATTGGAGCCTTC-3′和InDel3R：5′-AATGCTTGGGTATGCTAG GTGAA-3′；InDel5F: 5′-TCCTCGGAGATGTTTGACCTTG-3′和InDel5R: 5′- CAGAAGGTG TACGCAACTCTTGT-3′。

由此，利用这两个自主设计的插入缺失标记进一步把水稻抗高温基因OsHTAS定位在RM7364和InDel5之间，其基因和这两个紧密连锁标间的遗传距离分别为2.5cM和1.7cM，标记间的实际物理距离为420Kb。然后，将定位群体扩大至131株，所检测到的InDel3、InDel5、RM7364、RM24019与抗高温基因OsHTAS间的遗传连锁距离分别为4.0 cM、3.2 cM、1.2 cM和1.6 cM (图4b)。这些定位结果基本与前述61株定位群体的定位结果一致。

5) 所确认的候选基因为锌指蛋白基因，其在抗、感高温亲本间有两处SNP差异，并与由其中之一开发展的PCR-RFLP标记共分离

由于在上述定位区间内难以再获得可供使用的多态性标记，转而利用现有的生物学数据库信息结合已公开发表的基因数据去筛选和确定候选基因。从http://rice.plantbiology.msu.edu/ 网站上搜索420Kb长的定位区段（从Indel5到RM7364）DNA序列总计找到60个已知和未知基因，其中，15个为编码反转录转座子蛋白的基因，6个为编码转座子蛋白的基因，27个为编码已知功能蛋白的基因，12个为编码未知功能蛋白的基因。已有的报道结果表明：有关的泛素结合酶蛋白（LOC_Os09g15320）和锌指蛋白（LOC_Os09g15430）基因均与水稻耐高温性相关，因此，将其初步确定为候选基因；接着，我们对标准化后的芯片数据进行分析，在8个苗期表达超过100的基因[核苷碱基-抗坏血酸转运蛋白（LOC_Os09g15170）、逆转座子蛋白（LOC_Os09g15250）、泛素结合蛋白（LOC_Os09g15320）、转运家族蛋白（LOC_Os09g15330）、水解酶（LOC_Os09g15340）、NAD依赖表异构酶/脱水酶（LOC_Os09g15420）、锌指蛋白（LOC_Os09g15430）和在DGCR区的富含丝氨酸/苏氨酸蛋白T10（LOC_Os09g15480）]中，泛素结合蛋白（LOC_Os09g1532）和锌指蛋白（LOC_Os09g15430）都是高量表达的，说明这两个基因对水稻苗期的生长发育起着重要的作用。于是，从抗、感亲本的幼苗叶组织中扩增这两个候选基因的cDNA序列和启动子及终止子基因组DNA序列进行测序，结果发现抗、感亲本的cDNA序列均没有差异，但锌指蛋白（LOC_Os09g15430）的5′端非翻译区及其启动子序列上各存在一处单碱基多态性（SNP）差异。由于启动子序列中的SNP差异导致一个限制性内切酶Bsp1407识别位点(T↓GTACA)的改变，籍此，设计了一个PCR-RFLP（CAPs）标记，记为RBsp1407。

该标记的PCR扩增产物的大小为580bp。对扩增后的PCR产物进行回收，然后利用内切酶Bsp1407Ⅰ酶（Promega）对此片段进行酶切，结果显示：HT54的扩增产物不能被酶切，片段大小依然为580bp，而HT13和131株作图群体中呈现的所有交换株均能被酶切，切开后产生大小为422bp和158bp两个片段（图5）。PRBsp1407I标记在InDel5和RM7364之间呈现0交换株这一试验结果说明：在所用定位群体大小条件下该标记和抗高温基因OsHTAS呈现共分离，由此进一步将候选基因确定为锌指蛋白基因。

以下通过具体实施例的方式对本发明的技术方案进行详细描述。本领域技术人员明了，所述具体实施方案是为有利于本领域技术人员再现本发明所给出的示例性技术信息，其不作为对本申请请求保护的权利要求的限制，基于所述示例试验方案的改变，只要其技术方案和其所达到的有益效果不背离本发明的主旨，则经所述改变的技术方案均应包含在本申请的保护范围之内。

实施例

实施例1 抗高温基因的鉴定

本实施例采用耐高温水稻品种HT54和高温敏感水稻品种HT13（两者均为稻种籼亚种（O.sativa ssp. indica））为示例性试验材料。

1) 水稻秧苗的培育和抗高温处理条件的设定

(1). 秧苗培育

取同一地块水稻田土壤，自然风干后粉碎过筛，按相同重量分装在植物生长盆（26cm×18cm×6cm）中，加等量水浸泡一夜后用于播种。试验材料经浸种、催芽后播种。每盆分为两个部分，一半种HT54，另一半种HT13，每个品种3行，每行8株。

(2). 高温处理时期和处理温度及其它条件设置

高温处理时期为苗期，所用的人工气候箱为浙江宁波福实验仪器厂生产的智能人工气候箱PRX-1000B，温度设置共分42℃、45℃和48℃三个处理，温度是从33℃开始以3℃/h的速率上升，直至到达设定高温，所用湿度为75%，其它栽培条件设置在相同的水平上。

(3). 水稻抗高温鉴定程序和标准化参数设定

水稻抗、感高温品种HT54 和HT13秧苗经土培生长至两叶一心和三叶一心期移入生长箱，进行3种温度的高温处理，处理时间为79h，待处理完毕并恢复5天后，观察秧苗对高温的反应。结果如图1所示。由图1的结果可以清楚地看出：当温度为42℃时，处理后的抗、感高温品种秧苗均完全存活；而当处理温度为45℃和48℃时，处理后的抗、感高温品种呈现质的存活与死亡差异（图1），但显然45℃不是抗高温品种HT54能忍耐的高限温度，因此，最终选定48℃作为标准程序的温度设定值。于是，由该试验确定的水稻苗期抗高温鉴定程序可概括为：两叶一心的土培秧苗，48℃高温和75%相对湿度条件下处理79h，恢复5d后，观察秧苗对高温的反应，并以能否存活作为水稻抗、感高温的鉴定指标。图中照片结果可以看出，抗高温品种HT54和感高温品种HT13 对45℃和48℃高温处理的热激反应都呈现质的存活与死亡差异。

实施例2 新基因标记的确认

为实现水稻抗高温基因的精确定位，显然现有技术中的SSLP不足以满足需要。为此，发明人开发了新的定位标记。具体而言，发明人通过NCBI（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）公布的粳稻日本晴和籼稻9311的全基因组序列差异寻找插入/缺失多态性（Insertion/Deletion, InDel）位点。根据此位点所在的两端DNA序列，利用Primer5.0设计合适的引物，通过NCBI在线Primer blast保证其引物的特异性。

TA克隆及测序分析

a）加A反应：由于纯化的PCR产物是用Proybest酶扩增获得的，其末端为平末端，需要加上碱基A，才能进行TA克隆。加A反应的总体系为20µL，所要加入成分和体积为：10×PCR缓冲液， 2µL；Taq酶，0.5µL；dNTPs（10mM），0.5µL；PCR纯化产物，17µL。混匀放到PCR仪上，72℃ 30min，4℃保存。使用Axy Prep PCR Clean-up Kit（Axygen）纯化加A反应产物。

b） 连接：参照pMD18-T载体系统试剂盒（TaKaRa）说明书进行操作。取4µL纯化的加A反应产物与5µL连接混合液（solution I）和1µL pMD18-T载体混合，16℃下连接，恒温1-2小时（恒温仪中进行）。

C）连接产物大肠杆菌热击转化：从-80℃取感受态细胞，加入10µL连接反应液，轻轻摇匀，于冰上放置30min；42℃水浴热击90s，立即置于冰上2min；之后，每管加800µL LB培养基，37℃摇床低速震荡培养45min（使细菌复苏，转速不超过190rpm）；将上述菌液富集后涂布于LB筛选平板（Amp/IPTG/X-Gal）上；待菌液完全被培养基吸收后倒置培养皿，37℃过夜培养。

d）转化子阳性克隆的鉴定：挑取白色菌落，利用载体测序通用引物进行PCR扩增鉴定。PCR反应体系同上，其反应程序为：94℃ 5min预变性，之后95℃ 30s， 55℃ 30s，72℃延伸（具体时间根据目的基因大小确定），共30个循环，接着72℃ 延伸5min。

e）PCR产物电泳鉴定：阴性菌落的PCR产物长度为156bp（仅载体上扩增的序列），阳性菌落PCR产物片段大于156bp（目的基因片段长度+156bp）。

F）阳性克隆测序：取5mL含50µg/mL Amp的LB液体培养基到50 mL离心管中，接种菌落PCR呈阳性的菌落，37℃，220rpm振荡培养过夜；取培养的菌液到1.5mL离心管中，12000rpm离心2min，去上清，将离心管倒置于吸水纸上，使细菌沉淀尽可能干燥；用Axygen质粒抽提试剂盒提取质粒DNA。抽提的质粒DNA于-20℃保存备用，同时分别取10µL质粒对应的菌液进行测序验证（上海英俊）。每个基因测序验证3个阳性转化子。本发明所述的新标记是由抗、感高温亲本在候选基因的启动子上出现的一个SNP发展而来。具体地说，该SNP的出现导致了一个限制性内切酶Bsp1407 I识别位点的改变，其在抗高温亲本上的序列为 5'-TGGACA-3'，不能被Bsp1407 I识别，而在感高温亲本上的序列为5'-TGTACA-3'，能被Bsp1407 I识别；因此，针对SNP所在的区域设计特异引物，扩增出相应的基因组片段，再用Bsp1407 I酶切，即可检测这种多态性差异。

根据这个原理，本实施例所设计的特异引物序列为，BspF: 5´-CCATCCAAACACGCCCTAA-3´ 和 BspR: 5´-ATTGCCCCTTGCTATGG T-3´，PCR扩增的产物大小580bp，来自感高温亲本的PCR产物被Bsp1407 I酶切后得到的两个片大小分别为422bp和158bp，由此开发的PCR-RFLP标记记为RBsp1407。

该标记在抗高温基因定位过程中已被证实是与目标基因共分离的。

在确认RBsp1407标记的试验中，发明人用该标记对隐性极端定位群体经两个紧密连锁标记RM7364和InDel5分析后出现的3个重组单株进行了验证性检测，结果出现了与隐性感高温亲本一致的结果如图5所示。由此，发明人还开发出插入/缺失标记InDel5，该标记位于水稻第九染色体距短臂端9130-9150kb之间，在抗、感亲本间所述标记具有长度多态性；以及微卫星DNA标记RM7364，该标记位于水稻第九染色体距短臂端9440-9450kb之间。对于标记RM7364，设计引物RM7364F: 5´-TTCGTGGATGGAGGGAGTAC-3´；和RM7364R: 5´-RGCGTTTGTAGGAGTGCCAC-3´，同样，发现在抗、感亲本间所述标记经引物的扩增产物具有长度多态性。

实施例3 抗高温基因OsHTAS 的确认

经前述的基因定位研究，本发明人所发现了定位于水稻基因组第9染色体上的新基因，即显性耐高温基因OsHTAS。所述显性耐高温基因OsHTAS与隐性等位基因Oshtas在DNA序列上的差异仅为一个单核苷酸多态性（SNP）的差异，发生在OsHTAS 5 '-端非翻译区与耐高温、耐盐和耐干旱相关的基序上（11T12G），OsHTAS（TTTTTTTTTTTGGGGGGGGGGGG） 比Oshtas（TTTTTTTTTTTGGGGGGGGGGG）多一个G；显性耐高温基因（LOC_Os09g15430）OsHTAS 基因组序列全长4784bp，编码序列（CDS）全长1245bp，编码产物为414aa，属于锌指家簇蛋白；水稻（Oryza sativa）ZFP 基因，具体序列如序列表中SEQ ID NO:1所示。

发明人在具体试验过程中对所述基因部分位点进行了插入、缺失、替换，对所获得的突变体实施了功能验证，结果表明因遗传密码子的简并以及部分位点的突变等操作后所获得突变体保持了与SEQ ID NO:1所示基因同样的抗高温功能。更具体而言在对应于如SEQID NO.1 所示的核苷酸序列中的第-1395到-1406位核苷酸为GGGGGGGGGGGG保持不变，在除此之外的核苷酸序列中经缺失、替换、插入一个或多个核苷酸所得的多核苷酸序列所编码的多肽仍具有抗高温功能。所述的插入、缺失、替换依照本领域公知的遗传操作方法进行，经变化的核苷酸数目优选1－100，更优选1－50个， 1－20个，更优选1－10个核苷酸的改变。

此外，发明人将本发明的抗高温基因与诱导型启动子连接，构建了表达载体，将其转化酵母DY1455、拟南芥（Arabidopsis thaliana Columbia）等宿主细胞，成功获得了阳性转化子。

实施例4 抗高温基因OsHTAS对高温胁迫的响应特点

用45℃高温对不同抗、感高温品种进行12小时持续处理，并于8个时间点（0h、1h、2h、4h、6h、8h、10h、12h）取样抽提RNA，对候选基因OsHTAS进行RT-PCR半定量表达分析。结果显示：该基因在抗、感高温品种HT54和HT13中的表达变化模式明显不同，在HT54上该基因的表达量在6小时处明显上调，但在HT13上表现为下调，结果如图6所示，图示结果说明候选基因对高温胁迫具有主动响应的特点。图中可见，OsHTASP在处理6小时的抗、感高温样本中分别呈上调和下调表达。

实施例5、 候选基因的功能验证：过表达分析

将候选基因的CDS克隆出来连入由肌动蛋白启动子ActinI驱动的过表达载体中，利用农杆菌介导法将其导入日本晴和敏感品种HT13的基因组中，并分别获得了5个阳性独立转化体。之后，利用前述提到的人工气候箱对这些阳性独立转化体的土培苗于二叶一心至三叶一心期进行79小时的48℃高温处理，并以野生型植株为对照。处理完毕将其移出生长箱，于正常温度条件下恢复5天后观察记录秧苗对高温处理的反应。结果显示：经高温处理后的所有过表达植株均与HT54一样恢复正常生长，表明所转化的候选基因确实具有耐高温的特性。

实施例6、候选基因的功能验证：RNAi敲除

将候选基因的CDS区和UTR区一段特异序列，正反向连入RNA干扰载体pTCK303中，利用农杆菌介导法将其导入日本晴和敏感品种HT54的基因组中，各获得5个和三个阳性独立转化体。之后，利用前述提到的人工气候箱对这些阳性独立转化体的土培苗于二叶一心智三叶一心期进行79小时的48℃高温处理，并以野生型植株为对照。处理完毕后移出生长箱于正常温度条件下恢复生长5天，再观察记录秧苗对高温处理的反应。结果显示：经高温处理后的所有过表达植株均与HT13一样完全死亡，该结果进一步表明所转化的候选基因确实具有耐高温的特性。

实施例7、候选基因OsHTAS的亚细胞定位分析

通过基因枪轰击洋葱表皮在共聚焦显微镜下的亚细胞定位结果表明，与对照35S-YFP相比，35S-ZFP-YFP即候选基因与黄色荧光蛋白的融合蛋白主要定位于细胞膜上，结果如图7所示，该结果说明候选基因ZFP的编码产物是一种膜蛋白，这与相当数量的膜蛋白参与逆境信号传导的结论十分吻合，说明了一种亚细胞定位与功能表达之间的相关关系。 图7所示结果显示：与对照35S-YFP相比，35S-ZFP-YFP即候选基因与黄色荧光蛋白的融合蛋白主要定位于细胞膜上。

综上，本申请所公开的发明结果可以增进本领域技术人员对抗高温性状基本遗传规律的了解，同时，该抗高温遗传位点的定位和候选基因的确认与克隆及其共分离标记的开发都将为后续候选基因的功能分析和在分子育种上的有效利用奠定了良好的理论和材料基础。

序列表独立文本

SEQ ID NO:1 OsHTAS基因组序列；

SEQ ID NO:2 OsHTAS基因编码序列；

SEQ ID NO:3 OsHTAS蛋白多肽序列；

SEQ ID NO:4 人工引物序列；

SEQ ID NO:5 人工引物序列；

SEQ ID NO:6 人工引物序列；

SEQ ID NO:7 人工引物序列；

SEQ ID NO:8 人工引物序列；

SEQ ID NO:9 人工引物序列；

SEQ ID NO:10 人工引物序列；

SEQ ID NO:11 人工引物序列。

序列表

<110> 浙江大学

广东省农科院水稻研究所

<120> 一个水稻抗高温的基因

<130> CPCH1263656N

<160> 11

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 4784

<212> DNA

<213> 水稻（Oryza sativa L ssp.indica）

<400> 1

gagaagcgcc acaggaaaac gagccgcgtc gctttcgcga gagagggaca cctgctctgc 60

ttccgcttcc gcttccccct ctcgagtctc tcgcctctcc cccgtggcca acccacacac 120

cgcgggttgg aggaggagga ggaggaggta ggggaaatcc ccgtcggccg tcggctcggc 180

gccgaatcga tccggtgagt gagtgattga gttcgtctct gctctctctc ctccttgttc 240

aattatcaag ctcttgaatc gagtcctagt agtagtgtgc tagaggtgct ggatgatttg 300

ggtttttggg gatttttttt tttggggggg gggggttgtt tgggaactgc tagtgcgttt 360

gtggtatact ggtatgggag ttcgttgcta atggacgggg tatttgggaa cttttagggt 420

tttgtttgga tggatttttg gttgtggttt ttgtcaggaa tgggtgtcgg cgacttggtt 480

agctttagct tttgagaatt tttttcgccc ctgttgttct gttcatggtt catctttaga 540

ttcagaggag aatccttcta gcgtttttct gagaatgaaa cctttttttt tatgttttta 600

tttttacggg gctataattt ttccactgcc ttttgtgatt actattacat aattacatgt 660

ccctttgatg aataatggat gttggttctt tggctaaaag tcaaattgcg acttgaagta 720

gaaacgggtg tacctgggat taagttgcca tcgctggaac tagagttaat tattggtttg 780

atcattgttg cttcgcgttg gatatactat cggtttagca gttagcatga tactaaatca 840

taggaaggct actatgattg gagaaccgtg gtgttgtata actgattaga ttctttcaaa 900

tatgattttc agttagaccg ctcattggtt caggatcagg gtcttttgca gttctcccaa 960

atattgcact aatttgtttg ccaaataatc atgcaaaact tacatgagtg gtggcattaa 1020

ctcttttatt caaatacatg gttgttcaat gatggtatta actcttctat tcaacaggct 1080

gtaaaaaatt aagtgaataa tccttgtccc gctacttaaa atctagtcaa gactcagatt 1140

ggaaaccatt ggggactagt aaagtttatg ggacttggac gtgtacatta catgcacatg 1200

cccatgatac attaacagga tggatgttct attctggaag gttaaatata atagttctta 1260

gaaagttaga gttttcagac cgatggtatg cttgcatata tttttagaag tatcaaatat 1320

gatgagagtt cttaaaagaa ttgggtttgt taactatgtt gagtgccttc tactatttat 1380

tttacaggtt tttattgttc atggtgatat actatatgca tgaataagtt acagttatgt 1440

aatatatatg ggcaaggatg tataagaagt tcatttgttt tctaaatttg tagcttaggc 1500

ttcttctgct gggctcttcc atgaagcaaa tgaagtttat aatgcacata ctaatgttca 1560

gtatattata ctgagaatca actttattct cagctgtata tacactagta tgccagccat 1620

tggtagctac ttgaaaggat ggtgaaacgc atatgattac ccatgatgag catgtgtgtt 1680

cccttttttt attagtgcta agctggaaat caataaatcc aagatattca tggagcatgc 1740

tacctgtgat gatgtgcatg agcatgctat aaatgtatca catggagaaa ctgcatcaac 1800

atcaaccagt catcaagatt tgcacagtga ttcagatgat tcacatcagg atgataggcc 1860

ttcaacaagc acacaaaccc catcaccaca gtcttcagca tcaacttcgc ccactgcata 1920

taacaccaga aatttatcct ttcctagaag agatagtatg tatggtcatg gaagaagtat 1980

ttggaattct ggtttgtgga tctcgtttga actggtcata tatgtagtac agattgtagc 2040

tgctattttc gtccttgtct tttcaagaga cgaacatccg catgcccctt tatttgcatg 2100

gataattggt tacacaattg gctgcattgc aagcattcct cttatttgtt ggcgctgtgc 2160

ccatcgaaac agaccttcgg aacaagaacc tgaacaacca cccgcagcct atcctaattt 2220

gacttcctct caatcatcag aaggacgcaa tcagcgtagc agtggtactg ttttgcattt 2280

tggatgtatc acaatttcgt gtccaaggta atttgtagtt ccatgttatt tttctatctt 2340

gaatttccta aagtcctgta tgtgaactcg tgtatgcagt ctcactccta tgcatttttt 2400

gaagaaactg ctatccattt gcatcttata aacatattta tgctttccaa taactgaaag 2460

atgcaacaaa taaactgata gttgaattga ttgaaactat caactctagg gcatcctaat 2520

tagtttattt ttgatattcc attggatcac gcaggtacca cagtcctatg ttcttgagtt 2580

gagccttcta tttgtgcgta gtaccacgat atggattcta caatatattt ttactgcaat 2640

ttgttttttc tcagtcattc tggaagtgta gaagatatat atgctcttgt ttctttgacc 2700

taggaatttg gaacagttgt gttgacctct tcaaggtgta atattacaat gttcgctgca 2760

gatacctcat tacattggag gggaggatgt tccctttcta tatttgttgt gcttgacaaa 2820

agcattcaac attgtggagc gtaatgtgtc ctatttaact ggaattggtc ctgttgaaaa 2880

ttgtactagt ctactctaaa gtattaaaac tttataagta aatttgaaga aatgcgtgat 2940

gcgagatctt atagtactta gttttgtgct aaatttgata tggatgtatt aactgaggtg 3000

attatacatt acaggcctag catattggct tatcatttca agacagctgt agactgtttc 3060

tttgctgtat ggtttgttgt tggcaatgtg tggatttttg gtgggcacag cactttgtca 3120

gattctcagg aagctcccaa tatgtatagg tattttcttt cctatcattc atagcttttc 3180

tgaactcaat caactcatgc cttactttgt tgcctcttgc taggctatgc ttagcattcc 3240

ttgcacttag ttgtgttggg tatgctattc ccttcgtcat gtgtgcagcc atatgctgct 3300

gctttccatg cttaatttct cttctgcgcc ttcaagagga tttgggtcat actagaggag 3360

ctactcaaga actaattgat gcactgccaa cctacaaatt caagccaaaa cgaagcaaaa 3420

tgtgggttga ccatgcttca agctcagaga atcttagcga gggtggcatc ctgggcccag 3480

gaactaaaaa ggaaaggatt gtttcagctg aagatgctgt gagtatattt cacattttca 3540

tatcattttc atgtctgatg atacttgatt tgcaattagt attgaggggg tttccgtaaa 3600

acaagtattg atgggattcc ttgtatcgac cttcatgtac cttataattt agtaatcata 3660

actccattca caagtgaata cttaagcagc ctctgttatg cagtaatatg tactgtctta 3720

gccttatctt attttggaat atatttaaca aaaggtctag ctcgtgatga tgcttttaca 3780

catctttttc agataacaat gagacttccc ttttttcctc agtgaaacat atagtgttct 3840

aggtaaatat tcattaacaa aagtgtttta gggaaatatt ctgctttatg agaaatagtt 3900

ttgtttatat tatactacag tatctttttt ctcgtgtatc ttcaaacagt tgtagttaca 3960

ctcgctttca taagtccttt tctaaattcc attcatttcc ttcagtaaca tgggacctct 4020

tggaattttc caagttacct gacttactgt ctggattatt atttttgtag ctcattcaat 4080

ttgccattac taacttgaaa ccagggttct cgaaataatg ttatagttgt tttagtttga 4140

ttcataagtc ataacatata acttgtcaac atctattgat atctgcaggt gtgctgcatc 4200

tgtcttacta agtacggaga tgatgatgag ctccgtgagc ttccttgcac ccacttcttt 4260

catgtgcaat gtgtcgataa atggctcaag ataaatgcag tgtgcccact ctgcaagacc 4320

gagattgggg gtgtggttcg atcatttttt ggcttgccct ttggtcgccg acgtgttgat 4380

aggatggcag gaagaggtat agctagctcg agattcactg tatagaacac gtcttcttct 4440

ctagcatgtt tgcttgtttc atctgctcat atgcacataa aagacgtgct catggattgt 4500

agtttgttga tttgcaatga aagcgataat ctgctttcat cacccttgag ttcaccaaag 4560

tgatgacaga aaagtggaga cctgatgctt gcagtgacaa gtttctgcag tacagtagaa 4620

acataagtat attctgatgt aacatttgat gtcaagattg taaataaaga gcacaaagtt 4680

cacttcgggg gtgtatatct gcatgtgtat gggaaaggaa agcctaatta gttagtaact 4740

ttgtgggcat tttattgtgt gcaatcattg atcttgtttt tccc 4784

<210> 2

<211> 1245

<212> DNA

<213> 水稻（Oryza sativa L ssp.indica）

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(1245)

<400> 2

atg gag cat gct acc tgt gat gat gtg cat gag cat gct ata aat gta 48

Met Glu His Ala Thr Cys Asp Asp Val His Glu His Ala Ile Asn Val

1 5 10 15

tca cat gga gaa act gca tca aca tca acc agt cat caa gat ttg cac 96

Ser His Gly Glu Thr Ala Ser Thr Ser Thr Ser His Gln Asp Leu His

20 25 30

agt gat tca gat gat tca cat cag gat gat agg cct tca aca agc aca 144

Ser Asp Ser Asp Asp Ser His Gln Asp Asp Arg Pro Ser Thr Ser Thr

35 40 45

caa acc cca tca cca cag tct tca gca tca act tcg ccc act gca tat 192

Gln Thr Pro Ser Pro Gln Ser Ser Ala Ser Thr Ser Pro Thr Ala Tyr

50 55 60

aac acc aga aat tta tcc ttt cct aga aga gat agt atg tat ggt cat 240

Asn Thr Arg Asn Leu Ser Phe Pro Arg Arg Asp Ser Met Tyr Gly His

65 70 75 80

gga aga agt att tgg aat tct ggt ttg tgg atc tcg ttt gaa ctg gtc 288

Gly Arg Ser Ile Trp Asn Ser Gly Leu Trp Ile Ser Phe Glu Leu Val

85 90 95

ata tat gta gta cag att gta gct gct att ttc gtc ctt gtc ttt tca 336

Ile Tyr Val Val Gln Ile Val Ala Ala Ile Phe Val Leu Val Phe Ser

100 105 110

aga gac gaa cat ccg cat gcc cct tta ttt gca tgg ata att ggt tac 384

Arg Asp Glu His Pro His Ala Pro Leu Phe Ala Trp Ile Ile Gly Tyr

115 120 125

aca att ggc tgc att gca agc att cct ctt att tgt tgg cgc tgt gcc 432

Thr Ile Gly Cys Ile Ala Ser Ile Pro Leu Ile Cys Trp Arg Cys Ala

130 135 140

cat cga aac aga cct tcg gaa caa gaa cct gaa caa cca ccc gca gcc 480

His Arg Asn Arg Pro Ser Glu Gln Glu Pro Glu Gln Pro Pro Ala Ala

145 150 155 160

tat cct aat ttg act tcc tct caa tca tca gaa gga cgc aat cag cgt 528

Tyr Pro Asn Leu Thr Ser Ser Gln Ser Ser Glu Gly Arg Asn Gln Arg

165 170 175

agc agt ggt act gtt ttg cat ttt gga tgt atc aca att tcg tgt cca 576

Ser Ser Gly Thr Val Leu His Phe Gly Cys Ile Thr Ile Ser Cys Pro

180 185 190

agg cct agc ata ttg gct tat cat ttc aag aca gct gta gac tgt ttc 624

Arg Pro Ser Ile Leu Ala Tyr His Phe Lys Thr Ala Val Asp Cys Phe

195 200 205

ttt gct gta tgg ttt gtt gtt ggc aat gtg tgg att ttt ggt ggg cac 672

Phe Ala Val Trp Phe Val Val Gly Asn Val Trp Ile Phe Gly Gly His

210 215 220

agc act ttg tca gat tct cag gaa gct ccc aat atg tat agg cta tgc 720

Ser Thr Leu Ser Asp Ser Gln Glu Ala Pro Asn Met Tyr Arg Leu Cys

225 230 235 240

tta gca ttc ctt gca ctt agt tgt gtt ggg tat gct att ccc ttc gtc 768

Leu Ala Phe Leu Ala Leu Ser Cys Val Gly Tyr Ala Ile Pro Phe Val

245 250 255

atg tgt gca gcc ata tgc tgc tgc ttt cca tgc tta att tct ctt ctg 816

Met Cys Ala Ala Ile Cys Cys Cys Phe Pro Cys Leu Ile Ser Leu Leu

260 265 270

cgc ctt caa gag gat ttg ggt cat act aga gga gct act caa gaa cta 864

Arg Leu Gln Glu Asp Leu Gly His Thr Arg Gly Ala Thr Gln Glu Leu

275 280 285

att gat gca ctg cca acc tac aaa ttc aag cca aaa cga agc aaa atg 912

Ile Asp Ala Leu Pro Thr Tyr Lys Phe Lys Pro Lys Arg Ser Lys Met

290 295 300

tgg gtt gac cat gct tca agc tca gag aat ctt agc gag ggt ggc atc 960

Trp Val Asp His Ala Ser Ser Ser Glu Asn Leu Ser Glu Gly Gly Ile

305 310 315 320

ctg ggc cca gga act aaa aag gaa agg att gtt tca gct gaa gat gct 1008

Leu Gly Pro Gly Thr Lys Lys Glu Arg Ile Val Ser Ala Glu Asp Ala

325 330 335

gtg tgc tgc atc tgt ctt act aag tac gga gat gat gat gag ctc cgt 1056

Val Cys Cys Ile Cys Leu Thr Lys Tyr Gly Asp Asp Asp Glu Leu Arg

340 345 350

gag ctt cct tgc acc cac ttc ttt cat gtg caa tgt gtc gat aaa tgg 1104

Glu Leu Pro Cys Thr His Phe Phe His Val Gln Cys Val Asp Lys Trp

355 360 365

ctc aag ata aat gca gtg tgc cca ctc tgc aag acc gag att ggg ggt 1152

Leu Lys Ile Asn Ala Val Cys Pro Leu Cys Lys Thr Glu Ile Gly Gly

370 375 380

gtg gtt cga tca ttt ttt ggc ttg ccc ttt ggt cgc cga cgt gtt gat 1200

Val Val Arg Ser Phe Phe Gly Leu Pro Phe Gly Arg Arg Arg Val Asp

385 390 395 400

agg atg gca gga aga ggt ata gct agc tcg aga ttc act gta tag 1245

Arg Met Ala Gly Arg Gly Ile Ala Ser Ser Arg Phe Thr Val

405 410

<210> 3

<211> 414

<212> PRT

<213> 水稻（Oryza sativa L ssp.indica）

<400> 3

Met Glu His Ala Thr Cys Asp Asp Val His Glu His Ala Ile Asn Val

1 5 10 15

Ser His Gly Glu Thr Ala Ser Thr Ser Thr Ser His Gln Asp Leu His

20 25 30

Ser Asp Ser Asp Asp Ser His Gln Asp Asp Arg Pro Ser Thr Ser Thr

35 40 45

Gln Thr Pro Ser Pro Gln Ser Ser Ala Ser Thr Ser Pro Thr Ala Tyr

50 55 60

Asn Thr Arg Asn Leu Ser Phe Pro Arg Arg Asp Ser Met Tyr Gly His

65 70 75 80

Gly Arg Ser Ile Trp Asn Ser Gly Leu Trp Ile Ser Phe Glu Leu Val

85 90 95

Ile Tyr Val Val Gln Ile Val Ala Ala Ile Phe Val Leu Val Phe Ser

100 105 110

Arg Asp Glu His Pro His Ala Pro Leu Phe Ala Trp Ile Ile Gly Tyr

115 120 125

Thr Ile Gly Cys Ile Ala Ser Ile Pro Leu Ile Cys Trp Arg Cys Ala

130 135 140

His Arg Asn Arg Pro Ser Glu Gln Glu Pro Glu Gln Pro Pro Ala Ala

145 150 155 160

Tyr Pro Asn Leu Thr Ser Ser Gln Ser Ser Glu Gly Arg Asn Gln Arg

165 170 175

Ser Ser Gly Thr Val Leu His Phe Gly Cys Ile Thr Ile Ser Cys Pro

180 185 190

Arg Pro Ser Ile Leu Ala Tyr His Phe Lys Thr Ala Val Asp Cys Phe

195 200 205

Phe Ala Val Trp Phe Val Val Gly Asn Val Trp Ile Phe Gly Gly His

210 215 220

Ser Thr Leu Ser Asp Ser Gln Glu Ala Pro Asn Met Tyr Arg Leu Cys

225 230 235 240

Leu Ala Phe Leu Ala Leu Ser Cys Val Gly Tyr Ala Ile Pro Phe Val

245 250 255

Met Cys Ala Ala Ile Cys Cys Cys Phe Pro Cys Leu Ile Ser Leu Leu

260 265 270

Arg Leu Gln Glu Asp Leu Gly His Thr Arg Gly Ala Thr Gln Glu Leu

275 280 285

Ile Asp Ala Leu Pro Thr Tyr Lys Phe Lys Pro Lys Arg Ser Lys Met

290 295 300

Trp Val Asp His Ala Ser Ser Ser Glu Asn Leu Ser Glu Gly Gly Ile

305 310 315 320

Leu Gly Pro Gly Thr Lys Lys Glu Arg Ile Val Ser Ala Glu Asp Ala

325 330 335

Val Cys Cys Ile Cys Leu Thr Lys Tyr Gly Asp Asp Asp Glu Leu Arg

340 345 350

Glu Leu Pro Cys Thr His Phe Phe His Val Gln Cys Val Asp Lys Trp

355 360 365

Leu Lys Ile Asn Ala Val Cys Pro Leu Cys Lys Thr Glu Ile Gly Gly

370 375 380

Val Val Arg Ser Phe Phe Gly Leu Pro Phe Gly Arg Arg Arg Val Asp

385 390 395 400

Arg Met Ala Gly Arg Gly Ile Ala Ser Ser Arg Phe Thr Val

405 410

<210> 4

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 4

gtttgcgaca ttggagcctt c 21

<210> 5

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 5

aatgcttggg tatgctaggt gaa 23

<210> 6

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 6

tcctcggaga tgtttgacct tg 22

<210> 7

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 7

cagaaggtgt acgcaactct tgt 23

<210> 8

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 8

ccatccaaac acgccctaa 19

<210> 9

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 9

attgcccctt gctatggt 18

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 10

ttcgtggatg gagggagtac 20

<210> 11

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 11

rgcgtttgta ggagtgccac 20

Claims (21)

1.一种基因，该基因的多核苷酸序列为SEQ ID NO.1 所示的核苷酸序列的多核苷酸序列。

2.包含权利要求1所述的基因的载体。

3.一种宿主细胞，其特征在于所述的细胞包含权利要求1所述的基因，或者权利要求2所述的载体，其中所述宿主细胞不再生为植株。

4.权利要求3所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞为真核生物细胞。

5.权利要求3所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞为植物细胞和酵母细胞。

6.权利要求5所述的宿主细胞，其中所述植物细胞为禾本科植物细胞。

7.权利要求5所述的宿主细胞，其中所述植物细胞为水稻（Oryza sativa L.）细胞。

8.用于筛选、定位、分离权利要求1的核苷酸序列的分子标记，所述标记选自：

A）插入/缺失标记InDel5，该标记位于水稻第九染色体距短臂端9130-9150kb之间，所述标记的扩增产物具有长度多态性，所述标记的引物序列为InDel5F: 5′-TCCTCGGAGATGTTTGACCTTG-3′和InDel5R: 5′- CAGAAGGTG TACGCAACTCTTGT-3′；

B）SNP标记，简称RBsp1407，在感高温水稻和抗高温水稻植株中，基于SEQ ID NO:1所述多核苷酸序列，所述标记对应序列分别为TGT-3060ACA 和TGG-3060ACA;

C）微卫星DNA标记RM7364，该标记位于水稻第九染色体距短臂端9440-9450kb之间，所述标记经引物的扩增产物具有长度多态性，所述标记的引物序列为RM7364F: 5´-TTCGTGGATGGAGGGAGTAC-3´；和RM7364R: 5´-RGCGTTTGTAGGAGTGCCAC-3´。

9.权利要求8所述的标记在筛选、定位、分离抗/感高温基因中的应用，其中所述的高温为42℃或以上。

10.权利要求8所述的标记在筛选、定位、分离抗/感高温基因中的应用，其中所述的高温为45℃或以上。

11.权利要求8所述的标记在筛选、定位、分离抗/感高温基因中的应用，其中所述的高温为48℃或以上。

12.权利要求8所述的标记在筛选、定位、分离抗/感高温基因中的应用，其中所述的高温为50℃或以上。

13.植物育种方法，所述方法包含应用权利要求1所述的基因，或权利要求2所述的载体，或权利要求3-7任一项所述的宿主细胞，或权利要求8-12任一项所述的标记。

14.诱导水稻抗高温表型的方法，该方法包括通过遗传操作使不具备抗高温表型的水稻基因组第9号染色体中相应于SEQ ID NO：1第336位的5′端插入G，其中，所述的高温为42℃或以上。

15.权利要求14的方法，其中所述的高温为45℃或以上。

16.权利要求14的方法，其中所述的高温为48℃或以上。

17.权利要求14的方法，其中所述的高温为50℃或以上。

18.使温度敏感型水稻为抗高温型水稻的方法，该方法包括通过遗传操作使其温度敏感型水稻基因组第9号染色体中第336位的5′端上游插入一个G，使所得核苷酸序列与SEQID NO.1 所示的核苷酸序列中的第324到335位核苷酸相同，即自第335位起远离起始密码子方向序列包含连续的12个G，其中，所述的高温为42℃或以上。

19.权利要求18的方法，其中所述的高温为45℃或以上。

20.权利要求18的方法，其中所述的高温为48℃或以上。

21.权利要求18的方法，其中所述的高温为50℃或以上。

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