CN117050154B - 一种提高烟草抗高温、抗旱及耐盐胁迫性能的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及植物基因工程技术领域，尤其涉及一种提高烟草抗高温、抗旱及耐盐胁迫性能的方法。本发明提供了一种提高烟草抗高温、抗旱和/或耐盐胁迫性能的方法，提高NtMYB转录因子的表达，能够使得烟草抗逆境能力被调控，同时提高抗高温、抗旱和耐盐胁迫性能，能够改良现有烟草品种，使其遭遇高温、干旱、高盐等逆境时保持同样存活能力，保证产量不受影响，既能解决现有烟区稳产问题，又能在更多地区大面积种植烟草，为烟叶安全生产提供保障，对培育广适性烟草新品种具有重要价值。

Description

一种提高烟草抗高温、抗旱及耐盐胁迫性能的方法
技术领域
本发明涉及植物基因工程技术领域，尤其涉及一种提高烟草抗高温、抗旱及耐盐胁迫性能的方法。
背景技术
烟草是一种模式植物，也是重要的特殊经济作物，烟草除了制作卷烟外，其他应用价值也不容忽视，如烟草作为生物反应器的巨大优势以及烟草叶片中的生物活性物质在抗阿尔茨海默症、抗肿瘤、抗病毒等方面的显著疗效，这些功能的应用在医药行业有长足进展（杨彩艳等，2016）。所以，烟草向食品、保健品、医药、饮料、化妆品等行业发展，必将实现烟草种植业的可持续发展。科学界理应重视烟草相关研究，实现烟草资源利用价值最大化，兼具深远的科学、生产和社会意义。
随着全球变暖日益严重，极端高温干旱天气频发，作为我国重要经济作物的烟草种植环境愈加恶劣，遭遇高温、干旱、高盐等逆境胁迫。因此，如何提高烟草抗逆性如抗高温、抗旱、耐盐等成为本领域技术人员亟待解决的技术问题。
发明内容
为了克服现有技术的不足，本发明的目的之一在于提供一种提高烟草抗高温、抗旱和/或耐盐胁迫性能的方法，提高NtMYB转录因子的表达，能够使得烟草抗逆境能力被调控，同时提高抗高温、抗旱和耐盐胁迫性能，为适应恶劣气候条件提供基础；本发明的目的之二在于提供NtMYB转录因子的编码基因在提高烟草抗高温、抗旱和/或耐盐胁迫性能的应用，鉴定了NtMYB转录因子的编码基因在烟草抗逆性中的作用，使得采用基因工程对烟草抗逆性改良具有重要意义。
本发明的目的之一采用如下技术方案实现：
一种提高烟草抗高温、抗旱和/或耐盐胁迫性能的方法，提高烟草中NtMYB转录因子的表达。
优选的，所述NtMYB转录因子的氨基酸序列如Seq ID No.1所示；
和/或所述NtMYB转录因子的氨基酸序列与Seq ID No.1存在一个或几个氨基酸残基取代、缺失和/或添加。
进一步的，将所述NtMYB转录因子的编码基因转入烟草中；
所述编码基因的核苷酸序列如Seq ID No.2所示，和/或所述编码基因的核苷酸序列与Seq ID No.2具有90%以上同源性且编码所述NtMYB转录因子。
实验结果表明，通过CRISPR技术使NtMYB转录因子功能缺失会导致烟草对高温、干旱和盐胁迫敏感，过表达NtMYB转录因子则提高烟草对高温、干旱和盐胁迫的抗性，表明NtMYB转录因子在烟草抗高温、干旱和盐胁迫应答中具有重要作用。
优选的，所述编码基因通过表达盒、重组载体、转基因细胞系或重组菌导入烟草中。
优选的，在构建重组载体的过程中，在转录起始核苷酸前加上增强型、组成型、组织特异型和/或诱导型启动子，或去除终止密码子。
优选的，在构建重组载体的过程中，使用增强子。
优选的，在构建重组载体的过程中，加入在植物中表达可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因、具有抗性的抗生素标记物或抗化学试剂标记基因。
进一步的，提高烟草抗高温、抗旱和/或耐盐胁迫性能的方法包括：
将去除终止密码子的NtMYB转录因子编码区构建到表达载体pRI101-AN-eGFP上，获得重组载体pRI101-AN-eGFP-NtMYB；
用构建的重组载体pRI101-AN-eGFP-NtMYB转化农杆菌，然后利用转化的农杆菌介导转化烟草，获得转基因烟草植株。
更具体的，将NtMYB转录因子的编码区序列去除终止密码子，通过NdeⅠ和EcoRⅠ连接至植物表达载体pRI101-AN-eGFP构建重组载体pRI101-AN-eGFP-NtMYB，然后采用冻融法将pRI101-AN-eGFP-NtMYB重组质粒转化农杆菌LBA4404，运用叶盘转化法进行遗传转化，获得转基因烟草植株。
本发明的目的之二采用如下技术方案实现：
NtMYB转录因子的编码基因在提高烟草抗高温、抗旱和/或耐盐胁迫性能的应用。
优选的，所述编码基因的核苷酸序列如Seq ID No.2所示；
和/或所述编码基因的核苷酸序列与Seq ID No.2具有90%以上同源性且编码所述NtMYB转录因子。
优选的，所述编码基因通过表达盒、重组载体、转基因细胞系或重组菌导入烟草中。
相比现有技术，本发明的有益效果在于：
（1）本发明提高烟草抗高温、抗旱和/或耐盐胁迫性能的方法，提高NtMYB转录因子的表达，能够使得烟草抗逆境能力被调控，同时提高抗高温、抗旱和耐盐胁迫性能，为适应恶劣气候条件提供基础。
（2）本发明NtMYB转录因子的编码基因在提高烟草抗高温、抗旱和/或耐盐胁迫性能的应用，挖掘了烟草中与抗逆性如抗高温、抗旱和/或耐盐胁迫性能的基因，鉴定了NtMYB转录因子的编码基因在烟草抗逆性中的作用，使得采用基因工程对烟草抗逆性改良具有重要意义。NtMYB转录因子的编码基因在烟草中过表达后，能够改良现有烟草品种，使其遭遇高温、干旱、高盐等逆境时保持同样存活能力，稳定产量不受影响，既能解决现有烟区稳产问题，又能在更多地区大面积种植烟草，为烟叶安全生产提供保障。本发明对改良烟草对高温、干旱和盐胁迫的耐受性，培育广适性烟草新品种具有重要价值。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1为对比例1野生型K326烟草和实施例1超表达转基因株系（OE #8、#10和#11）烟草中NtMYB mRNA相对表达水平图；
图2为对比例2敲除转基因株系烟草的鉴定图；
图3为对比例1野生型烟草NtMYB响应高温胁迫的mRNA相对表达水平图；
图4为实施例1超表达转基因株系烟草、对比例1野生型烟草和对比例2敲除转基因株系烟草抗高温胁迫表型图；
图5为对比例1野生型烟草NtMYB响应干旱胁迫的mRNA相对表达水平图；
图6为实施例1超表达转基因株系烟草、对比例1野生型烟草和对比例2敲除转基因株系烟草抗干旱胁迫表型图；
图7为对比例1野生型烟草NtMYB响应盐胁迫的mRNA相对表达水平图；
图8为实施例1超表达转基因株系烟草、对比例1野生型烟草和对比例2敲除转基因株系烟草抗盐胁迫表型图。
具体实施方式
下面，结合具体实施方式，对本发明做进一步描述，需要说明的是，在不相冲突的前提下，以下描述的各实施例之间或各技术特征之间可以任意组合形成新的实施例。以下是本发明具体的实施例，在下述实施例中所采用的原材料、设备等除特殊限定外均可以通过购买方式获得。
实施例1
采用野生型烟草，即中国烟草主栽品种K326（Nicotiana tobacumL. cv. K326），进行NtMYB超表达株系（OE）的构建，具体步骤如下：
将NtMYB转录因子的编码区序列去除终止密码子，通过NdeⅠ和EcoRⅠ连接至植物表达载体pRI101-AN-eGFP（购自北京博迈德基因技术有限公司，货号CL499-01）构建重组载体pRI101-AN-eGFP-NtMYB，然后采用冻融法将pRI101-AN-eGFP-NtMYB重组质粒转化农杆菌LBA4404，运用叶盘转化法进行遗传转化。通过Kan配合PCR方法继续筛选，获得T2代稳定株系材料，挑选3个独立的超表达转基因株系（OE #8、#10和#11）进行后续实验。
测试超表达转基因株系烟草和野生型K326烟草中NtMYB的表达，结果见图1，图1为对比例1野生型K326烟草和实施例1超表达转基因株系（OE #8、#10和#11）烟草中NtMYBmRNA相对表达水平图。结果表明，较野生型K326烟草相比，超表达转基因株系（OE #8、#10和#11）烟草中NtMYB mRNA表达水平得到显著提高。
对比例1
野生型烟草，中国烟草主栽品种K326（Nicotiana tobacumL. cv. K326）。
对比例2
采用野生型烟草，即中国烟草主栽品种K326（Nicotiana tobacumL. cv. K326），通过CRISPR进行NtMYB敲除株系的构建，具体构建方法如下：
使用在线靶位点识别软件CRIPSR Multi Targeter（http://www.multicrispr.net/index.html），设计靶位点序列GATAATATGGACTTCAAAAG（SEQ IDNO.3），根据靶位点合成引物（CRISPR-F：GATTGATAATATGGACTTCAAAAG（SEQ ID NO.4），CRISPR-R：AAACCTTTTGAAGTCCATATTATC（SEQ ID NO.5））。敲除载体构建：单链Oligo DNA退火形成双链DNA，将合成的2条单链的引物稀释成50 μM，然后退火。
退火反应体系为50 µL：包括10 µL Annealing Buffer for DNA Oligos（5×），上下游引物各10 µL，ddH2O 20 µL。
退火反应在东胜（ETC-811）仪器上进行，反应条件为：95℃预变性2min，-0.1℃/8s，降至25℃，4℃保存。
表达载体的酶切：用BsaⅠ酶切表达载体pORE-Cas9/gRNA，酶切反应体系为50 µL：含5 µL 10×CutSmart buffer，1 µL BsaⅠ（NEB），30 µL载体质粒，14 µL ddH2O。酶切反应条件：37℃酶切1h后跑胶回收酶切产物。
靶位点连接到表达载体：体系为20 µL，包括5 µL线性化表达载体，2 µL退火的双链DNA，2 µL T4连接酶Buffer，1 µL T4连接酶，10 µL ddH2O。25℃连接3h。
转化感受态细胞，并对阳性克隆进行检测，测序验证正确后转化农杆菌LBA4404。运用叶盘转化法进行遗传转化。通过Kan抗性筛选配合PCR方法（正向引物CGTCTCATCTTTCTCTTTCTC（SEQ ID NO.6），反向引物CACATGAATAATCCAACATCG（SEQ IDNO.7）），以及测序验证后，获得稳定纯合株系材料，挑选2个独立的敲除转基因株系（CRISPR#7和#13）烟草进行后续实验，敲除转基因株系烟草的鉴定图如图2所示。
测试例1
待幼苗长到六叶期时，将约生长30 d的对比例1野生型烟草（K326烟苗）置于45℃热胁迫条件下，分别在0、3、6、12、24 h取样，每个时间点，取4个生物学重复，检测烟草植株中NtMYB的mRNA相对表达水平，结果如图3所示，发现NtMYB受到热胁迫显著诱导。
对实施例1超表达转基因株系（OE #8、#10和#11）烟草、对比例1野生型烟草和对比例2敲除转基因株系（CRISPR #7和#13）烟草进行热胁迫抗性的测试，待幼苗长到六叶期时，约生长30 d的烟苗进行热处理（45℃）24 h。热胁迫抗性测试的对照条件为正常种植条件（温度为28℃）下的实施例1超表达转基因株系（OE #8、#10和#11）烟草、对比例1野生型烟草和对比例2敲除转基因株系（CRISPR #7和#13）烟草。结果如图4所示，在正常种植条件下，实施例1超表达转基因株系烟草、对比例1野生型烟草和对比例2敲除转基因株系无明显差异。在热胁迫处理24 h后，与对比例1野生型烟草相比，实施例1超表达转基因株系烟草明显耐热胁迫，而对比例2敲除转基因株系烟草对高温更敏感。实验结果表明，NtMYB功能缺失会导致烟草对高温胁迫敏感，过表达NtMYB则能提高烟草的耐高温抗性，表明NtMYB在烟草抗高温胁迫应答中具有重要作用。
测试例2
待幼苗长到六叶期时，将约生长30 d的对比例1野生型烟草（K326烟苗）提前控水3d后，15%的PEG6000浇灌模拟干旱，分别在0、3、6、12、24 h取样，每个时间点，取4个生物学重复，检测烟草植株中NtMYB的mRNA相对表达水平，结果如图5所示，发现NtMYB受到干旱胁迫显著诱导。
对实施例1超表达转基因株系（OE #8、#10和#11）烟草、对比例1野生型烟草和对比例2敲除转基因株系（CRISPR #7和#13）烟草进行干旱胁迫抗性的测试，待幼苗长到六叶期时，约生长30 d的烟苗进行干旱处理14 d。干旱抗性测试的对照条件为正常种植条件（温度为28℃）、正常浇水下的实施例1超表达转基因株系（OE #8、#10和#11）烟草、对比例1野生型烟草和对比例2敲除转基因株系（CRISPR #7和#13）烟草。结果如图6所示，在正常种植条件下，实施例1超表达转基因株系烟草、对比例1野生型烟草和对比例2敲除转基因株系无明显差异。在干旱胁迫条件下，与对比例1野生型烟草相比，实施例1超表达转基因株系烟草明显耐干旱胁迫，而对比例2敲除转基因株系烟草对干旱更敏感。实验结果表明，NtMYB功能缺失会导致烟草对干旱胁迫敏感，过表达NtMYB则能提高烟草的耐干旱抗性，表明NtMYB在烟草抗干旱胁迫应答中具有重要作用。
测试例3
待幼苗长到六叶期时，将约生长30 d的对比例1野生型烟草（K326烟苗）提前控水3d后，300 mM的NaCl浇灌模拟盐胁迫，分别在0、3、6、12、24 h取样，每个时间点，取4个生物学重复，检测烟草植株中NtMYB的mRNA相对表达水平，结果如图7所示，发现NtMYB受到盐胁迫显著诱导。
对实施例1超表达转基因株系（OE #8、#10和#11）烟草、对比例1野生型烟草和对比例2敲除转基因株系（CRISPR #7和#13）烟草进行盐胁迫抗性的测试，待幼苗长到六叶期时，约生长30 d的烟苗进行盐处理20 d。盐抗性测试的对照条件为正常种植条件（温度为28℃）、正常浇水下的实施例1超表达转基因株系（OE #8、#10和#11）烟草、对比例1野生型烟草和对比例2敲除转基因株系（CRISPR #7和#13）烟草。结果如图8所示，在正常种植条件下，实施例1超表达转基因株系烟草、对比例1野生型烟草和对比例2敲除转基因株系无明显差异。在盐胁迫条件下，与对比例1野生型烟草相比，实施例1超表达转基因株系烟草明显耐盐胁迫，而对比例2敲除转基因株系烟草对盐胁迫更敏感。实验结果表明，NtMYB功能缺失会导致烟草对盐胁迫敏感，过表达NtMYB则能提高烟草的耐盐抗性，表明NtMYB在烟草抗盐胁迫应答中具有重要作用。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (7)

1.一种提高烟草抗高温、抗旱和耐盐胁迫性能的方法，其特征在于，提高烟草中NtMYB转录因子的表达；
所述NtMYB转录因子的氨基酸序列如Seq ID No.1所示。
2.根据权利要求1所述的提高烟草抗高温、抗旱和耐盐胁迫性能的方法，其特征在于，将所述NtMYB转录因子的编码基因转入烟草中；
所述编码基因的核苷酸序列如Seq ID No.2所示。
3.根据权利要求2所述的提高烟草抗高温、抗旱和耐盐胁迫性能的方法，其特征在于，所述编码基因通过表达盒、重组载体、转基因细胞系或重组菌导入烟草中。
4.根据权利要求3所述的提高烟草抗高温、抗旱和耐盐胁迫性能的方法，其特征在于，在构建重组载体的过程中，在转录起始核苷酸前加上组成型、组织特异型或诱导型启动子，或去除终止密码子。
5.根据权利要求3所述的提高烟草抗高温、抗旱和耐盐胁迫性能的方法，其特征在于，在构建重组载体的过程中，使用增强子。
6.根据权利要求3所述的提高烟草抗高温、抗旱和耐盐胁迫性能的方法，其特征在于，在构建重组载体的过程中，加入在植物中表达可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因、具有抗性的抗生素标记物或抗化学试剂标记基因。
7.NtMYB转录因子的编码基因在提高烟草抗高温、抗旱和耐盐胁迫性能的应用；
所述编码基因的核苷酸序列如Seq ID No.2所示；
所述编码基因通过表达盒、重组载体、转基因细胞系或重组菌导入烟草中。
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