CN107400672A

CN107400672A - OsCOL15基因在调控水稻抽穗期中的应用

Info

Publication number: CN107400672A
Application number: CN201710837761.6A
Authority: CN
Inventors: 曹立勇; 吴玮勋; 程式华; 张迎信; 占小登; 沈希宏; 于萍; 陈代波; 刘群恩
Original assignee: China National Rice Research Institute
Current assignee: China National Rice Research Institute
Priority date: 2017-09-15
Filing date: 2017-09-15
Publication date: 2017-11-28
Anticipated expiration: 2037-09-15
Also published as: CN107400672B

Abstract

本发明涉及OsCOL15基因在调控水稻抽穗期中的应用，OsCOL15基因的序列来自水稻品种日本晴，其cDNA序列如SEQ ID NO：1所示，该基因编码一个具有488个氨基酸的B‑box/CCT锌指蛋白，属于CONSTANS‑like转录因子基因家族。研究发现OsCOL15定位在细胞核中并具有转录自激活活性，并且OsCOL15基因具有节律表达模式。通过遗传转化实验，证明过表达OsCOL15基因在短日照和长日照条件下均延迟水稻抽穗。在水稻光周期开花途径中位于Ghd7和Ehd2的上游。

Description

OsCOL15基因在调控水稻抽穗期中的应用

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，具体地说，涉及OsCOL15基因在调控水稻抽穗期中的应用。

背景技术

控制开花时间(作物中称为抽穗期)是农作物繁殖成功的关键一步，同时也是作物地区适应性和产量潜力的重要因素(Hori等，2016，Theor.Appl.Genet.129：2241-2252)。精确的开花转变是由环境(日长和温度)和内源信号触发的。光周期是监测植物在同一地区相对稳定的重要环境因子，而其他环境因子则逐年变化。

根据光周期的类型，植物通常分为三类：在长日照下促进开花的长日照植物，在短日照下促进开花的短日植物和不受光周期调节的日中性植物。光周期开花的分子机制在拟南芥(长日照植物)和水稻(短日照植物)中已广泛研究(Song等，2015，Plant Biol.66：441-464；Shrestha等，2014，Ann.Bot.114：1445-1458)。在拟南芥中，GI-CO-FT作为核心光周期开花通路在长日照下起作用而在短日照条件下无作用，该通路与水稻的OsGI-Hd1-Hd3a在进化上保守(Song等，2015，Plant Biol.66：441-464)。在短日照条件下，Hd1通过激活Hd3a表达促进抽穗，而在长日照条件下，通过抑制Hd3a表达延迟抽穗(Yano等，2000，Plant Cell12：2473-2484；Hayama等，2003，Nature 422：719-722)。这种Hd1转换活性响应光周期的分子机制最近得到了部分解释(Du等，2017，Mol Plant 10：948-961；Zhu等，2017，J.Exp.Bot.68：553-568)。此外，除了OsGI-Hd1-Hd3a通路，水稻还有一个进化独特的Ghd7-Ehd1-Hd3a/RFT1通路，因为拟南芥缺乏Ghd7和Ehd1的同源基因(Doi等，2004，Gene Dev.18：926-936；Xue等，2008，Nat.Genet.40：761-767；Song等，2015，Plant Biol.66：441-464)。最近报道了多个激活或抑制Ehd1转录调控的开花时间基因(Hori等，2016，Theor.Appl.Genet.129：2241-2252)。Ghd7编码一个类CONSTANS蛋白，在长日照条件下通过抑制Ehd1和成花素基因的表达延迟开花(Xue等，2008，Nat.Genet.40：761-767)。最近的研究也表明Ghd7-Hdl蛋白形成了一个复合体绑定于Ehd1启动子上抑制其表达(Nemoto等，2016，Plant J.86：221-233)。

类CONSTANS蛋白也叫B-box(BBX)蛋白，属于一类锌指转录因子家族，它包含一个或两个位于氨基末端附近的可能参与蛋白-蛋白互作的BBX结构域，以及位于羧基末端的可能参与蛋白质定位的CCT结构域(Griffiths等，2003，Plant Physiol.131：1855-1867；Huang等，2012，PLoS One 7：e48242)。以往的研究表明，类CONSTANS基因在拟南芥、水稻、小麦、大麦等多个物种中参与光周期开花调控(Valverde，2011，J.Exp.Bot.62：2453-2463；Gangappa和Botto，2014，Trends Plant Sci.19：460-470)。在水稻中，有超过16个类CONSTANS基因，根据BBX结构域的不同可以分为四组(Griffiths等，2003，PlantPhysiol.131：1855-1867)。其中已克隆了八个基因，包括第I组：Hd1，OsCO3，OsCOL4；第II组：OsCOL10，OsCOL16；第III组：DTH2，OsCOL13；第IV组：Ghd7(Yano等，2000，Plant Cell12：2473-2484；Kim等，2008，Planta 228：355-365；Lee等，2010，Plant J.63：18-30；Tan等，2016，Plant Cell Physiol.57：798-812；Wu等，2017，Plant Sci.260：60-69；Wu等，2013，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 110：2775-2780；Sheng等，2016，Plant Mol.Biol.92：209-222；Xue等，2008，Nat.Genet.40：761-767)。本发明研究OsCOL15在水稻光周期开花调控中的作用，属于第III组类CONSTANS基因。该基因在短日照和长日照条件下均抑制抽穗。

发明内容

本发明的目的是提供OsCOL15基因在调控水稻抽穗期中的应用。

为了实现本发明目的，本发明提供OsCOL15基因在调控水稻抽穗期中的应用，OsCOL15基因的cDNA序列为：

i)SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列；或

ii)SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列经取代、缺失和/或增加一个或多个核苷酸且表达相同功能蛋白质的核苷酸序列；或

iii)在严格条件下与SEQ ID NO：1所示序列杂交且表达相同功能蛋白质的核苷酸序列，所述严格条件为在含O.1％SDS的0.1×SSPE或含0.1％SDS的0.1×SSC溶液中，在65℃下杂交，并用该溶液洗膜；或

iv)与i)、ii)或iii)的核苷酸序列具有90％以上同源性且表达相同功能蛋白质的核苷酸序列。

发明人将本发明克隆的控制水稻抽穗期的基因命名为OsCOL15，该基因序列来自水稻品种日本晴，其cDNA序列大小为1891bp，编码区序列(CDS)如SEQ ID N0：2所示。该基因编码具有488个氨基酸的B-box/CCT锌指蛋白(SEQ ID N0：3)，包含一个BBX结构域和一个CCT结构域，属于类CONSTANS转录因子基因家族。进一步研究发现OsCOL15基因通过上调Ghd7和下调Ehd2来抑制Ehd1、Hd3a和RFT1的表达，最终延迟水稻抽穗。

前述的应用，通过在水稻中过表达OsCOL15基因，来延迟水稻抽穗期。

本发明还提供OsCOL15基因在水稻品种改良中的应用。

本发明还提供一种转基因水稻植株的构建方法，采用农杆菌介导的方法，将携带有OsCOL15基因cDNA序列的重组表达载体转入水稻愈伤组织中，转化后的材料经过共培养-筛选-分化-生根-转基因苗的锻炼和移栽，筛选转基因水稻植株。

在本发明的一个具体实施方式中，通过将OsCOL15基因构建到载体pCAMBIA2300上，用所得重组载体转化水稻，筛选阳性转基因水稻植株。具体方法如下：

利用引物OsCOL15-OX-F(SEQ ID NO：4)和OsCOL15-OX-R(SEQ ID NO：5)，以水稻品种日本晴cDNA为模板进行PCR扩增得到如SEQ ID NO：1所示的OsCOL15全长cDNA序列，然后通过同源重组将该片段重组至pCAMBIA2300载体的Xma I位点，通过农杆菌EHA105介导的水稻遗传转化，转入水稻品种日本晴中。

携带有所述目的基因的表达载体可通过使用Ti质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、微注射、电穿孔等常规生物技术方法导入植物细胞中(Weissbach，1988，Method forPlant Molecular Biology VIII，Academy Press，New York，411-463；Geiserson和Corey，1998，Plant Molecular Biology，2^ndEdition)。

本发明还提供利用RNAi技术沉默水稻OsCOL15基因的方法，以水稻品种日本晴cDNA为模板，设计引物(SEQ ID NO：6-13)，扩增出大小261bp包含OsCOL15基因人工miRNA序列的核酸片段，通过同源重组将该核酸片段重组至pCAMBIA2300的Xma I位点，然后转化水稻。

本发明进一步提供基于CRISPR/Cas9技术敲除水稻OsCOL15基因的方法，其中，sgRNA作用于OsCOL15基因靶位点的核苷酸序列为：5′-gtgtcgcagtccgcgcac-3′(SEQ IDNO：18)。

本发明首次揭示了OsCOL15基因的生物学功能，通过亚细胞定位实验发现OsCOL15-GFP融合蛋白定位在水稻叶片原生质体的细胞核中。转录自激活实验显示OsCOL15基因具有很强的转录自激活活性，随后的缺失分析显示位于BBX结构域和CCT结构域之间的区域对转录活性是必须的。通过组织表达研究发现，OsCOL15基因在幼嫩的叶片中表达量较高。节律表达模式分析发现OsCOL15基因呈现明显的昼夜节律表达。通过在水稻品种日本晴中过表达OsCOL15基因，发现转基因植株出现明显的晚抽穗表型，该基因在海南短日照和杭州长日照条件下均抑制开花。实时定量PCR实验发现OsCOL15基因位于Ghd7和Ehd2的上游，通过促进Ghd7和抑制Ehd2的表达最终抑制抽穗。

附图说明

图1为本发明实施例1中OsCOL15蛋白的序列比对，核定位和转录自激活分析。其中，A为OsCOL15和AtCOL15的蛋白序列比对。B-E为OsCOL15的亚细胞定位。F为OsCOL15的转录自激活实验和缺失分析，其中pGBKT7空载体用于阴性对照，-T和-THA分别表示SD/-Trp和SD/-Trp/-His/-Ade。

图2为本发明实施例2中OsCOL15基因的时间和空间表达模式分析。其中，A表示长日照条件下50天时的野生型植株。L，叶片(L1-L5)；LS，叶鞘；ASA，茎尖。B为通过RT-qPCR的方法分析OsCOL15基因在各组织中的表达水平。C-F表示通过RT-qPCR的方法分析OsCOL15从短日照到持续光照(C)，从短日照到持续黑暗(D)，从长日照到持续光照(E)，从长日照到持续黑暗(F)条件下的节律表达模式，其中白色和黑色的方框分别表示光期和暗期。浅灰色表示持续光期中主观上的暗期，深灰色表示持续暗期中主观上的光期。平均值±SD。

图3为本发明实施例3中OsCOL15基因的过表达，RNAi和CRISPR/Cas9基因敲除植株的表型。A表示OsCOL15过表达植株(左边)和野生型(右边)在自然长日照条件下的表型。B和C为OsCOL15过表达T₁植株(B)和OsCOL15-RNAi T₁植株(C)在自然短日照和自然长日照条件下的抽穗期。D为OsCOL15通过CRISPR/Cas9基因敲除的植株在短日照和长日照条件下的抽穗期，其中(+)和(-)表示转基因阳性和阴性株。P¹指双尾t检测的P值，P²指威尔科克森符号秩检验的P值。实验中检测的植株数在柱中显示，平均值±SEM。E和F指OsCOL15过表达和野生型植株在短日照(E)和长日照(F)条件下的出叶速率。平均值±SD(n＝30)。

图4为本发明实施例4中在短日照和长日照条件下，Hd1(A)，Ehd1(B)，Hd3a(C)，RFT1(D)，OsMADS14(E)，OsMADS15(F)，Ghd7(G)，和Ehd2(H)在OsCOL15过表达以及野生型植株中的表达水平，其中白色和黑色的方框分别表示光期和暗期。平均值±SD。

图5为本发明实施例4中在短日照和长日照条件下，OsCOL15在开花调节因子通过CRISPR/Cas9产生的基因敲除系和野生型植株中的表达水平。其中，hd1(A)，ehd1(B)，hd3a(C)，rft1(D)，osmads14(E)，osmads15(F)，ghd7(G)，ehd2(H)，ehd4(I)，dth8(J)，osco14(K)，phyb(L)，se5(M)，ehd3(N)和hd16(0)。平均值±SD。

图6为本发明实施例4中在短日照和长日照条件下，Ehd4(A)，DTH8(B)，OsCOL4(C)，PHYB(D)，SE5(E)，OsCOL10(F)，OsCOL13(G)，Ehd3(H)，Hd16(I)，Hd17(J)和OsCOL16(K)在OsCOL15过表达以及野生型植株中的表达水平。其中，白色和黑色的方框分别表示光期和暗期。平均值±SD。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册(Sambrook J&Russell DW，2001，Molecular Cloning：a Laboratory Manual)，或按照制造厂商说明书建议的条件。

实施例1 OsCOL15基因是具有转录自激活活性的转录因子

研究发现拟南芥AtCOL15和AtHAP3及AtHAP5互作，并且AtHAP3a抑制开花(Wenkel等，2006，Plant Cell，18：2971-2984)。另外，AtCOL15的表达受节律钟调控(Tindall，2016，University of Liverpool，Thesis)，然而，未有研究表明AtCOL15是否与抽穗期相关。因此，本发明试图研究并确认AtCOL15在水稻中同源基因的功能。通过序列比对，发现AtCOL15的水稻同源基因是OsO(LOC_Os08g42440)，蛋白序列比对显示OsCOL15的BBX和CCT结构域和AtCOL15分别有58％和74％的同源率(图1A)，随后将OsO命名为OsCOL15。

为了确定OsCOL15是否为水稻转录因子，本发明进行亚细胞定位实验。本实施例中构建了一个亚细胞定位载体，构建过程如下：用引物OsCOL15-GFP-BamHI-F(SEQ ID N0：14)和OsCOL15-GFP-BamHI-R(SEQ ID NO：15)，以水稻品种日本晴cDNA为模板进行PCR扩增，不包含终止密码子，然后用同源重组把该片段重组至pAN580载体的BamHI位点，最终形成OsCOL15-GFP融合载体。水稻叶片原生质体细胞的瞬时表达实验显示OsCOL15-GFP融合蛋白定位在细胞核中(图1B-E)。

为了进一步分析OsCOL15是否具有转录自激活活性，本发明利用pGBKT7载体构建了OsCOL15的CDS和各种结构域缺失构建。以OsCOL15的cDNA(SEQ ID NO：1)序列为模板，用表1引物扩增OsCOL15 CDS和各种缺失片段，通过同源重组把这些片段分别重组至pGBKT7的EcoRI位点，构建5个载体：BD-OsCOL15、BD-ΔBBX、BD-ΔMiddle、BD-Δ CCT和BD-ΔBBX/CCT。空载体和5个载体均转化入酵母AH109菌株中，随后分别在-Trp和-Trp/-His/-Ade的SD培养基上培养。结果显示，BD-OsCOL15融合蛋白在-Trp/-His/-Ade的SD培养基上长势很好，说明OsCOL15具有很强的转录自激活活性(图1F)。缺失分析实验表明位于BBX和CCT结构域中间的区域对于OsCOL15的转录活性是必须的(图1F)。

表1构建OsCOL15转录自激活载体的引物

实施例2 OsCOL15基因表现为节律表达

为了研究OsCOL15基因的表达模式，本发明通过实时荧光定量PCR(RT-qPCR)的方法检测OsCOL15基因在各种发育中组织器官的表达水平(图2A)，利用引物qRT-OsCOL15-F(SEQ ID NO：16)和qRT-OsCOL15-R(SEQ ID NO：17)。结果显示OsCOL15基因在幼嫩组织中表达量更高(图2B)，该结果与前人的研究关于开花调节因子在发育中的叶片中表达量较高相一致(Han等，2015，Plant Cell Environ.38：2527-2540)。

另外，我们利用RT-qPCR检测OsCOL15基因在短日照和长日照条件下的节律表达模式，结果显示OsCOL15基因表现明显的节律表达模式(图2C-F)。在短日照条件下，OsCOL15基因的转录在光期开始后即开始增高，在进入暗期后两小时到达峰值，随后开始降低，到光期后降至谷底，然后进入新的循环(图2C和D)；在长日照条件下，OsCOL15基因的转录在光期开始后即开始增高，在进入暗期前两小时到达峰值，随后开始降低，到光期后降至谷底，然后进入新的循环(图2E和F)。其次，当植株转入持续的光照条件时，OsCOL15基因的节律振幅降低(图2C和E)；而当植株转入持续的黑暗条件时，OsCOL15基因的节律振幅迅速增加(图2D和F)。该结果表明OsCOL15基因的转录受节律钟调控，并且可能受黑暗处理的诱导。

实施例3 OsCOL15基因是一个开花抑制因子

上述研究表明OsCOL15基因表现为节律表达并且受节律钟调控，因为很多开花时间调节因子表现为节律表达，因此本发明研究OsCOL15基因是否参与水稻开花时间调控。本发明构建了pAct1：：OsCOL15过表达载体并转入野生型日本晴中，产生OsCOL15过表达家系，同时种植在杭州自然长日照和海南自然短日照条件下。载体构建方法如下：利用引物OsCOL15-OX-F(SEQ ID NO：4)和OsCOL15-OX-R(SEQ ID NO：5)，以水稻品种日本晴cDNA为模板进行PCR扩增得到OsCOL15的全长cDNA序列(SEQ ID NO：1)。然后通过同源重组将该片段重组至pCAMBIA2300载体的Xma I位点，通过农杆菌EHA105介导的水稻遗传转化，转入水稻品种日本晴中。经过愈伤组织诱导、继代、预培养、侵染、共培养、筛选具有潮霉素抗性的愈伤组织、分化、生根、炼苗移载，得到转基因植株。农杆菌介导的粳稻遗传转化体系主要应用Hiei等人报道的方法(Hiei等，1996，Plant J.6：271-282)，并在此基础上稍作改进。结果发现，在海南自然短日照和杭州自然长日照条件下，OsCOL15转基因阳性植株均比转基因阴性植株延迟抽穗两周左右(图3A和B)。

本发明同时也创建了OsCOL15-RNAi植株进一步验证OsCOL15的功能。载体构建方法如下：通过表2引物，使用Warthmann等报道的方法(Warthmann等，2008，PLoS One 3：e1289)，设计引物(SEQ ID NO：6-13)，扩增出大小261bp包含OsCOL15基因人工miRNA序列的核酸片段，通过同源重组把该片段重组至pCAMBIA2300的Xma I位点。值得注意的是，转基因阳性植株和转基因阴性植株的抽穗期相似(图3C)。此外，本发明还创建了OsCOL15-CRISPR植株。载体构建方法如下：利用表2引物，扩增48bp包含OsCOL15特异的sgRNA：Cas9靶序列的片段，sgRNA识别位点的核苷酸序列为：5′-gtgtcgcagtccgcgcac-3′，通过同源重组把该片段重组至pcas9-sgRNA载体的Aar I位点。后续的数据显示OsCOL15-CRISPR纯合基因敲除株系和野生型植株的抽穗期几乎相同(图3D)。这些结果表明OsCOL15在两种光照条件下均抑制开花，并且可能和其他的开花调节因子功能冗余。此外，本发明发现在短日照和长日照条件下，OsCOL15过表达植株和野生型植株的叶片出叶速度没有显著差异(图3E和F)，这表明OsCOL15不影响水稻的生长速率。

表2构建OsCOL15-RNAi和OsCOL15-CRISPR载体的引物

名称	正向引物(5′-3′)	反向引物(5′-3′)
			OsCOL15-RNAi-1	tcggatcccagcagcagccacagcaaa	tgtaggctttatgattaagagtactgctgctgctacagcc
OsCOL15-RNAi-2	cttaggcattaagattaagagtattcctgctgctaggctg	tcggtaccgctgctgatgctgatgccat
			OsCOL15-RNAi-3	agtactcttaatcataaagcctacaggagattcagtttga	aatactcttaatcttaatgcctaagagaggcaaaagtgaa
OsCOL15-RNAi4	agaagaggtacccgggtcggatcccagcagcagccacagcaaa	ctagaggatccccgggtcggtaccgctgctgatgctgatgccat
			OsCOL15-CRISPR	agatgatccgtggcagtgtcgcagtccgcgcacgttttagagctatgc	gcatagctctaaaacgtgcgcggactgcgacactgccacggatcatct

实施例4 OsCOL15基因位于Ghd7和Ehd2的上游

为了进一步研究OsCOL15在水稻光周期开花调控中的作用，在短日照和长日照条件下，首先检测开花整合基因Hd1和Ehd1在OsCOL15过表达植株和野生型植株中的转录水平。结果显示Hd1的节律表达水平在过表达和野生型植株中相似(图4A)，而Ehd1的转录水平在过表达植株中显著降低(图4B)。OsCOL15过表达也导致Hd3a、RFT1OsMADS14和OsMADS15的表达降低(图4C-F)，这些基因位于Hd1和Ehd1的下游(Tsuji等，2011，Curr.Opin.PlantBiol.14：45-52)。此外，在这些开花时间调节因子的基因敲除植株和野生型植株中检测OsCOL15的表达也没有发现显著的差异(图5A-F)。这些结果表明OsCOL15是Ehd1的上游抑制基因并且独立于Hd1。

随后又检测了Ghd7、Ehd2、Ehd3、Ehd4、DTH8、PHYB、SE5、Hd16、Hd17、OsCOL4、OsCOL10、OsCOL13和OsCOL16的表达水平，这些基因属于Ehd1的上游调控因子。本发明的数据表明，在过表达植株中，Ghd7的转录水平大大提高，Ehd2的转录水平显著降低(图4G和H)，同时OsCOL15对Ghd7和Ehd2也没有影响(图5G和H)，表明OsCOL15是Ghd7的上游激活因子和Ehd2的上游抑制因子。过表达OsCOL15不影响其他Ehd1调节因子的转录水平，如Ehd4、DTH8、PHYB、SE5、OsCOL4、OsCOL10和OsCOL13(图6A-G)。此外，本发明还发现Ghd7的调节因子如Ehd3、Hd16、Hd17和OsCOL16的转录水平在过表达植株中也没有受到影响(图6H-K)。值得注意的是，OsCOL15没有影响这些Ehd1和Ghd7的调节因子(图5I-O)。这些结果表明，OsCOL15通过控制Ghd7、Ehd2及其下游调节因子来抑制开花。本发明所用RT-qPCR引物序列见表3。

表3 RT-qPCR引物(5′-3′)

名称	正向引物	反向引物
			Ubq	gctccgtggcggtatcat	cggcagttgacagccctag
Hd1	ggcgtcagtgcttacacagatt	tccagcaggtgtcaggattct
			Ehd1	cctacagtgattatggcttca	gtgctgccaaatgttgctc
Hd3a	gctcactatcatcatccagcatg	ccttgctcagctatttaattgcataa
			RFT1	tgacctagattcaaagtctaatcctt	tgccggccatgtcaaattaataac
OsMADS14	gcaatgggaccagacacaac	ctgctacatcctctatcctttcg
			OsMADS15	ccctaccctacaggctacata	taggaagcactaggtacgtgctga
Ghd7	gcttgaacccaaacacgg	ctcatctcggcataggctt
			Ehd2	gcactccgactggaaggc	gcagaaggccctgtgtgtc
Ehd4	cagccagcggaatcatcac	ccaaatccatcagacctactcct
			DTH8	caggagtgcgtgtcggagtt	ggtcgtcgccgttgatggt
OsCOL4	acaatagccacgaggatagcg	cgatggccttgattccgt
			PHYB	ctcatcttcaaggaatctgagg	cctgctagaacaagcattcac
SE5	aggactcccaagcttttatc	ctccagaatacgagaacgac
			OsCOL10	cgccctcgcttcgatccca	tccctctcgccgccggtca
OsCOL13	gagttcacttctgggcatggtg	tcagtgcaatcggttgacatga
			Ehd3	gaccacctcgtcacctacaag	gagtgtccctccagctaatcc
Hd16	gggaagcccagcaactcaa	gcccatcttcattgcctttt
			Hd17	tgtcgccccttcgtcaa	ggtcttttccccagctcatt
OsCOL16	atggcggaagtttgatctg	aatgcagtttcgacgagttg

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

参考文献

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序列表

<110> 中国水稻研究所

<120> OsCOL15基因在调控水稻抽穗期中的应用

<130> KDI060425

<160> 18

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1891

<212> DNA

<213> 水稻(Oryza sativa)

<400> 1

cctcctcatt cctgcattgc attgcttccg agctcaaaag tcgtcgtaga cccccgcctc 60

cttcctcctc ctcctcgcgc ttcgatttgg tttggtttga ttcggtttgc gagatgaagg 120

atggtggtgg aggaggaggg agggggcagc agcagcagtg gccttgcgac tactgcgggg 180

aggcggcggc ggcgctgcac tgcagggcgg acgccgcgag gctgtgcgtc gcctgcgacc 240

gccacgtgca cgccgccaac gcgctctcgc ggaagcacgt ccgcgccccg ctctgcgccg 300

cctgcgccgc caggccggcc gccgcgcgcg tcgcctccgc ctcggcgccg gcgttcctgt 360

gcgcggactg cgacaccggg tgcggcggcg acgacggcgc ggccttgcgg gtgcccgtcg 420

aggggttctc cgggtgcccc gccgccgccg agctcgccgc gtcgtggggg ctcgacctcc 480

ccggcggctg cggcggcgag gaggaggagg ccgacgacgc gttcttctcg gcgctcgact 540

actccatgct cgccgtcgac cccgtgctgc gcgacctcta cgtgccatgc gacccgcccg 600

aggtggtggt ggccggcggc gggcggcgac tcaaggggga ggcgctcggc caccagctcg 660

ccgagatggc gcgccgggag gccgagacgg cgcacccgca cacgcagccg cactcggatc 720

tgagcccccg cacgcctcgc cggacctccg ccgcggcgag cggccgcctg caggaaaagc 780

aagctccccc gccgttgcct catgctgctg cgacggcggc gccgctgccg tacacttcac 840

tgctcatgat ggcgccggcc aactgcaccg agctcatgga aaacaaccgt gttggagacg 900

aagatgaaaa tgttctgtgg gagagcaccg cgccatcagt gccaccaacc cagatatggg 960

attttaattt gggaaaatca agggatcaca atgagaactc tgcacttgaa gttggatttg 1020

gctcaaacaa tggaggcttt atgattaaga gttataatga catgctcaag gagatttctt 1080

ctgggacaac gaaggatctg gaagatattt atgactcaag atattttgca gctgccgaag 1140

atatcatgtc gactaatgtc tgtcagctgt catcgaaaaa tccaagcacc aggagcaaca 1200

aacggaaggc gagctcatgc gcttcgacga tcgatggacc gacaacttcc acaagccatg 1260

tacctgctgc ttcaggggca ttggggggct cttcgaacga cagaggatcg gctctcccca 1320

aggagatttc cttctgtgat cagaccgtcg tccctaccgg agccgatcag aggccatgta 1380

ccatcaagat cgacagcgag acgctcgcgc agaacaggga cagcgcgatg cagcggtaca 1440

gggagaagaa gaagaaccgc aggtatgaga agcacatcag gtacgagtcg aggaagctga 1500

gagcggacac gaggaagagg gtgaaaggcc ggtttgtgaa gtcgaacgga gcacctgatg 1560

atgtcagcaa tggcgggtga tctcatccct gcaatccctg atagctagct gcaatgtacg 1620

tagcctggct ttttgacgtt gcagagatcg atgtggccat atatatgctg agagctaagt 1680

ctgaaatatg ttgcgtatgt tgttacaacc tatgcacgct ctgcttaagt ctgtctgctg 1740

ctgcatgtat tgttcagcta aaatttttgc gtccaagagt cgatcttgat aattaagtac 1800

ccctactaca aatctacact acatactgta atagacctta gatttttttt ctcatctcct 1860

cgtagaaata tatggcattt tatatatacg t 1891

<210> 2

<211> 1467

<212> DNA

<213> 水稻(Oryza sativa)

<400> 2

atgaaggatg gtggtggagg aggagggagg gggcagcagc agcagtggcc ttgcgactac 60

tgcggggagg cggcggcggc gctgcactgc agggcggacg ccgcgaggct gtgcgtcgcc 120

tgcgaccgcc acgtgcacgc cgccaacgcg ctctcgcgga agcacgtccg cgccccgctc 180

tgcgccgcct gcgccgccag gccggccgcc gcgcgcgtcg cctccgcctc ggcgccggcg 240

ttcctgtgcg cggactgcga caccgggtgc ggcggcgacg acggcgcggc cttgcgggtg 300

cccgtcgagg ggttctccgg gtgccccgcc gccgccgagc tcgccgcgtc gtgggggctc 360

gacctccccg gcggctgcgg cggcgaggag gaggaggccg acgacgcgtt cttctcggcg 420

ctcgactact ccatgctcgc cgtcgacccc gtgctgcgcg acctctacgt gccatgcgac 480

ccgcccgagg tggtggtggc cggcggcggg cggcgactca agggggaggc gctcggccac 540

cagctcgccg agatggcgcg ccgggaggcc gagacggcgc acccgcacac gcagccgcac 600

tcggatctga gcccccgcac gcctcgccgg acctccgccg cggcgagcgg ccgcctgcag 660

gaaaagcaag ctcccccgcc gttgcctcat gctgctgcga cggcggcgcc gctgccgtac 720

acttcactgc tcatgatggc gccggccaac tgcaccgagc tcatggaaaa caaccgtgtt 780

ggagacgaag atgaaaatgt tctgtgggag agcaccgcgc catcagtgcc accaacccag 840

atatgggatt ttaatttggg aaaatcaagg gatcacaatg agaactctgc acttgaagtt 900

ggatttggct caaacaatgg aggctttatg attaagagtt ataatgacat gctcaaggag 960

atttcttctg ggacaacgaa ggatctggaa gatatttatg actcaagata ttttgcagct 1020

gccgaagata tcatgtcgac taatgtctgt cagctgtcat cgaaaaatcc aagcaccagg 1080

agcaacaaac ggaaggcgag ctcatgcgct tcgacgatcg atggaccgac aacttccaca 1140

agccatgtac ctgctgcttc aggggcattg gggggctctt cgaacgacag aggatcggct 1200

ctccccaagg agatttcctt ctgtgatcag accgtcgtcc ctaccggagc cgatcagagg 1260

ccatgtacca tcaagatcga cagcgagacg ctcgcgcaga acagggacag cgcgatgcag 1320

cggtacaggg agaagaagaa gaaccgcagg tatgagaagc acatcaggta cgagtcgagg 1380

aagctgagag cggacacgag gaagagggtg aaaggccggt ttgtgaagtc gaacggagca 1440

cctgatgatg tcagcaatgg cgggtga 1467

<210> 3

<211> 488

<212> PRT

<213> 水稻(Oryza sativa)

<400> 3

Met Lys Asp Gly Gly Gly Gly Gly Gly Arg Gly Gln Gln Gln Gln Trp

1 5 10 15

Pro Cys Asp Tyr Cys Gly Glu Ala Ala Ala Ala Leu His Cys Arg Ala

20 25 30

Asp Ala Ala Arg Leu Cys Val Ala Cys Asp Arg His Val His Ala Ala

35 40 45

Asn Ala Leu Ser Arg Lys His Val Arg Ala Pro Leu Cys Ala Ala Cys

50 55 60

Ala Ala Arg Pro Ala Ala Ala Arg Val Ala Ser Ala Ser Ala Pro Ala

65 70 75 80

Phe Leu Cys Ala Asp Cys Asp Thr Gly Cys Gly Gly Asp Asp Gly Ala

85 90 95

Ala Leu Arg Val Pro Val Glu Gly Phe Ser Gly Cys Pro Ala Ala Ala

100 105 110

Glu Leu Ala Ala Ser Trp Gly Leu Asp Leu Pro Gly Gly Cys Gly Gly

115 120 125

Glu Glu Glu Glu Ala Asp Asp Ala Phe Phe Ser Ala Leu Asp Tyr Ser

130 135 140

Met Leu Ala Val Asp Pro Val Leu Arg Asp Leu Tyr Val Pro Cys Asp

145 150 155 160

Pro Pro Glu Val Val Val Ala Gly Gly Gly Arg Arg Leu Lys Gly Glu

165 170 175

Ala Leu Gly His Gln Leu Ala Glu Met Ala Arg Arg Glu Ala Glu Thr

180 185 190

Ala His Pro His Thr Gln Pro His Ser Asp Leu Ser Pro Arg Thr Pro

195 200 205

Arg Arg Thr Ser Ala Ala Ala Ser Gly Arg Leu Gln Glu Lys Gln Ala

210 215 220

Pro Pro Pro Leu Pro His Ala Ala Ala Thr Ala Ala Pro Leu Pro Tyr

225 230 235 240

Thr Ser Leu Leu Met Met Ala Pro Ala Asn Cys Thr Glu Leu Met Glu

245 250 255

Asn Asn Arg Val Gly Asp Glu Asp Glu Asn Val Leu Trp Glu Ser Thr

260 265 270

Ala Pro Ser Val Pro Pro Thr Gln Ile Trp Asp Phe Asn Leu Gly Lys

275 280 285

Ser Arg Asp His Asn Glu Asn Ser Ala Leu Glu Val Gly Phe Gly Ser

290 295 300

Asn Asn Gly Gly Phe Met Ile Lys Ser Tyr Asn Asp Met Leu Lys Glu

305 310 315 320

Ile Ser Ser Gly Thr Thr Lys Asp Leu Glu Asp Ile Tyr Asp Ser Arg

325 330 335

Tyr Phe Ala Ala Ala Glu Asp Ile Met Ser Thr Asn Val Cys Gln Leu

340 345 350

Ser Ser Lys Asn Pro Ser Thr Arg Ser Asn Lys Arg Lys Ala Ser Ser

355 360 365

Cys Ala Ser Thr Ile Asp Gly Pro Thr Thr Ser Thr Ser His Val Pro

370 375 380

Ala Ala Ser Gly Ala Leu Gly Gly Ser Ser Asn Asp Arg Gly Ser Ala

385 390 395 400

Leu Pro Lys Glu Ile Ser Phe Cys Asp Gln Thr Val Val Pro Thr Gly

405 410 415

Ala Asp Gln Arg Pro Cys Thr Ile Lys Ile Asp Ser Glu Thr Leu Ala

420 425 430

Gln Asn Arg Asp Ser Ala Met Gln Arg Tyr Arg Glu Lys Lys Lys Asn

435 440 445

Arg Arg Tyr Glu Lys His Ile Arg Tyr Glu Ser Arg Lys Leu Arg Ala

450 455 460

Asp Thr Arg Lys Arg Val Lys Gly Arg Phe Val Lys Ser Asn Gly Ala

465 470 475 480

Pro Asp Asp Val Ser Asn Gly Gly

485

<210> 4

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

tgtaggtaga agaggtaccc tcctcattcc tgcattgc 38

<210> 5

<211> 49

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

actctagagg atccccggac gtatatataa aatgccatat atttctacg 49

<210> 6

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

tcggatccca gcagcagcca cagcaaa 27

<210> 7

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

tgtaggcttt atgattaaga gtactgctgc tgctacagcc 40

<210> 8

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

cttaggcatt aagattaaga gtattcctgc tgctaggctg 40

<210> 9

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

tcggtaccgc tgctgatgct gatgccat 28

<210> 10

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

agtactctta atcataaagc ctacaggaga ttcagtttga 40

<210> 11

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

aatactctta atcttaatgc ctaagagagg caaaagtgaa 40

<210> 12

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

agaagaggta cccgggtcgg atcccagcag cagccacagc aaa 43

<210> 13

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

ctagaggatc cccgggtcgg taccgctgct gatgctgatg ccat 44

<210> 14

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

accggtcccg ggggatccat gaaggatggt ggtggagg 38

<210> 15

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

ctcgcccttg ctcaccatcc cgccattgct gacatc 36

<210> 16

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

ggagatttct tctgggacaa cg 22

<210> 17

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

tgttgctcct ggtgcttgg 19

<210> 18

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 18

gtgtcgcagt ccgcgcac 18

Claims

1.OsCOL15基因在调控水稻抽穗期中的应用，其特征在于，OsCOL15基因的cDNA序列为：

i)SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列；或

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述调控水稻抽穗期是指控制水稻抽穗期延迟。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，通过在水稻中过表达OsCOL15基因，来延迟水稻抽穗期。

4.OsCOL15基因在水稻品种改良中的应用，其中，OsCOL15基因的cDNA序列同权利要求1所述。

5.一种转基因水稻植株的构建方法，其特征在于，采用农杆菌介导的方法，将携带有OsCOL15基因cDNA序列的重组表达载体转入水稻愈伤组织中，转化后的材料经过共培养-筛选-分化-生根-转基因苗的锻炼和移栽，筛选转基因水稻植株。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，利用引物OsCOL15-OX-F和OsCOL15-OX-R，以水稻品种日本晴cDNA为模板进行PCR扩增得到如SEQ ID NO：1所示的OsCOL15全长cDNA序列，然后通过同源重组将该片段重组至pCAMBIA2300载体的Xma I位点，通过农杆菌EHA105介导的水稻遗传转化，转入水稻品种日本晴中；

其中，引物OsCOL15-OX-F和OsCOL15-OX-R的序列分别如SEQ ID NO：4和5所示。

7.利用RNAi技术沉默水稻OsCOL15基因的方法，其特征在于，以水稻品种日本晴cDNA为模板，设计引物，扩增出大小261bp包含OsCOL15基因人工miRNA序列的核酸片段，通过同源重组将该核酸片段重组至pCAMBIA2300的Xma I位点，然后转化水稻；

所述引物序列分别如SEQ ID NO：6-13所示。

8.基于CRISPR/Cas9技术敲除水稻OsCOL15基因的方法，其特征在于，sgRNA作用于OsCOL15基因靶位点的核苷酸序列为：5′-gtgtcgcagtccgcgcac-3′。