CN113549632A - 水稻OsFLZ2基因在调控禾本科植物抽穗期中的应用 - Google Patents
水稻OsFLZ2基因在调控禾本科植物抽穗期中的应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种水稻OsFLZ2基因在调控禾本科植物抽穗期中的应用，所述水稻OsFLZ2基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；编码的氨基酸序列为SEQ ID No.2所示。本发明的发明人首次证明了水稻基因OsFLZ2在调控水稻抽穗期中的功能，构建的过表达OsFLZ2基因的载体转化植株出现晚花的表型；敲除OsFLZ2基因的载体转化植株则表现出早花的现象。该基因有望应用于水稻遗传工程育种，为水稻不同抽穗期新种质的创制或改良提供理论基础。
Description
技术领域
本发明属于作物遗传育种技术领域，更具体地，本发明涉及一种水稻OsFLZ2基因在调控禾本科植物抽穗期中的应用。
背景技术
水稻抽穗期(开花)决定着水稻的分布和区域适应性。水稻的抽穗期标志着其从营养生长转变为生殖生长。为了获得最大的生殖生长量，水稻会通过感知光周期和温度等环境因子在最适宜的时期开花。晚抽穗使得水稻营养生长期增长，有利于种子中干物质的积累，但是过晚抽穗会由于外界环境的变化(如错过开花的最适合温度)导致种子成熟度降低或者减产；早抽穗则会使得水稻营养积累不充分，最终也会造成减产。所以，适宜的抽穗期对于保障水稻高产稳产至关重要。
水稻是一种短日照植物，短日条件下促进开花，长日条件下延迟开花。我国水稻种植面积辽阔，南北气候差异大，南北水稻品种差异显著，不同的品种只能在特定的地区种植，所以选育弱感光或非感光型的品种对于突破地域限制有着重要意义。水稻抽穗期基因发掘和克隆研究有助于阐明水稻抽穗期的遗传基础，同时为弱感光或非感光型品种的选育、品种改良提供指导。
发明内容
基于此，本发明的目的之一在于提供水稻OsFLZ2基因在调控禾本科植物抽穗期中的应用。
实现上述发明目的的具体技术方案如下：
一种水稻OsFLZ2基因在调控禾本科植物抽穗期中的应用，所述水稻OsFLZ2基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；或为与SEQ ID No.1完全互补配对的序列；或为如SEQ IDNo.1所示的核苷酸序列经取代、缺失和/或添加一个或多个核苷酸，且能编码相同功能蛋白质的核苷酸序列；或为编码氨基酸序列为SEQ ID No.2所示的核苷酸序列。
在其中一些实施例中，所述禾本科植物为水稻。
本发明的另一目的在于提供一种水稻OsFLZ2基因的表达蛋白在调控禾本科植物抽穗期中的应用。
实现上述发明目的的具体技术方案如下：
一种水稻OsFLZ2基因的表达蛋白在调控禾本科植物抽穗期中的应用，所述水稻OsFLZ2基因的表达蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示；或如SEQ ID No.2所示的氨基酸序列经取代、缺失和/或添加一个或多个氨基酸，但蛋白活性相同。
在其中一些实施例中，所述禾本科植物为水稻。
本发明的另一目的是提供一种水稻OsFLZ2基因重组表达载体。
实现上述发明目的的具体技术方案如下：
一种水稻OsFLZ2基因重组表达载体在调控禾本科植物抽穗期中的应用，所述重组表达载体上插入有上述水稻OsFLZ2基因，或插入有表达上述水稻OsFLZ2基因的表达蛋白的基因。
在其中一些实施例中，所述重组表达载体是利用含有Ubiquitin启动子和GFP标签的pCAMBIA1300-GFP构建而得。
本发明还提供了水稻OsFLZ2基因敲除载体在调控禾本科植物抽穗期中的应用，所述水稻OsFLZ2基因敲除载体是利用Crispr-Cas9编辑技术构建而得。
在其中一些实施例中，所述Crispr作用于水稻OsFLZ2基因的靶位点的核苷酸序列如SEQ ID No.5和SEQ ID No.6所示。
本发明还提供了一种调控禾本科植物抽穗期的方法，该方法包括：调控水稻OsFLZ2基因在禾本科植物中的表达。
在其中一些实施例中，所述禾本科植物是水稻。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
1、本发明的发明人首次证明了水稻基因OsFLZ2在调控水稻抽穗期中的功能，该基因的克隆和生物学功能验证对于水稻抽穗期遗传网络的解析有重要的参考意义；
2.本发明利用Ubiquitin启动子构建了过表达OsFLZ2基因的载体，利用Crispr-Cas9编辑技术构建了敲除OsFLZ2基因的载体，过表达载体转化水稻后能大幅提高OsFLZ2的表达量，转化植株出现晚花的表型；但是，敲除载体转化水稻后的植株则表现出早花的现象。因此，该基因有望应用于水稻遗传工程育种，为水稻不同抽穗期新种质的创制或改良提供理论基础。
附图说明
图1为本发明实施例1中线性化处理的pCAMBIA1300-GFP载体图谱；
图2为本发明实施例2中使用qRT-PCR检测过表达植株中OsFLZ2基因的表达量结果；
图3为本发明实施例2中基于Crispr-Cas9系统构建的敲除OsFLZ2基因的转基因植株DNA序列突变分析；
图4为本发明实施例3中短日照条件下(广州8-11月)过表达和敲除目的基因OsFLZ2的转基因植株和Nip植株的表型分析结果图；
图5为本发明实施例3中过表达和敲除目的基因OsFLZ2的转基因植株和Nip植株抽穗时间统计结果；
图6为本发明实施例4中过表达和敲除目的基因OsFLZ2的转基因材料中开花期关键基因的表达量检测；
图7为本发明实施例4中OsFLZ2和OsMADS51互作并存在共定位，其中A、Pull-down结果表明OsFLZ2和OsMADS51互作；B、CoIP结果表明OsFLZ2和OsMADS51互作；C、OsFLZ2和OsMADS51蛋白共定位检测。
具体实施方式
为了便于理解本发明，下面将对本发明进行更全面的描述。本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明公开内容的理解更加透彻全面。
下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(NewYork:Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所用到的各种常用化学试剂，均为市售产品。
除非另有定义，本发明所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不用于限制本发明。本发明所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
本发明所述的水稻基因OsFLZ2的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，其表达蛋白编码的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。
SEQ ID No.1
ATGGCAGCTGAATCCTCCCTGGTTCCACAAACCTCCTCTGAATCGATTGCGCAGAAGATGGGCTTCTTCAGGGTCCCTGACCTTCTTGTCAAACTGAGCAGCAAATGTTTGATTGAGCTGGATGCAGTCCGCAGCCCAACATCGCCCCTAGACCTCATATTCTTCCCAGGCCTCGGTGCCAAATCGCCGAGGTCGTCTTTCCTTGGCGACAGGGTTGGGCTTGGACTGGTGGATTCACTTACTGATGATAGCTCCACTCCCTTGGGCAGCAGGAAGGTTCTTCTTGGATCTGAGATGAGGATTACTGATAATGTAACTTCCAAGAACAGCTTCACTGCTCCTGTCGAAGCTGGGGTGGTTGATCAGAAGGATGAGAGTATGTGTGATGACCTGAAGGGTAGTTTCATGTCTCTGGATGACATTGTCAATTCAGAGGATTACACCCGTGTTGTTTGTCGTGGTCCTAACCCTAGGACAACCCACTTCTTTGGAGATCATGTTTTAGAATTTGAAGGTGAGCAGCTGATGCCTGATGAGAGTAAGAGTGAGGAGAGTTTGCCCCCTCGTCTGGAAGAGGGTATGATGAGCTTCTGTTATTTTTGCGGTGAGAAACTCGAAGAAGGGAAAGACATCTACGTCTATCAGGGTGACAAAGCCTTTTGCAGCATGGAGTGCCGGGAGAATTTCATGGAAGATGAGATGGAAGAAGGCGAACCCGATCTCTCTGCACCTCCTAGCAGCCCAGTCGCCAACGATGGTTGTATTTTCCAACTGATCCAGTGA
SEQ ID No.2
MAAESSLVPQTSSESIAQKMGFFRVPDLLVKLSSKCLIELDAVRSPTSPLDLIFFPGLGAKSPRSSFLGDRVGLGLVDSLTDDSSTPLGSRKVLLGSEMRITDNVTSKNSFTAPVEAGVVDQKDESMCDDLKGSFMSLDDIVNSEDYTRVVCRGPNPRTTHFFGDHVLEFEGEQLMPDESKSEESLPPRLEEGMMSFCYFCGEKLEEGKDIYVYQGDKAFCSMECRENFMEDEMEEGEPDLSAPPSSPVANDGCIFQLIQ
应理解，考虑到密码子的简并性及不同物种密码子的偏爱性，在不改变氨基酸序列的前提下，对本发明的编码基因的核苷酸序列进行修改，也属于本发明的保护范围内。
以下结合具体实施例对本发明作进一步详细的说明。
实施例1水稻基因OsFLZ2的过量表达和敲除载体的构建
1、OsFLZ2基因过量表达载体的构建
取种植于广东省农业科学院水稻研究所的日本晴幼穗，并使用植物RNA提取试剂盒(Magen公司)提取总RNA，然后进行目的基因的扩增，具体实验如下：取1μg高质量(OD260/280：1.8-2.0；OD260/230≈2.0)的RNA进行反转录(TAKARA公司的反转录试剂盒)获得cDNA。以cDNA为模板，使用KOD FX(ToYoBo公司)进行PCR扩增。反应体系为：2×PCRbuffer 25μL,2mM dNTPs 10μL，F引物(5’-GATTAACAGGGATCCCCCATGGCAGCTGAATCCTCCCT-3’，SEQ IDNo.3)0.5μL，R引物(5’-GAGACTAGTGGTACCCCCCTGGATCAGTTG GAAAATAC-3’,SEQ ID No.4)0.5μL，cDNA模板1μL，KOD FX(1U/μl)1μL，加水补足至50μL。反应条件为：98℃5min；98℃30sec，60℃30sec，68℃30sec，35个循环；68℃10min。反应结束后，收集PCR产物。
用限制性内切酶SmaⅠ(TAKARA公司)对pCAMBIA1300-GFP载体(由pCAMBIA1300载体改造而来，含有玉米Ubiquitin启动子和GFP标签，载体图谱如图1所示)进行线性化处理，酶切体系为：载体3μg，SmaI内切酶3μL，10×T Buffer 10μL，10×BSA 10μL，补足水至100μL。酶切条件为：30℃，3小时。载体酶切产物和PCR产物经过纯化回收后，使用重组试剂盒(诺唯赞公司)进行重组，重组体系为：目的片段：1.5μL，载体片段：4.5μL，5×buffer 2μL，ExnaseII 1μL，加水补足至10μL。重组条件为：37℃，30min。取全部产物，加入到100μL大肠杆菌DH5α感受态中，转化产物涂布于LB固体培养基(含有卡那霉素抗性，卡那霉素的浓度为50mg/L)。37℃培养过夜，挑5个单克隆进行菌落PCR鉴定。选择2个阳性克隆进行测序，得到含有OsFLZ2基因序列的阳性克隆，最终获得含有OsFLZ2目的基因的过量表达载体。
2、OsFLZ2基因Crispr载体的构建
根据OsFLZ2的基因序列，通过网站(http://skl.scau.edu.cn/)设计Crispr的靶点和引物，选择的两个靶点分别为：
靶点1：5’-TGCTCCTGTCGAAGCTGGGG-3’；(SEQ ID No.5)
靶点2：5’-AGCAGCCCAGTCGCCAACGA-3’；(SEQ ID No.6)
设计的引物为：
OsFLZ2-6aF:TGCTCCTGTCGAAGCTGGGGgttttagagctagaaat(SEQ ID No.7)
OsFLZ2-6aR:CCCCAGCTTCGACAGGAGCACggcagccaagccagca(SEQ ID No.8)
OsFLZ2-6bF:AGCAGCCCAGTCGCCAACGAgttttagagctagaaat(SEQ ID No.9)
OsFLZ2-6bR:TCGTTGGCGACTGGGCTGCTCaacacaagcggcagc(SEQ ID No.10)
U-F:CTCCGTTTTACCTGTGGAATCG(SEQ ID No.11)
gR-R:CGGAGGAAAATTCCATCCAC(SEQ ID No.12)
Pps-GGL:TTCAGAggtctcTctcgACTAGTATGGAATCGGCAGCAAAGG(SEQ ID No.13)
Pgs-GG2:AGCGTGggtctcGtcagggTCCATCCACTCCAAGCTC(SEQ ID No.14)
Pps-GG2:TTCAGAggtctcTctgacacTGGAATCGGCAGCAAAGG(SEQ ID No.15)
Pgs-GGR:AGCGTGggtctcGaccgACGCGTATCCATCCACTCCAAGCTC(SEQ ID No.16)
以OsU6a(A robust CRISPR/Cas9 system for convenient,highefficiencymultiplex genome editing in monocot and dicot plants；Ma XL,Zhang QY,Zhu QL,etal.,MolecularPlant,2015,8:1274–1284.)为模板，用引物U-F(SEQ ID No.11)，OsFLZ2-6aF(SEQ ID No.7)，OsFLZ2-6aR(SEQ ID No.8)，gR-R(SEQ ID No.12)进行PCR扩增，得到靶点1的PCR产物。以OsU6b为模板，用引物U-F(SEQ ID No.11)，OsFLZ2-6bF(SEQ ID No.9)，OsFLZ2-6bR(SEQ ID No.10)，gR-R(SEQ ID No.12)进行PCR扩增，得到靶点2的PCR产物。PCR程序为：95℃，2min；94℃20s，60℃20S，68℃25S，25-28循环，68℃10min。将上述得到的PCR产物分别稀释10倍，进行下一轮PCR扩增。
以上述稀释后的靶点1的PCR产物为模板，使用引物Pps-GGL(SEQ ID No.13)，Pgs-GG2(SEQ ID No.14)进行第二轮PCR扩增。以稀释后的靶点2的PCR产物为模板，使用引物Pps-GG2(SEQ ID No.15)，Pgs-GGR(SEQ ID No.16)进行第二轮PCR扩增。PCR程序为：95℃，2min；95℃20s，60℃20S，68℃25S，20循环，68℃10min。将上述获得的第二轮PCR产物纯化回收后，进行连接转化。连接体系为：10×Cutbuffer 1.5μL,10×T4 buffer 1μL,BsaI-HF(NEB公司)0.5μL,T4连接酶(NEB公司)0.25μL,Cas9表达盒60-80ng,靶点1的终产物10-15ng，靶点2的终产物10-15ng，加水补足至15μL。酶切连接的程序为：37℃，5min；10℃5min，20℃5min，10-15循环，37℃5min。
取全部产物，加入到100μL大肠杆菌DH5α感受态中，转化产物涂布于LB固体培养基(含有卡那霉素抗性，卡那霉素的浓度为50mg/L)。37℃培养过夜，挑5个单克隆进行提取质粒，送至上海生工生物有限公司进行测序比对。最终获得敲除目的基因OsFLZ2的重组载体。
实施例2过量表达OsFLZ2基因和敲除OsFLZ2基因的转基因苗的获得和鉴定
采用农杆菌EHA105介导的遗传转化方法，将实施例1中构建的过量表达目的基因OsFLZ2的载体和敲除目的基因OsFLZ2的载体分别转入粳稻品种日本晴中。经过选择培养、分化、生根、炼苗得到T0代转基因苗。实验方法参考文献：农杆菌介导的高效水稻遗传转化体系的研究；郑杰；湖南农业科学，2008年，第2期。
1、过量表达OsFLZ2基因的转基因苗的获得和鉴定
对所有的转基因苗进行PCR鉴定，扩增Ubiquitin载体片段，将20株阳性的转基因苗进行繁种得到T1代、T2代。将T2代种子使用含有潮霉素的培养基发芽，如果种子能全部正常生长，则证明该株系为纯合株。挑选2个纯合的转基因株系(OE2、OE7)进行qRT-RCR检测，并进行后续试验及分析。
其中qRT-RCR鉴定目的基因OsFLZ2在转基因植株中过表达效果过程如下：
1、植物RNA提取试剂盒(Magen公司)提取四叶期的水稻叶片总RNA，取1μg高质量(OD260/280：1.8-2.0；OD260/230≈2.0)的RNA进行反转录(TAKARA公司的反转录试剂盒)获得cDNA。
2、以上述步骤1中的cDNA为模板，通过OsFLZ2-qF(ATGGCAGCTGAATCCTCCCT，SEQ IDNo.17)和OsFLZ2-qR(GCATCCAGCTCAATCAAACA,SEQ ID No.18)引物对检测OsFLZ2基因的表达情况，并采用水稻管家基因EF1α基因的EF1αF(TTTCACTCTTGGTGTGAAGCAGAT，SEQ IDNo.19)和EF1αR(GACTTCCTTCACGATTTCATCGTAA，SEQ ID No.20)引物对检测水稻EF1α基因的表达作为内参，定量PCR试剂为
Premix Ex TaqTM(TAKARA公司)，定量PCR仪器为CFX 96(Bio RAD公司)。反应体系为：2×PCRbuffer 5μL，OsFLZ2-qF引物0.4μL，OsFLZ2-qR引物0.4μL，cDNA模板1μL，灭菌水3.2μL，反应体系总体积10μL。反应程序：95℃30s；95℃5sec,68℃30sec，45个循环。
结果如图2所示，挑选的2个株系(OE2、OE7)中OsFLZ2基因的表达量均有大幅度提高，后续选择这2个过表达株系进行实验。
2、敲除OsFLZ2基因的转基因苗的获得和鉴定
对获得的敲除转基因材料进行PCR扩增(F：TTTCTTGATACTGACACTAG,SEQ IDNo.21；R:GCAAACACAAATTCAAACTC，SEQ ID No.22)，PCR产物送至上海生工生物有限公司进行测序，并和野生型基因组DNA进行比对，最后得到编辑突变的转基因苗。将转基因苗进行扩繁，最终得到纯合突变的转基因材料。挑选2个纯合的转基因株系进行表型鉴定。
Crispr敲除植株靶点测序结果见图3，其中，Nip表示对照基因组(日本晴)DNA序列。Crispr-4和Crispr-11为纯合的敲除植株。黑色下划线表示PAM位点，碱基上的“-”表示缺失序列。
实施例3过表达OsFLZ2基因和敲除OsFLZ2基因的植株花期表型分析
将实施例2获得的纯合的过量表达OsFLZ2基因和敲除OsFLZ2基因的植株种子打破休眠，催芽，播种，然后将3周大的幼苗转移至蓝色的盆里，连续观察并记录表型差异。水稻苗种植在广东省农业科学院水稻研究所，种植的时间为广州8月-11月，此时广州的天气属于天然的短日照。
表型结果见图4。其中Nip表示日本晴；OE-2、OE-7表示过表达目的基因OsFLZ2的转基因植株；Crispr-4,Crispr-11表示敲除目的基因OsFLZ2的转基因植株。38天苗龄的OE-2、OE-7植株些许矮化，44天苗龄的Crispr-4,Crispr-11植株抽穗，此时日本晴和OE-2、OE-7植株没有抽穗，49天苗龄的日本晴植株也陆续抽穗，但是OE-2、OE-7植株仍然没有抽穗，55天苗龄的OE-2、OE-7植株开始抽穗，而此时的Crispr-4,Crispr-11植株和日本晴植株已经灌浆。结果表明：敲除目的基因OsFLZ2的转基因植株(Crispr-4,Crispr-11)早花，而过表达目的基因OsFLZ2的转基因植株(OE-2、OE-7)明显晚花。
开花时间统计结果见图5。其中Nip表示日本晴；OE-2、OE-7表示过表达目的基因OsFLZ2的转基因植株；Crispr-4,Crispr-11表示敲除目的基因OsFLZ2的转基因植株。结果表明：Nip植株的抽穗时间为47.5±1.0天，而敲除目的基因OsFLZ2的转基因植株(Crispr-4,Crispr-11)的抽穗时间分别为44.2±0.8天和44.3±0.8天，明显早花；过表达目的基因OsFLZ2的转基因植株(OE-2、OE-7)的抽穗时间分别为53.9±1.5天和53.5±1.5天，明显晚花。
实施例4OsFLZ2基因调控水稻抽穗期的分子机制
为了进一步研究OsFLZ2调控水稻抽穗的分子机理，发明人将过表达目的基因OsFLZ2的转基因种子消毒，播种，然后放置在光照培养箱中(10h光照，28℃/14h黑暗，26℃)2周，收集2周的叶片进行RNA提取，并使用qRT-pCR检测调控水稻开花相关基因的表达量。
结果如图6所示，其中，白色和黑色矩形分别表示24h内的光照和黑暗时段。在连续24h的取样周期(ZT0、ZT4、ZT8、ZT12、ZT16、ZT20、ZT24)内，Hd1，RFT1，Ehd1，Hd3a等调控水稻开花的重要基因都发生明显的变化，且在OE(过表达植株)，Crispr(基因敲除植株)，Nip中的变化趋势有明显差异。这些基因的变化，可能导致OE，Crispr植株的抽穗时间发生改变。
除此之外，进一步通过蛋白互作筛选挖掘和OsFLZ2互作的因子，结果发现OsFLZ2和调控水稻开花的重要转录因子OsMADS51存在互作。如图7所示，当用空GST和MADS51-His进行pull-down(Zong W,et al,Feedback Regulation of ABA Signaling andBiosynthesis by a bZIP Transcription Factor Targets Drought-Resistance-Related Genes.Plant Physiology,2016,171:2810-2825)实验时，无法检测出MADS51-His的目的条带，但是OsFLZ2-GST和MADS51-His组合则可以检测到MADS51-His的目的条带，表明OsFLZ2和MADS51蛋白互作(图7A)。
进一步使用CoIP(Chai et al.,OsRE1 interacts with OsRIP1 to regulaterice heading date by finely modulating Ehd1 expression.Plant BiotechnologyJournal,2020,19(2):300-310)实验对该互作进行确认，结果发现：当用空GFP和MADS51-His转化烟草时，无法检测出MADS51-6HA的目的条带，只有OsFLZ2-GFP和MADS51-6HA共同转化烟草后才检测到MADS51-6HA的目的条带，表明OsFLZ2和MADS51确实存在互作(图7B)。
除此之外，还进行了FLZ2和MADS51的蛋白共定位检测实验(Yang C,etal.Characterization and subcellular localization of histone deacetylases andtheir roles in response to abiotic stresses in soybean.BMC Plant Biology,2018,18:226.)，OsFLZ2-GFP单独存在时呈现出绿光，MADS51-mCherry单独存在时显示为红光，如果OsFLZ2-GFP和MADS51-mCherry存在共定位则会重叠成黄色的光，检测结果如图7C所示，OsFLZ2-GFP和MADS51-mCherry可以重叠激发出黄色的光，表明OsFLZ2和MADS51蛋白存在共定位。
以上结果表明，OsFLZ2可能通过与调控水稻开花的重要转录因子OsMADS51互作共同调控水稻抽穗期。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
序列表
<110> 广东省农业科学院水稻研究所
<120> 水稻OsFLZ2基因在调控禾本科植物抽穗期中的应用
<130> 1
<160> 22
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 783
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
atggcagctg aatcctccct ggttccacaa acctcctctg aatcgattgc gcagaagatg 60
ggcttcttca gggtccctga ccttcttgtc aaactgagca gcaaatgttt gattgagctg 120
gatgcagtcc gcagcccaac atcgccccta gacctcatat tcttcccagg cctcggtgcc 180
aaatcgccga ggtcgtcttt ccttggcgac agggttgggc ttggactggt ggattcactt 240
actgatgata gctccactcc cttgggcagc aggaaggttc ttcttggatc tgagatgagg 300
attactgata atgtaacttc caagaacagc ttcactgctc ctgtcgaagc tggggtggtt 360
gatcagaagg atgagagtat gtgtgatgac ctgaagggta gtttcatgtc tctggatgac 420
attgtcaatt cagaggatta cacccgtgtt gtttgtcgtg gtcctaaccc taggacaacc 480
cacttctttg gagatcatgt tttagaattt gaaggtgagc agctgatgcc tgatgagagt 540
aagagtgagg agagtttgcc ccctcgtctg gaagagggta tgatgagctt ctgttatttt 600
tgcggtgaga aactcgaaga agggaaagac atctacgtct atcagggtga caaagccttt 660
tgcagcatgg agtgccggga gaatttcatg gaagatgaga tggaagaagg cgaacccgat 720
ctctctgcac ctcctagcag cccagtcgcc aacgatggtt gtattttcca actgatccag 780
tga 783
<210> 2
<211> 260
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Met Ala Ala Glu Ser Ser Leu Val Pro Gln Thr Ser Ser Glu Ser Ile
1 5 10 15
Ala Gln Lys Met Gly Phe Phe Arg Val Pro Asp Leu Leu Val Lys Leu
20 25 30
Ser Ser Lys Cys Leu Ile Glu Leu Asp Ala Val Arg Ser Pro Thr Ser
35 40 45
Pro Leu Asp Leu Ile Phe Phe Pro Gly Leu Gly Ala Lys Ser Pro Arg
50 55 60
Ser Ser Phe Leu Gly Asp Arg Val Gly Leu Gly Leu Val Asp Ser Leu
65 70 75 80
Thr Asp Asp Ser Ser Thr Pro Leu Gly Ser Arg Lys Val Leu Leu Gly
85 90 95
Ser Glu Met Arg Ile Thr Asp Asn Val Thr Ser Lys Asn Ser Phe Thr
100 105 110
Ala Pro Val Glu Ala Gly Val Val Asp Gln Lys Asp Glu Ser Met Cys
115 120 125
Asp Asp Leu Lys Gly Ser Phe Met Ser Leu Asp Asp Ile Val Asn Ser
130 135 140
Glu Asp Tyr Thr Arg Val Val Cys Arg Gly Pro Asn Pro Arg Thr Thr
145 150 155 160
His Phe Phe Gly Asp His Val Leu Glu Phe Glu Gly Glu Gln Leu Met
165 170 175
Pro Asp Glu Ser Lys Ser Glu Glu Ser Leu Pro Pro Arg Leu Glu Glu
180 185 190
Gly Met Met Ser Phe Cys Tyr Phe Cys Gly Glu Lys Leu Glu Glu Gly
195 200 205
Lys Asp Ile Tyr Val Tyr Gln Gly Asp Lys Ala Phe Cys Ser Met Glu
210 215 220
Cys Arg Glu Asn Phe Met Glu Asp Glu Met Glu Glu Gly Glu Pro Asp
225 230 235 240
Leu Ser Ala Pro Pro Ser Ser Pro Val Ala Asn Asp Gly Cys Ile Phe
245 250 255
Gln Leu Ile Gln
260
<210> 3
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
gattaacagg gatcccccat ggcagctgaa tcctccct 38
<210> 4
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
gagactagtg gtacccccct ggatcagttg gaaaatac 38
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
tgctcctgtc gaagctgggg 20
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
agcagcccag tcgccaacga 20
<210> 7
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
tgctcctgtc gaagctgggg gttttagagc tagaaat 37
<210> 8
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
ccccagcttc gacaggagca cggcagccaa gccagca 37
<210> 9
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
agcagcccag tcgccaacga gttttagagc tagaaat 37
<210> 10
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
tcgttggcga ctgggctgct caacacaagc ggcagc 36
<210> 11
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
ctccgtttta cctgtggaat cg 22
<210> 12
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
cggaggaaaa ttccatccac 20
<210> 13
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
ttcagaggtc tctctcgact agtatggaat cggcagcaaa gg 42
<210> 14
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
agcgtgggtc tcgtcagggt ccatccactc caagctc 37
<210> 15
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
ttcagaggtc tctctgacac tggaatcggc agcaaagg 38
<210> 16
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
agcgtgggtc tcgaccgacg cgtatccatc cactccaagc tc 42
<210> 17
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
atggcagctg aatcctccct 20
<210> 18
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
gcatccagct caatcaaaca 20
<210> 19
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
tttcactctt ggtgtgaagc agat 24
<210> 20
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
gacttccttc acgatttcat cgtaa 25
<210> 21
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
tttcttgata ctgacactag 20
<210> 22
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 22
gcaaacacaa attcaaactc 20
Claims (10)
1.一种水稻OsFLZ2基因在调控禾本科植物抽穗期中的应用，其特征在于，所述水稻OsFLZ2基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；或为与SEQ ID No.1完全互补配对的序列；或为如SEQ ID No.1所示的核苷酸序列经取代、缺失和/或添加一个或多个核苷酸，且能编码相同功能蛋白质的核苷酸序列；或为编码氨基酸序列为SEQ ID No.2所示的核苷酸序列。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述禾本科植物为水稻。
3.一种水稻OsFLZ2基因的表达蛋白在调控禾本科植物抽穗期中的应用，其特征在于，所述水稻OsFLZ2基因的表达蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示；或如SEQ ID No.2所示的氨基酸序列经取代、缺失和/或添加一个或多个氨基酸，但蛋白活性相同。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述禾本科植物为水稻。
5.一种水稻OsFLZ2基因的重组表达载体在调控禾本科植物抽穗期中的应用，其特征在于，所述重组表达载体上插入有权利要求1或2所述的水稻OsFLZ2基因；或插入有表达权利要求3或4所述的水稻OsFLZ2基因的表达蛋白的基因。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述重组表达载体是利用含有Ubiquitin启动子和GFP标签的pCAMBIA1300-GFP构建而得。
7.根据权利要求5或6所述的应用，其特征在于，所述禾本科植物为水稻。
8.一种水稻OsFLZ2基因敲除载体在调控禾本科植物抽穗期中的应用，其特征在于，所述水稻OsFLZ2基因敲除载体是利用Crispr-Cas9编辑技术构建而得。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述Crispr作用于核苷酸序列如SEQ IDNo.5和SEQ ID No.6所示的靶位点。
10.根据权利要求8或9所述的应用，其特征在于，所述禾本科植物为水稻。
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Application publication date: 20211026 Assignee: Guangdong Yueliang Seed Industry Co.,Ltd. Assignor: RICE Research Institute GUANGDONG ACADEMY OF AGRICULTURAL SCIENCES Contract record no.: X2023980047921 Denomination of invention: The application of rice OsFLZ2 gene in regulating the heading period of Poaceae plants Granted publication date: 20220304 License type: Common License Record date: 20231122 |