CN112321693A

CN112321693A - 小麦TaCCT1-6A蛋白在调控作物抽穗期中的应用

Info

Publication number: CN112321693A
Application number: CN202011291925.8A
Authority: CN
Inventors: 李甜; 柳洪; 王雅美; 郑军; 郝晨阳; 张学勇
Original assignee: Institute of Crop Sciences of Chinese Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Institute of Crop Sciences of Chinese Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2020-11-18
Filing date: 2020-11-18
Publication date: 2021-02-05
Anticipated expiration: 2040-11-18
Also published as: CN112321693B

Abstract

本发明公开了一种小麦TaCCT1‑6A蛋白在调控作物抽穗期中的应用。本发明提供了TaCCT1‑6A蛋白或其相关生物材料在调控植物抽穗期中的应用；所述TaCCT1‑6A蛋白的序列为SEQ ID No.1，或将其经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且来源于小麦具有相同功能，或者与其具有80％以上同源性且来源于小麦具有相同功能，或者在其N端和/或C端连接标签序列且具有相同功能。本发明通过转基因过表达TaCCT1‑6A可显著延迟小麦抽穗期。本发明为培育具有适应不同生态环境的作物新品种提供候选基因，同时对于认识作物抽穗期及相关产量性状的形成具有重要的理论和实践意义。

Description

小麦TaCCT1-6A蛋白在调控作物抽穗期中的应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种小麦TaCCT1-6A蛋白在调控作物抽穗期中的应用。

背景技术

抽穗是禾谷类作物(水稻、小麦、玉米等)发育完全的穗，随着茎秆的伸长而伸出顶部叶的现象。抽穗期是植物发育过程中由营养生长向生殖生长转变的一个关键的阶段(Kardailsky,I.,Shukla,V.K.,Ahn,J.H.,Dagenais,N.,Christensen,S.K.,Nguyen,J.T.,Chory,J.,Harrison,M.J.,and Weigel,D.(1999).Activation tagging of the floralinducer FT.Science 286:1962-1965.)。对作物而言，适宜的抽穗期决定作物对不同气候及生态区的适应性，同时对作物的产量产生重要的影响(Cockram,J.,Jones,H.,Leigh,F.J.,O'Sullivan,D.,Powell,W.,Laurie,D.A.,and Greenland,A.J.(2007).Control offlowering time in temperate cereals:genes,domestication,and sustainableproductivity.J.Exp.Bot.58:1231-1244.)。例如，对于我国夏季干热风剧烈发生的地区，可以适当选择一些抽穗期提前的小麦品种，这样可以在干热风发生时提前灌浆、成熟，避免遭受产量的重大损失。因此，对品种抽穗期的选择是育种过程中重要的目标之一。重要的研究表明，植物的抽穗期受光照、温度、激素以及内在的小分子的调节，因此，决定植物抽穗期的复杂性和多样性(Weng,X.Y.,Wang,L.,Wang,J.,Hu,Y.,Du,H.,Xu,C.G.,Xing,Y.Z.,Li,X.H.,Xiao,J.H.,and Zhang,Q.F.Grain number,plant height,and heading date7 is acentral regulator of growth,development,and stress response.Plant Physiology,2014,164:735-747.)。因此克隆一些调控抽穗期基因并解析其作用机理，可以为培育具有适应不同生态环境的小麦新品种提供候选基因，同时也可以增加对小麦抽穗调控机理的理解和认识。

小麦是全球主要粮食作物，主要产区分布全球各地。因此，适宜的抽穗期是决定小麦品种地区适应性和季节适应性的重要指标。小麦的抽穗期同样受一系列内在和外在因素的影响。目前，已知的调控小麦抽穗期的信号通路主要分为以下几个方面，光周期路径、春化路径，和自主开花路径(Chen A,Li C,Hu W,Lau MY,Lin H,Rockwell NC,Martin SS,Jernstedt JA,Lagarias JC,Dubcovsky J.(2014)PHYTOCHROME C plays a major rolein the acceleration of wheat flowering under long-day photoperiod.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 111:10037-10044.)。其中，在光周期路径中，PPD1、CO1、CO2作为主要的调控基因在小麦中已被克隆；在小麦花期和春化相关研究中，VRN1、VRN2与VRN3认为是春化途径中的3个关键基因(Yan,L.L,Fu,D.,Li,C.,Blechl,A.,Tranquilli,G.,Bonafede,M.,Sanchez,A.,Valarik,M.,Yasuda,S.,and Dubcovsky,J.(2006).The wheat and barleyvernalization gene VRN3 is an orthologue of FT.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 103:19581-19586.)；自主开花路径中，近来发掘micoRNA156、microRNA172可以直接调控抽穗期相关基因(Liu J,Cheng X,Liu P,Sun J(2017)miR156-targeted SBP-Box transcriptionfactors interact with DWARF53 to regulate TEOSINTE BRANCHED1 and BARRENSTALK1 expression in bread wheat.Plant Physiology 174:1931-1948)。小麦具有广泛的适应性，能成功适应不同的地理和生态环境，抽穗期不可能由少数几个基因控制，必然有许多相关调控基因尚未被发现，它们的功能及机制还有待揭示。所以，对小麦开花过程相关基因进一步克隆和深入研究，对于认识小麦抽穗期及相关产量性状的形成具有重要的理论和实践意义。

发明内容

本发明的目的是提供一种小麦TaCCT1-6A蛋白在调控作物抽穗期中的应用。

第一方面，本发明要求保护TaCCT1-6A蛋白或其相关生物材料在调控植物抽穗期中的应用。

其中，所述相关生物材料可为能够表达所述TaCCT1-6A蛋白的核酸分子，或含有所述核酸分子的表达盒、重组载体、重组菌或转基因细胞系。

所述表达盒是指能够在宿主细胞中表达TaCCT1-6A的DNA，该DNA不但可包括启动TaCCT1-6A基因转录的启动子，还可包括终止TaCCT1-6A转录的终止子。进一步，所述表达盒还可包括增强子序列。可用于本发明的启动子包括但不限于：组成型启动子，组织、器官和发育特异的启动子，和诱导型启动子。启动子的例子包括但不限于：泛生素基因Ubiqutin启动子(pUbi)；花椰菜花叶病毒的组成型启动子35S；来自西红柿的创伤诱导型启动子，亮氨酸氨基肽酶("LAP",Chao等人(1999)Plant Physiol 120:979-992)；来自烟草的化学诱导型启动子，发病机理相关1(PR1)(由水杨酸和BTH(苯并噻二唑-7-硫代羟酸S-甲酯)诱导)；西红柿蛋白酶抑制剂II启动子(PIN2)或LAP启动子(均可用茉莉酮酸曱酯诱导)；热休克启动子(美国专利5，187，267)；四环素诱导型启动子(美国专利5，057,422)；种子特异性启动子，如谷子种子特异性启动子pF128(CN101063139B(中国专利2007 1 0099169.7))，种子贮存蛋白质特异的启动子(例如，菜豆球蛋白、napin,oleosin和大豆beta conglycin的启动子(Beachy等人(1985)EMBO J.4:3047-3053))。它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用。此处引用的所有参考文献均全文引用。合适的转录终止子包括但不限于：农杆菌胭脂碱合成酶终止子(NOS终止子)、花椰菜花叶病毒CaMV 35S终止子、tml终止子、豌豆rbcSE9终止子和胭脂氨酸和章鱼氨酸合酶终止子(参见，例如：Odell等人(I⁹⁸⁵)Nature 313:810；Rosenberg等人(1987)Gene,56:125；Guerineau等人(1991)Mol.Gen.Genet,262:141；Proudfoot(1991)Cell,64:671；Sanfacon等人Genes Dev.,5:141；Mogen等人(1990)PlantCell,2:1261；Munroe等人(1990)Gene,91:151；Ballad等人(1989)Nucleic Acids Res.17:7891；Joshi等人(1987)Nucleic Acid Res.,15:9627)。

构建含有所述TaCCT1-6A基因表达盒的重组表达载体。所利用的植物表达载体可为双元农杆菌载体或Gateway系统载体等，如pAHC-PSK、pBin438、pCAMBIA1302、pCAMBIA2301、pCAMBIA1301、pCAMBIA1300、pBI121、pCAMBIA1391-Xa、pCAMBIA1391-XbpGWB411、pGWB412或pGWB405、。使用TaCCT1-6A构建重组表达载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强型、组成型、组织特异型或诱导型启动子，如花椰菜花叶病毒(CAMV)35S启动子、泛生素基因Ubiqutin启动子(pUbi)等，它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用；此外，使用本发明的基因构建植物表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。

为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因(GUS基因、萤光素酶基因等)、具有抗性的抗生素标记物(庆大霉素标记物、卡那霉素标记物等)或是抗化学试剂标记基因(如抗除莠剂基因)等。

所述TaCCT1-6A蛋白可为如下任一所示蛋白质：

(A1)氨基酸序列为SEQ ID No.1的蛋白质；

(A2)将SEQ ID No.1所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的且来源于小麦的蛋白质；

(A3)与(A1)-(A2)中任一所限定的氨基酸序列具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同源性且来源于小麦的具有相同功能的蛋白质；

(A4)在(A1)-(A3)中任一所限定的蛋白质的N端和/或C端连接标签后得到的融合蛋白。

上述蛋白质中，所述蛋白标签(protein-tag)是指利用DNA体外重组技术，与目的蛋白一起融合表达的一种多肽或者蛋白，以便于目的蛋白的表达、检测、示踪和/或纯化。所述蛋白标签可为Flag标签、His标签、MBP标签、HA标签、myc标签、GST标签和/或SUMO标签等。

上述蛋白质中，同一性是指氨基酸序列的同一性。可使用国际互联网上的同源性检索站点测定氨基酸序列的同一性，如NCBI主页网站的BLAST网页。例如，可在高级BLAST2.1中，通过使用blastp作为程序，将Expect值设置为10，将所有Filter设置为OFF，使用BLOSUM62作为Matrix，将Gap existence cost，Per residue gap cost和Lambda ratio分别设置为11，1和0.85(缺省值)并进行检索一对氨基酸序列的同一性进行计算，然后即可获得同一性的值(％)。

上述蛋白质中，所述95％以上的同源性可为至少96％、97％、98％的同一性。所述90％以上的同源性可为至少91％、92％、93％、94％的同一性。所述85％以上的同源性可为至少86％、87％、88％、89％的同一性。所述80％以上的同源性可为至少81％、82％、83％、84％的同一性。

在上述应用中，所述TaCCT1-6A蛋白在所述植物中的表达量和/或活性越高，所述植物的抽穗期越延迟。

第二方面，本发明要求保护一种培育抽穗期延迟的植物的方法(或称为使植物抽穗期延迟的方法)。

本发明所要求保护的培育抽穗期延迟的植物的方法(或称为使植物抽穗期延迟的方法)，可包括使受体植物中TaCCT1-6A蛋白的表达量和/或活性提高的步骤。所述TaCCT1-6A蛋白可为前文(A1)-(A4)中任一所示蛋白质。

其中，所述培育抽穗期延迟的植物品种的方法可以通过杂交手段实现，也可以通过转基因手段实现。

第三方面，本发明要求保护一种培育抽穗期延迟的转基因植物的方法(或称为使植物抽穗期延迟的方法)。

本发明要求保护的培育抽穗期延迟的转基因植物的方法(或称为使植物抽穗期延迟的方法)，可包括如下步骤：向受体植物中导入能够表达所述TaCCT1-6A蛋白的核酸分子，得到转基因植物；所述转基因植物与所述受体植物相比抽穗期延迟。所述TaCCT1-6A蛋白可为前文(A1)-(A4)中任一所示蛋白质。

在所述方法中，所述能够表达TaCCT1-6A蛋白的核酸分子可通过重组表达载体的形式导入所述受体植物。

在本发明中，所述重组表达载体中启动所述编码基因转录的启动子为Ubi启动子，终止子为Noster poly A终止子。

进一步地，所述重组表达载体为将所述核酸分子插入到pAHC-PSK载体载体的多克隆位点处(SpeI和NotI)所得的重组质粒。

所述pAHC-PSK载体载体由中国农业科学院作物科学研究所夏兰琴老师提供(载体文献：毕惠惠，王根平，王成社，等.单子叶植物RNA干扰和过表达Gateway载体的构建[J].植物遗传资源学报,2013(01):115～123.)

上述方法中，其中所述核酸分子(TaCCT1-6A基因)可先进行如下修饰，再导入所述受体植物中，以达到更好的表达效果：

1)修饰邻近起始甲硫氨酸的基因序列，以使翻译有效起始；例如，利用在植物中已知的有效的序列进行修饰；

2)与各种植物表达的启动子连接，以利于其在植物中的表达；所述启动子可包括组成型、诱导型、时序调节、发育调节、化学调节、组织优选和组织特异性启动子；启动子的选择将随着表达时间和空间需要而变化，而且也取决于靶物种；例如组织或器官的特异性表达启动子，根据需要受体在发育的什么时期而定；尽管证明了来源于双子叶植物的许多启动子在单子叶植物中是可起作用的，反之亦然，但是理想地，选择双子叶植物启动子用于双子叶植物中的表达，单子叶植物的启动子用于单子叶植物中的表达；

3)与适合的转录终止子连接，也可以提高本发明基因的表达效率；例如来源于CaMV的tml，来源于rbcS的E9；任何已知在植物中起作用的可得到的终止子都可以与本发明基因进行连接；

4)引入增强子序列，如内含子序列(例如来源于Adhl和bronzel)和病毒前导序列(例如来源于TMV、MCMV和AMV)。

在上述方法中，将重组表达载体导入所述受体植物，具体可为：通过使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、电导、农杆菌介导等常规生物学方法转化植物细胞或组织，并将转化的植物组织培育成植株。

上述方法中，所述转基因植物理解为不仅包含第一代到第二代转基因植物，也包括其子代。对于转基因植物，可以在该物种中繁殖该基因，也可用常规育种技术将该基因转移进入相同物种的其它品种，特别包括商业品种中。所述转基因植物包括种子、愈伤组织、完整植株和细胞。

在上述各方面中，所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA；所述核酸分子也可以是RNA，如mRNA等。

进一步地，能够表达所述TaCCT1-6A蛋白的核酸分子可为如下任一：

(B1)SEQ ID No.2所示的DNA分子；

(B2)在严格条件下与(B1)限定的DNA分子杂交且编码所述TaCCT1-6A蛋白的DNA分子；

(B3)与(B1)-(B2)中任一限定的DNA序列具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同源性且编码所述TaCCT1-6A蛋白的DNA分子。

所述核酸分子来源于小麦。

上述核酸分子中，所述严格条件可为如下：50℃，在7％十二烷基硫酸钠(SDS)、0.5M Na₃PO₄和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，2×SSC，0.1％SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5M Na₃PO₄和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，1×SSC，0.1％SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5M Na₃PO₄和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，0.5×SSC，0.1％SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5M Na₃PO₄和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，0.1×SSC，0.1％SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5M Na₃PO₄和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在65℃，0.1×SSC，0.1％SDS中漂洗；也可为：在6×SSC，0.5％SDS的溶液中，在65℃下杂交，然后用2×SSC，0.1％SDS和1×SSC，0.1％SDS各洗膜一次。

上述核酸分子中，同源性是指核苷酸序列的同一性。可使用国际互联网上的同源性检索站点测定核苷酸序列的同一性，如NCBI主页网站的BLAST网页。例如，可在高级BLAST2.1中，通过使用blastp作为程序，将Expect值设置为10，将所有Filter设置为OFF，使用BLOSUM62作为Matrix，将Gap existence cost，Per residue gap cost和Lambda ratio分别设置为11，1和0.85(缺省值)并进行检索一对核苷酸序列的同一性进行计算，然后即可获得同一性的值(％)。

上述核酸分子中，所述95％以上的同源性可为至少96％、97％、98％的同一性。所述90％以上的同源性可为至少91％、92％、93％、94％的同一性。所述85％以上的同源性可为至少86％、87％、88％、89％的同一性。所述80％以上的同源性可为至少81％、82％、83％、84％的同一性。

第四方面，本发明要求保护前文第二方面或第三方面所述的方法在植物育种中的应用。

在上述各方面中，所述抽穗期延迟具体体现为长日照(16h光照/8h黑暗)条件下或短日照(8h光照/16h黑暗)条件下或自然田间条件抽穗期的延迟。

在本发明中，每个单株的所述抽穗期的统计方法是以第一个穗完全抽出记为抽穗的日期。

在上述各方面中，所述植物可为单子叶植物或双子叶植物。

进一步地，所述单子叶植物可为禾本科植物。

更进一步地，所述禾本科植物可为小麦。

在本发明的具体实施方式中，所述小麦具体为小麦品种科农199。

本发明通过转基因过表达TaCCT1-6A，可以显著延迟小麦的抽穗期。本发明为培育具有适应不同生态环境的小麦新品种提供候选基因，同时对于认识小麦抽穗期及相关产量性状的形成具有重要的理论和实践意义。

附图说明

图1为TaCCT1-6A基因的PCR扩增结果。

图2为TaCCT1-6A表达模式分析。A：qRT-PCR显示TaCCT1-6A在不同的光照条件下呈现生物钟的表达模式。将两周的幼苗分别放置于长日照(LD,16h光照/8h黑暗)，短日照(SD,8h光照/16h黑暗)，全光照(LL)或全黑暗(DD)。白框和黑框分别代表光照和黑暗条件。以上统计数据均是2个生物学重复和三个技术性重复。TaActin作为内参基因。B：TaCCT1组织表达。苗期根(SR)、苗期茎(SS)、苗期叶(SL)、拔节期根(RES)、拔节期茎(SES)、拔节期叶(LES)、抽穗期根(HR)、抽穗期茎(HS)、抽穗期叶(HL)、抽穗期倒2叶(HSL)、抽穗期节(HN)、抽穗期穂(HSP)、雄蕊(S)、雌蕊(P)、幼穂(YS)、花后5天(5DPA)、花后10天籽粒(10DPA)、花后15天籽粒(15DPA)、花后20天籽粒(20DPA)、花后25天籽粒(25DPA)。

图3为构建的小麦过表达转基因载体和酶切验证结果。A：小麦转基因载体结构图；B：转基因载体酶切验证(用SpeI和NotI双酶切)。

图4为PCR检测TaCCT1-6A转基因阳性株系。

图5为TaCCT1-6A在转基因株系1#、2#、3#和野生型WT中转录水平检测结果。

图6为TaCCT1-6A过表达转基因株系的表型鉴定。A、C和E为自然田间条件(A)、长日照(C)或短日照(E)条件下，比较TaCCT1-6A过表达转基因株系和野生型抽穗期相关表型。B、D和F为自然田间条件(B)、长日照(D)或短日照(F)条件TaCCT1-6A转基因株系和野生型抽穗时间。统计的数据是使用20个单株的平均值和标准差。^**P<0.01(t检验)。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1、TaCCT1-6A的基因克隆

供试材料：所用的小麦品种中国春为本实验室保存。中国春种子萌发后2周左右取样，采用Trizon法提取叶片部位的RNA样品，使用5X All-In-One MasterMix反转录试剂盒(北京艾可莘生物技术有限公司)对RNA样品进行反转录得到cDNA。

一、Trizon法提取RNA

1、取下样品后直接置于液氮中速冻，研钵(事先用清水洗干净并用DEPC水处理过夜，120℃20min灭菌2次，使用前置于-20℃预冷)用液氮预冷，将样品迅速用力研磨(中间添加液氮时应小心防止液氮溅出)后，转移到RNase-free的2ml离心管中，加入1.0ml TRIZOL，Vortex 15秒，室温静置5min，12000rpm，4℃，10分钟离心，将上清转移到一新的RNase-free的2ml离心管中。

2、加入200μl氯仿，用手晃动均匀后，室温静置3min，10000g，4℃，15分钟离心，将上清(约500μl)转移到一新的RNase-free的1.5ml离心管中。

3、向上清中加入1/10体积的3M NaAc，1倍体积的异丙醇，用手晃动均匀后，置于-20℃中30min，使RNA逐渐析出。10000g，4℃，10分钟，离心沉淀，将上清弃去。

4、向有RNA沉淀的1.5ml离心管中加入70％乙醇1.2ml。Vortex沉淀悬浮，反复用手晃动混匀室温静置10-15min，10000rpm，4℃，5min，离心沉淀。小心将上清倒出，注意不要将RNA倒出。重复上步一遍。将剩余乙醇吸干，置于超净台中吹干(10min)。

5、加入50μl DEPC-ddH₂O，轻弹离心管使RNA沉淀溶解，室温溶解30min。

反转录反应体系及反应条件如表1所示。

表1反转录反应体系及反应条件

二、TaCCT1-6A基因的获得

TaCCT1-6A引物的设计主要依据国际小麦测序联盟(IWGSC)的中国春小麦参考基因数据库(http://plants.ensembl.org/Triticum_aestivum/Info/Index)，TaCCT1-6A的上游引物包括翻译起始密码子ATG，下游引物包括终止密码子TGA。然后以反转录的中国春叶片cDNA为模板，使用引物TaCCT1-CDS-F和TaCCT1-CDS-R进行PCR扩增，引物序列如下：进行PCR扩增。

引物序列如下：

TaCCT1-CDS-F：5’-ATGACGTCGTCCTGCATACCC-3’；

TaCCT1-CDS-R：5’-CTAGCTCTCTTCCTCCAGGGCT-3’。

PCR反应体系如表2。

表2 PCR反应体系

成分	体积(μl)
		2×pfu PCR Mastermix	5
dNTP	0.24
		TaCCT1-CDS-F(10μM)	0.5
TaCCT1-CDS-R(10μM)	0.5
		DNA模板	2
PCR enhancer	5
		ddH<sub>2</sub>0	11.76
总体积(μl)	25

反应程序：94℃3min，(94℃30sec；60℃30sec；72℃1min30sec)×36，72℃10min。

PCR扩增产物用1.5％琼脂糖140V电压下电泳20min后，在1.5kb位置存在扩增条带(图1)，切下条带后使用AxyPrep DNA凝胶回收试剂盒(北京百灵克生物科技有限责任公司)回收PCR产物。再将回收的DNA片段与pEASY-Blunt载体(北京全式金生物)连接20min，转化大肠杆菌感受态细胞Trans-T1(北京全式金生物)。过夜培养后挑单克隆，通过PCR鉴定(体系见表2)后将单克隆测序得到TaCCT1-6A的基因序列。

TaCCT1-6A的基因序列如SEQ ID No.2所示，编码SEQ ID No.1所示蛋白质。

实施例2、TaCCT1-6A的表达模式分析

节律表达材料：小麦科农199种子萌发后分别放于长日照条件(16h光照/8h黑暗)，短日照条件(8h光照/16h黑暗)，普通日照条件(12h光照/12h黑暗)12天后分别置于全光照和全黑暗条件下。每隔4h取样(旗叶前5cm样品，去除1cm叶尖)。在72小时一共取样18次。使用5X All-In-One MasterMix反转录试剂盒(北京艾可莘生物技术有限公司)对RNA样品进行反转录得到cDNA。

组织表达材料：选取小麦科农199苗期根(SR)、苗期茎(SS)、苗期叶(SL)、拔节期根(RES)、拔节期茎(SES)、拔节期叶(LES)、抽穗期根(HR)、抽穗期茎(HS)、抽穗期叶(HL)、幼穗(YS)、抽穗期穂(HSP)、花后5天籽粒(5DPA)、花后10天籽粒(10DPA)、花后15天籽粒(15DPA)、花后20天籽粒(20DPA)、花后25天籽粒(25DPA)取样提取组织RNA，反转录后得到cDNA。

根据所得到的TaCCT1-6A的基因序列，设计一对TaCCT1-6A qRT-PCR引物。

引物序列如下：

TaCCT1-qPCR-F：5’-GAGGAGGAGCTGTCCAAAGC-3’；

TaCCT1-qPCR-R：5’-CTGCAAGTTTGGCCCGCA-3’。

qRT-PCR反应体系如表3所示。

表3 qRT-PCR反应体系

成分	体积(μl)
		SYBR<sup>@</sup>Taq Ex	10
TaCCT1-qPCR-F(10μM)	0.4
		TaCCT1-qPCR-R(10μM)	0.4
模板	2
		ddH<sub>2</sub>O	7.2
总体积(μl)	20

反应程序：94℃5min，(94℃30sec；60℃30sec；72℃30sec)×40，72℃7min。

为了验证TaCCT1-6A的节律性表达模式，我们在长日照、短日照、全光照和全黑暗四种不同光照条件下通过qRT-PCR方法对TaCCT1-6A在不同时间点的表达量进行检测。表达模式结果见图2中A。在不同的光照条件下，TaCCT1-6A呈现生物钟的表达模式，在4h达到表达的峰值。

我们还对TaCCT1-6A在小麦不同发育时期以及不同组织部位的表达水平进行了研究。如图2中B所示，TaCCT1-6A在茎中表达量较高，其次是叶片，在根系、穗以及发育的籽粒中表达量较低。

实施例3、TaCCT1-6A转基因小麦的获得及表型鉴定

一、TaCCT1-6A转基因过表达载体构建

转基因载体pAHC-PSK由中国农业科学院作物科学研究所夏兰琴老师提供(载体文献：毕惠惠，王根平，王成社，等.单子叶植物RNA干扰和过表达Gateway载体的构建[J].植物遗传资源学报,2013(01):115～123.)。使用SpeI和NotI双酶切pAHC-PSK载体(该载体的多克隆位点及两端序列如SEQ ID No.3所示)，切胶回收。以实施例1克隆的TaCCT1-6A CDS(如SEQ ID No.2所示)为模板，通过TaCCT1-OE-SpeI-F和TaCCT1-OE-NotI-R引入酶切位点SpeI和NotI，进行PCR扩增(PCR条件参照表2)，将扩增产物进行双酶切后与酶切回收的pAHC-PSK载体使用T4 DNA连接酶(北京经科宏达生物技术有限公司)连接(体系见表4)，转化到大肠杆菌感受态细胞(Trans-T1)，获得阳性克隆。提取质粒后分别进行双酶切(图3)和测序验证，验证后提取正确的阳性克隆，使用高浓度质粒小提中量试剂盒(北京天根)提取质粒，确保最终的质粒浓度在1μg/μl左右，将提取好的质粒载体用于后续的基因枪转化。

表4连接反应体系

成分	体积(μl)
		T4 DNA ligase Buffer	1μl
T4 DNA ligase	1μl
		载体	2μl
PCR产物	6μl
		总体积	10μl

引物序列如下(下划线部分为酶切位点识别序列)：

TaCCT1-OE-SpeI-F：5’-CTAGACTAGTATGACGTCGTCCTGCATACCC-3’；

TaCCT1-OE-NotI-R：5’-ATAAGAATGCGGCCGCCTAGCTCTCTTCCTCCAGGGCT-3’。

最终，将测序表明将pAHC-PSK载体的酶切位点SpeI和NotI之间的小片段替换为SEQ ID No.2所示DNA片段后的重组质粒命名为pAHC-PSK-TaCCT1-6A。

二、基因枪转化

1、金粉准备：将称量好的金粉用70％酒精清洗，震荡3min,然后离心10000rmp/min，10s，弃去上清液，重复3次，加入无菌水，浓度为40mg/ml。

2、样品混合(10枪的量)：

金粉(40mg/ml)：20μl

DNA(1μg/μl)：10μl

CaCl₂(2.5M)：10μl

亚精胺：10μl。

其中，DNA即为步骤一得到的重组载体pAHC-PSK-TaCCT1-6A。

3、样品混匀后，冰浴15min，然后离心10000rmp/min，10s，弃掉上清液，加入100％无水乙醇(100μl/枪)，混匀。

4、离心10000rmp/min，10s，弃上清，加入100％无水乙醇，20μl/枪。

5、每枪上样15μl。

三、组织培养

1、选取开花12天的科农199幼胚，用70％酒精洗1min，清水冲洗1遍，再用2％次氯酸钠灭菌20min，无菌水清洗5-6遍。

2、用显微镜剥去幼胚，高渗处理4h(高渗培养基：MS盐4.4g/L，2,4-D 5mg/L，0.2mol/L的甘露醇和0.2mol/L的山梨醇，蔗糖30g/L，pH 5.8；植物凝胶3g/L)。然后进行基因枪轰击。轰击后，22℃，暗培养16h，

3、恢复培养，24℃，暗培养2周。该步骤使用W1培养基，为在MS盐4.4g/L中添加以下物质：2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)至终浓度为1.5mg/L，6-呋喃基氨基嘌呤(KT)至终浓度为0.5mg/L，水解酪蛋白至终浓度为500mg/L，L-天门冬酰胺至终浓度为250mg/L，L-谷氨酰胺至终浓度为200mg/L，盐酸硫胺素(VB1)至终浓度为8.0mg/L，蔗糖至终浓度为15000mg/L，麦芽糖至终浓度为15000mg/L，琼脂至终浓度为5000mg/L

4、再生培养，24℃，16h光照，8h黑暗，培养4周，每两周继代一次。该步骤使用W2培养基，为以MS培养基为基准，添加以下物质：2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)至终浓度为1.0mg/L，6-呋喃基氨基嘌呤(KT)至终浓度为0.5mg/L，α-萘乙酸(NAA)至终浓度为0.01mg/L，水解酪蛋白至终浓度为500mg/L，L-天门冬酰胺至终浓度为250mg/L，L-谷氨酰胺至终浓度为200mg/L，盐酸硫胺素(VB1)至终浓度为8.0mg/L，PPT至终浓度为5mg/L，蔗糖至终浓度为15000mg/L，麦芽糖至终浓度为15000mg/L，琼脂至终浓度为5000mg/L。

5、生根培养，24℃，16h光照，8h黑暗，培养4周，每两周继代一次。该步骤使用W3培养基，配方如下：MS盐2.2g/L，MES 0.5g/L，蔗糖30g/L pH 5.8；植物凝胶3.0g/L，PPT 5mg/L。

6、当转基因植株长至10cm左右，可移栽到温室，直径12cm的花盆，每盆一株。苗期生长温度为，光照20℃，黑暗15℃。孕穗期生长温度为，光照28℃，黑暗20℃，得到T1代种子。

将T1代种子种于大田后得到T1代株系，将每个单株分别取样进行PCR阳性鉴定(引物如下)，得到转基因阳性株系。T1代株系自交后获得T2代种子，T2代株系同样阳性鉴定后自交得到T3代种子。

转基因株系阳性鉴定PCR引物：

TaCCT1-CDS-F：5’-ATGACGTCGTCCTGCATACCC-3’；

TaCCT1-CDS-R：5’-CTAGCTCTCTTCCTCCAGGGCT-3’。

经PCR鉴定(PCR条件参照表2)，能够得到大小约为1.5kb目的条带的株系为阳性株系(见图4)。从阳性株系中随机选取3株，分别编号为1#、2#和3#。

实验同时设置向小麦品种科农199中转入pAHC-PSK空载体的对照。

四、TaCCT1-6A的转基因小麦表型鉴定

将T3代种子种于自然田间、长日照(16h光照/8h黑暗)和短日照(8h光照/16h黑暗)温室三种条件下观察转基因过表达株系的表型。

首先，我们通过qRT-PCR方法检测了野生型和转基因株系1#、2#和3#中TaCCT1-6A的表达量。qRT-PCR具体参见实施例2中相关步骤。

结果如图5所示，1#、2#和3#株系中TaCCT1-6A的表达量分别是野生型的5.8、6.7和8.2倍。另外，空载对照株系中TaCCT1-6A的表达量与野生型相比基本一致，无统计学差异。

同时，每个单株抽穗期统计方法是以第一个穗抽出记为抽穗的日期。在田间条件下，1#、2#和3#三个株系平均抽穗期分别比野生型晚5.3天、5.5天和6.2天(图6中A和6中B)；1#、2#和3#三个株系抽穗期在长日照和短日照条件下均出现一定的延迟，其中，长日照分别延迟3.8天、5.1天和6.0天(图6中C和图6中D)，短日照分别延迟3.4天、5.2天和6.1天(图6中E和图6中F)。三种条件下转基因株系和野生型对照相比，抽穗期差异均达到极显著水平(^**P<0.01)。另外，空载对照株系各条件下的抽穗期与野生型相比基本一致，无统计学差异。因此，过表达TaCCT1-6A可以显著延迟小麦的抽穗期，且在田间自然条件、长日照条件和短日照条件下效应相似。根据以上结果可知，TaCCT1-6A作为一个生物钟表达节律基因可以显著调节小麦的生育期。

在田间育种过程中，合适的抽穗期和成熟期是保证高产和稳产的前提，未来我们可以利用TaCCT1-6A在不同育种材料表达量、等位基因功能差异以及基因编辑技术来调节品种的生育期，根据抽穗期多样性显著提高优异品种的适应性。

以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。

<110> 中国农业科学院作物科学研究所

<120> 小麦TaCCT1-6A蛋白在调控作物抽穗期中的应用

<130> GNCLN202847

<160> 3

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 492

<212> PRT

<213> Triticum aestivum

<400> 1

Met Thr Ser Ser Cys Ile Pro Thr Gly Leu Arg Leu Asp Leu Asp Met

1 5 10 15

Val Lys Ala Ala Ala Ser Pro Gly Ala His Ala His Ser Ser Pro Leu

20 25 30

Arg Pro Ala His Ser Ser Pro Ser Ser Thr Leu Ser Glu Ala Ser Asn

35 40 45

Ala Ser Ser Ser Ala Thr Ser Val Ser Leu Lys Arg Ala Arg Ala Pro

50 55 60

Arg Lys Arg Pro Asn Gln Ala Tyr Asn Glu Ala Ala Ala Leu Leu Ala

65 70 75 80

Ser Ile His Pro Ser Val Phe Pro Val Lys Lys Ser Pro Lys Thr Ala

85 90 95

Thr Ala Pro Arg Pro Pro Leu Ser Gly Leu Ala Val Ala Phe Gly Ala

100 105 110

Ala Ala Pro Ser Ser Ser Asp Leu Leu Pro Pro Leu Pro Val Leu Ser

115 120 125

Asp Ala Ala Phe Leu Leu Arg Asp His Ala Ala Ser Pro Ser Pro Pro

130 135 140

Pro His Ser Pro Ser Ala Asp Ala Cys Lys Asn Cys Ser Ser Pro Thr

145 150 155 160

Pro Val Ser Ser Ala Phe Arg Asp Phe Arg Asp Pro Ala Pro Ser Pro

165 170 175

Ala Ser Pro Asp Thr Ala Thr Asp Glu Pro Gly Glu Leu Asp Phe Asp

180 185 190

Asp Asp Gly Phe Asp Ala Glu Ser Ile Leu Asp Val Asp Glu Ala Ala

195 200 205

Ala Gly Gly Ala Ala Glu Gly Ile Asp Gly Ile Met Gly Ser Leu Thr

210 215 220

Met Glu Ala Asn Thr Pro Thr Ala Thr Ser Asp Asp Ser Ile Leu Ser

225 230 235 240

Ser Ser Gly Ile His Pro Tyr Leu Arg Ser Leu Met Val Val Gly Leu

245 250 255

Ala Gly Arg Phe Glu Leu Gly Leu Gly Ser Arg Gln Ser Thr Arg Pro

260 265 270

Asn Leu Asn Arg Ala Leu Lys Arg Arg Asp Asp Asp Gly Ala Trp Trp

275 280 285

Met Trp Pro Ala Val Pro Val Lys Asp Ile Thr Val Thr Pro Pro Ser

290 295 300

Pro Pro Pro Thr Glu Pro Ala Ala Ala Val Ser Asn Thr Ala Met Pro

305 310 315 320

Pro Pro Ala Ser Ala Ala Pro Glu Lys Lys Lys Ser Lys Lys Lys Lys

325 330 335

Lys Val Lys Met Glu Lys Val Met Ala Lys Glu Glu Glu Leu Ser Lys

340 345 350

Ala Lys Cys Glu Glu Gly Ala Asp Gly Thr Leu Asp Ala Ala Asp Gly

355 360 365

Asn Asp Asp Asp Asp Ser Ala Pro Thr Lys Ala Pro Lys Thr Gly Leu

370 375 380

Gly Leu Lys Leu Asp Thr Asp Asp Val Leu Lys Glu Trp Ser Gly Lys

385 390 395 400

Gly Ser Met Phe Ala Glu Gly Gly Ala Pro Asp Ser Ser Glu Ser Ala

405 410 415

Ala Glu Val Arg Ala Lys Leu Ala Asp Ile Asp Leu Phe Pro Glu Asn

420 425 430

Gly Ser Gly Gly Ile Arg Glu Ala Arg Val Met Arg Tyr Lys Glu Lys

435 440 445

Arg Arg Asn Arg Leu Phe Ser Lys Lys Ile Arg Tyr Gln Val Arg Lys

450 455 460

Val Asn Ala Asp Cys Arg Pro Arg Met Lys Gly Arg Phe Val Arg Ser

465 470 475 480

Pro Ser Leu Leu Gln Gln Ala Leu Glu Glu Glu Ser

485 490

<210> 2

<211> 1479

<212> DNA

<213> Triticum aestivum

<400> 2

atgacgtcgt cctgcatacc cacggggctg cggctggacc tggacatggt gaaggcggcg 60

gcgtcgccgg gggcgcacgc gcactcgtcg ccgctgaggc cggcgcactc ctcgccgtcc 120

tccacgctct cggaggcctc caacgcgtcc tcctcggcca cctccgtgtc gctcaagcgc 180

gcgcgggcgc cgcggaagcg ccccaaccag gcctacaacg aggccgccgc gctgctcgcc 240

tccatccacc cctccgtctt ccccgtcaag aagagcccca agacggccac ggcgccgcgc 300

ccgccgctct cgggcctcgc cgtggccttc ggcgccgccg ccccgtcctc ctccgacctc 360

ctcccgccgc tccccgtcct gtccgacgcc gcattcctcc tccgcgacca cgcggcctcg 420

ccctcgccgc cgccgcacag cccgtccgcc gacgcctgca agaactgctc gtccccgacg 480

cccgtcagca gcgcgttccg ggacttccgc gacccggcgc cgtcgccggc cagccccgac 540

accgccaccg acgagcccgg cgagctcgac ttcgacgacg acggcttcga cgccgagtcc 600

atcctcgacg tcgacgaggc cgcggccggc ggcgccgccg agggcatcga cggcatcatg 660

gggagcctca ccatggaggc caacacgccc accgccacgt ccgacgactc catcctgtcc 720

agctccggca tacaccccta cctcaggagc ctcatggtcg tcggtctcgc tggccggttc 780

gagctcggcc tcggctcccg gcaaagcacc cgccccaacc tcaaccgcgc cctcaagcgg 840

cgggacgacg acggcgcctg gtggatgtgg cctgccgtgc cggtgaagga catcacggtc 900

acaccaccgt cgccaccacc gacagaacct gcagcggcag tgtccaacac cgcaatgccg 960

ccgccggcgt cggcagcacc agagaagaaa aagagcaaga agaagaagaa ggtgaagatg 1020

gagaaggtga tggccaagga ggaggagctg tccaaagcga aatgcgagga gggggccgat 1080

ggaacactgg acgcggcgga cggcaatgac gacgatgaca gcgcgccgac aaaggcgccg 1140

aagactggcc tggggctgaa gctggacacc gacgacgtgc tcaaggagtg gtccggcaaa 1200

gggtctatgt tcgcggaggg cggcgcgccg gattcgtcgg agtctgccgc cgaagtgcgg 1260

gccaaacttg cagacatcga cttgtttcct gagaacgggt ccggcggcat cagggaagca 1320

agggtgatga ggtacaagga gaagcggcgc aaccggctgt tctcgaagaa gatccggtac 1380

caggtgcgga aggtgaacgc cgactgtcgg cctcggatga agggaaggtt tgttaggagc 1440

ccgtctcttc tgcagcaagc cctggaggaa gagagctag 1479

<210> 3

<211> 553

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 3

atttattaat tttggaactg tatgtgtgtg tcatacatct tcatagttac gagtttaaga 60

tggatggaaa tatcgatcta ggataggtat acatgttgat gtgggtttta ctgatgcata 120

tacatgatgg catatgcagc atctattcat atgctctaac cttgagtacc tatctattat 180

aataaacaag tatgttttat aattattttg atcttgatat acttggatga tggcatatgc 240

agcagctata tgtggatttt tttagccctg ccttcatacg ctatttattt gcttggtact 300

gtttcttttg tcgatgctca ccctgttgtt tggtgttact tctgcaggtc gactctagag 360

gatccccggg ggatccacta gttctagagc ggccgccacc gcggtggagc tcgaatttcc 420

ccgatcgttc aaacatttgg caataaagtt tcttaagatt gaatcctgtt gccggtcttg 480

cgatgattat catataattt ctgttgaatt acgttaagca tgtaataatt aacatgtaat 540

gcatgacgtt att 553

Claims

1.TaCCT1-6A蛋白或其相关生物材料在调控植物抽穗期中的应用；

所述TaCCT1-6A蛋白为如下任一所示蛋白质：

(A1)氨基酸序列为SEQ ID No.1的蛋白质；

(A4)在(A1)-(A3)中任一所限定的蛋白质的N端和/或C端连接标签后得到的融合蛋白；

所述相关生物材料为能够表达所述TaCCT1-6A蛋白的核酸分子，或含有所述核酸分子的表达盒、重组载体、重组菌或转基因细胞系。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述TaCCT1-6A蛋白在所述植物中的表达量和/或活性越高，所述植物的抽穗期越延迟。

3.一种培育抽穗期延迟的植物的方法，包括使受体植物中TaCCT1-6A蛋白的表达量和/或活性提高的步骤；

所述TaCCT1-6A蛋白为如下任一所示蛋白质：

(A1)氨基酸序列为SEQ ID No.1的蛋白质；

4.一种培育抽穗期延迟的转基因植物的方法，包括如下步骤：向受体植物中导入能够表达所述TaCCT1-6A蛋白的核酸分子，得到转基因植物；所述转基因植物与所述受体植物相比抽穗期延迟；

所述TaCCT1-6A蛋白为如下任一所示蛋白质：

(A1)氨基酸序列为SEQ ID No.1的蛋白质；

5.根据权利要求1-4中任一所述的应用或方法，其特征在于：能够表达所述TaCCT1-6A蛋白的核酸分子为如下任一：

(B1)SEQ ID No.2所示的DNA分子；

6.根据权利要求4或5所述的方法，其特征在于：向所述受体植物中导入能够表达所述TaCCT1-6A蛋白的核酸分子是通过向所述受体植物中导入含有所述核酸分子的重组表达载体实现的。

7.权利要求3-6中任一所述的方法在植物育种中的应用。

8.根据权利要求1-7中任一所述的应用或方法，其特征在于：所述植物为双子叶植物或单子叶植物。

9.根据权利要求8所述的应用或方法，其特征在于：所述单子叶植物为禾本科植物。

10.根据权利要求9所述的应用或方法，其特征在于：所述禾本科植物为小麦。