CN105602911B - 一种大豆PUB类E3泛素连接酶GmPUB8及其编码基因与应用 - Google Patents

一种大豆PUB类E3泛素连接酶GmPUB8及其编码基因与应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种大豆PUB类E3泛素连接酶GmPUB8及其编码基因与应用。该大豆PUB类E3泛素连接酶GmPUB8，是具有序列表中的SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列的蛋白质。其编码基因的开放阅读框具有SEQ ID NO.1所示的DNA序列。拟南芥遗传转化表明GmPUB8在不同光周期下调控植物的开花时间，可应用于大豆分子育种。

Description

一种大豆PUB类E3泛素连接酶GmPUB8及其编码基因与应用
技术领域
本发明涉及植物基因工程领域，具体涉及一种大豆PUB类E3泛素连接酶 GmPUB8及其编码基因与应用。
背景技术
开花是植物由营养生长向生殖生长转变的关键过程，植物的开花时间直接控制植物营养生长期和生育期的长短。植物经过长期的演化已经进化出了精确调节开花时间的复杂网络，其中，泛素/26S蛋白酶体途径和类泛素化作为广泛存在的蛋白质翻译后修饰形式，在植物开花时间调控过程中发挥了重要作用。泛素/26S蛋白酶体途径和类泛素化还可调节蛋白质功能，参与真核生物体内的细胞周期调控、基因表达调控及生长发育各个过程。
泛素/26S蛋白酶体途径主要由泛素、泛素激活酶E1、泛素结合酶E2、泛素连接酶E3、去泛素化酶和26S蛋白酶体组成。目前，PUB类E3泛素连接酶基因先后在拟南芥、水稻等植物中克隆出来。拟南芥中的PUB类E3泛素连接酶基因在抗高温、黑暗及干旱胁迫中发挥着重要功能。
发明内容
本发明的目的是提供一种大豆PUB类E3泛素连接酶GmPUB8。
本发明的另一目的是提供该大豆E3泛素连接酶GmPUB8的编码基因。
本发明的又一目的是提供该大豆E3泛素连接酶的应用。
本发明的目的通过如下技术方案实现：
一种大豆PUB类E3泛素连接酶GmPUB8，具有SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列。
本发明所述的大豆PUB类E3泛素连接酶的编码基因GmPUB8，其最大开放阅读框序列如SEQ ID NO.1所示，含有1257bp，编码SEQ ID NO.2所示的 418个氨基酸残基。
含有本发明GmPUB8基因SEQ ID NO.1的表达载体。
所述的表达载体优选将SEQ ID NO.1所示的大豆PUB类E3泛素连接酶 GmPUB8的编码基因利用gateway技术插入植物表达载体pMDC83得到的植物过量表达载体pMDC83-GmPUB8。
使用GmPUB8构建植物表达载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强型启动子。为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入可在植物中表达的选择性标记基因(GUS基因、萤光素酶基因等)或抗生素标记物(庆大霉素标记物、卡那霉素标记物、潮霉素标记物等)的抗性基因。
含有所述大豆PUB类E3泛素连接酶GmPUB8编码基因的工程菌。
所述的工程菌优选将所述的大豆PUB类E3泛素连接酶GmPUB8编码基因转入根癌农杆菌EHA105所得。
扩增所述大豆PUB类E3泛素连接酶GmPUB8编码基因的引物，正向引物序列为SEQID NO.3，反向引物序列为SEQ ID NO.4。
扩增所述大豆PUB类E3泛素连接酶GmPUB8编码基因的实时荧光定量 RT-PCR引物，正向引物序列为SEQ ID NO.5，反向引物序列为SEQ ID NO.6。
所述的大豆PUB类E3泛素连接酶GmPUB8在不同光周期下调控开花时间方面的应用。所述的大豆PUB类E3泛素连接酶GmPUB8的编码基因在不同光周期下调控开花时间方面的应用。
有益效果：
本发明在大豆基因组中克隆得到一种大豆PUB类E3泛素连接酶GmPUB8 的编码基因GmPUB8，GmPUB8基因在大豆组织器官中特异性表达。转基因拟南芥中过量表达GmPUB8基因，与对照组相比，在长日照下开花比野生型植株晚，开花时间推迟5天以上，开花时莲座叶片数较对照增加11片以上；在中日照和短日照下培养，过表达GmPUB8拟南芥植株与对照组相比，开花比野生型植株早，开花时间分别提前9天和13天以上，开花时莲座叶片数较对照分别减少11片和13片以上。上述结果说明GmPUB8可以在不同光周期下调控植物的开花时间。
本发明的GmPUB8为在不同光周期下调控大豆的开花时间提供基因材料与理论基础。
附图说明
图1GmPUB8蛋白系统进化树
图2GmPUB8基因在大豆中的表达特性。
其中：1，根；2，茎；3，叶片；4，花；5，开花后5天幼荚；6，开花后10天幼荚；7，开花后15天幼荚；8，开花后20天幼荚；9，开花后25天幼荚；10，开花后30天幼荚；11，开花后35天幼荚；12，开花后40天幼荚；13，开花后 45天幼荚；14，开花后50天幼荚。
图3含有重组表达载体pET24b-GmPUB8的大肠杆菌BL21(DE3)pLysS菌液 PCR产物电泳图谱。
其中：1，DNA marker；2，含有重组表达载体pET24b-GmPUB8的大肠杆菌BL21 (DE3)pLysS菌液PCR产物。
图4GmPUB8重组蛋白的聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)图。
其中：1，蛋白marker；2，含有空载体pET24b的大肠杆菌BL21(DE3)pLysS 诱导12h；3，含有重组表达载体pET24b-GmPUB8的大肠杆菌BL21(DE3)pLysS 诱导12h。
图5GmPUB8的体外泛素化活性检测。
利用原核细胞体外重组表达并纯化的GmPUB8-6×组氨酸(His)融合蛋白与兔子泛素激活酶E1、人泛素结合酶E2及泛素(Ub)混合后，30℃孵育1.5小时。样品经过聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离，分别采用anti-His和anti-Ub 的抗体进行蛋白杂交检测。
图6GmPUB8过量表达植物表达载体的构建。
图7转GmPUB8基因拟南芥和对照组RT-PCR检测。
WT：野生型；#1-9：转基因型。
图8转GmPUB8基因拟南芥和对照在不同光周期条件下的表型观察。
WT：野生型；#9：转基因株系。
图9转GmPUB8基因拟南芥和对照植株在不同光周期条件下的莲座叶片数和开花时间比较。**表示野生型WT与转基因株系在0.01水平差异显著。
具体实施方式
在本发明中所使用的术语，除非有另外说明，一般具有本领域普通技术人员通常理解的含义。
下面结合具体的制备实施例和应用实施例，并参照数据进一步详细地描述本发明。应理解，这些实施例只是为了举例说明本发明，而非以任何方式限制本发明的范围。
在以下的实施例中，未详细描述的各种过程和方法是本领域中公知的常规方法。所用到的引物，均在首次出现时标明，其后所用相同引物，均以首次标明的内容相同。
下述实施例中所用方法如无特别说明，均为常规方法。
实施例1 GmPUB8基因的克隆与鉴定
实验材料为大豆(Glycine max(L.)Merr.)‘科丰1号’，由南京农业大学国家大豆改良中心种质库提供，材料种植于温室，常规田间管理。
根据拟南芥中已克隆的PUB类E3泛素连接酶AtPUB23(At2g35930)序列，在Phytozome中的大豆基因组数据库中进行BLASTP搜索，利用生物信息学的方法进行分析，设计GmPUB8基因开放阅读框(ORF)正向引物GmPUB8-ORF-F： 5'-ATGGACGAGATCGACGTGCC-3'(SEQ ID NO.3)和反向引物 GmPUB8-ORF-R：5'-TCACGAACTCATTGGAAACGAAG-3'(SEQ IDNO.4)，以大豆嫩叶的cDNA为模板进行PCR扩增GmPUB8的ORF，具体方法如下：取大豆‘科丰1号’嫩叶片，置于液氮中研碎，RNA提取依据TIANGEN总RNA 提取试剂盒RNA PlantExtraction Kit DP417进行。cDNA第一链合成依据TaKaRa 试剂公司cDNA第一链合成试剂盒TaKaRa PrimeScriptTM 1st strand cDNA Synthesis Kit D6110A，具体详见操作说明。以得到的cDNA片段为模板，用上述引物对进行PCR反应扩增。50μl PCR反应体系为：2μlcDNA第一链(0.05 μg)、1.6μl引物(SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4，5μM)、5μl 10×PCR缓冲液、 4μl Mg 2+、4μl dNTP和1.25U Ex Taq DNA聚合酶，用超纯水补足50μl。反应在BIO-RADPTC-200型PCR仪上进行，其程序为95℃变性5min；94℃30sec， 58℃30sec，72℃2min，共35个循环；然后72℃延伸10min；4℃保存。PCR 产物用胶回收试剂盒(天根)回收后连接PMD19-T载体(TaKaRa)、转化大肠杆菌DH5α感受态细胞、蓝白斑筛选、摇菌、测序。序列分析结果表明PCR产物具有序列表中SEQID NO.1的核苷酸序列，命名为GmPUB8。从NCBI中收集多个物种的PUB类E3泛素连接酶PUB蛋白序列，ClustalX进行蛋白序列比对分析，发现GmPUB8与其他物种中的同类蛋白序列同源度较低，与拟南芥中的AtPUB22和AtPUB23的同源性分别达到69.91％和53.83％。然后构建了大豆GmPUB8基因与其他物种PUB基因的系统化树(图1)。
实施例2 大豆GmPUB8基因在不同器官中的表达特征
以大豆品种‘科丰1号’为材料，利用实时荧光定量RT-PCR技术对大豆不同组织根、茎、叶片、花及开花后不同时间茄果中的表达情况进行了研究。各组织总RNA的提取及cDNA第一链合成同实施例1，具体步骤参照试剂盒说明书进行。根据GmPUB8基因序列设计实时荧光定量PCR检测引物 GmPUB8-qPCR-F：5'-TCGTGTGCCCTATTTCATTAGAGC-3'(SEQ ID NO.5)，GmPUB8-qPCR-R：5'-TGCGGAGCGTGTGGTTCG-3'(SEQ ID NO.6)；内参基因采用大豆Actin11基因(Hu et al，2009，BMC Molecular Biology，10：93)，引物序列为Actin11-F：5'-CGGTGGTTCTATCTTGGCATC-3'(SEQ ID NO.7)， Actin11-R：5'-GTCTTTCGCTTCAATAACCCTA-3'(SEQ ID NO.8)。以来自不同组织的cDNA为模板进行实时荧光定量RT-PCR分析。
结果分析表明(图2)，GmPUB8虽然在不同组织中均有表达，但在根中的表达量最高，在开花后5d幼荚中的表达量最低。
实施例3 GmPUB8基因的异源表达及泛素连接酶活性测定
一、携带GmPUB8基因重组表达载体的构建
以大豆cDNA为模板，根据序列SEQ ID No.1设计引物，PCR扩增大豆PUB 类E3泛素连接酶GmPUB8基因编码区的DNA序列。引物两端分别引入Nhe I 和Xho I酶切位点，引物序列为GmPUB8-pET24b-F：5'-CTAGCTAGCATGGACGAGATCGACGTGCC-3'(SEQ ID NO.9)， GmPUB8-pET24b-R：5'-CGATCTCGAGCGAACTCATTGGAAACGAAG-3'(SEQ ID NO.10)；对PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，切下目的条带纯化回收，将回收的DNA片段连接到pMD19-T载体上，转化大肠杆菌(Esherichia coli)DH5α感受态细胞，经蓝白斑筛选，提取阳性克隆质粒测序，得到含有Nhe I和Xho I 酶切位点及GmPUB8基因的质粒pMD19T-GmPUB8。
将质粒pMD19T-GmPUB8和质粒pET24b先在30℃条件下分别用Nhe I和 Xho I双酶切2h后再在37℃条件下分别双酶切2h，酶切产物分别进行1％琼脂糖凝胶电泳分析，回收，用T4DNA连接酶4℃连接过夜。连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，挑取卡那霉素抗性的单克隆，提取质粒，以 GmPUB8-pET24b-F(SEQ ID NO.9)和GmPUB8-pET24b-R(SEQ IDNO.10)引物进行PCR鉴定，并将PCR鉴定正确的阳性克隆子进行测序鉴定。将测序正确的含有SEQ ID NO.1序列并与6×组氨酸(His)融合的重组载体命名为 pET24b-GmPUB8。
二、重组表达载体转化宿主菌、阳性克隆鉴定
将步骤一中构建的重组表达载体pET24b-GmPUB8转化大肠杆菌BL21 (DE3)pLysS感受态细胞，同时将pET24b空载体大肠杆菌BL21(DE3)pLysS，作为对照菌。挑取卡那霉素抗性的单克隆，以GmPUB8-pET24b-F(SEQ ID NO.9) 及GmPUB8-pET24b-R(SEQ ID NO.10)引物进行PCR检测。菌落PCR产物的电泳结果见图3，可知单克隆菌落含有目的基因片段，可用于蛋白的诱导表达。
三、GmPUB8基因的原核表达及GmPUB8-6×组氨酸(His)重组蛋白纯化
将步骤二中鉴定正确的克隆培养过夜，再将细菌100倍稀释于含有卡那霉素(50mg/L)的LB液体培养基中培养，待菌液生长至OD600为0.6-0.8时，加入IPTG(终浓度为0.2mM)进行诱导培养，22℃诱导12h，同时将含有pET24b 空载体大肠杆菌BL21(DE3)pLysS作为对照菌。取诱导过的菌液1mL，离心收集菌体(4000rpm，10min)，菌体蛋白进行12％SDS-PAGE电泳检测。结果表明，在IPTG诱导下，含有重组表达载体pET24b-GmPUB8的大肠杆菌BL21 (DE3)pLysS中成功表达了GmPUB8蛋白，并且表达GmPUB8蛋白的表观分子量与理论分子量相近，约为45KDa(图4)。
取上述IPTG诱导过的菌液250mL，离心收集菌体(4000rpm，20min，4℃)，以50mL预冷的结合缓冲液(50mmol/L PBS磷酸盐缓冲液，300mmol/L NaCl， 10mmol/L咪唑，pH 7.6)洗涤菌体2遍后，重悬于30mL结合缓冲液，进行超声波破碎以释放蛋白，随后高速冷冻低温离心(4℃，15,000rpm离心30min) 除去不溶部分。将上清液部分加入到经结合缓冲液平衡的Ni2+亲和层析柱，待滤液全部过滤完后，分别用洗脱缓冲液A(50mmol/L PBS磷酸盐缓冲液，300 mmol/L NaCl，20mmol/L咪唑，pH 7.6)、洗脱缓冲液B(50mmol/L PBS磷酸盐缓冲液，300mmol/L NaCl，50mmol/L咪唑，pH 7.6)各冲洗1次，洗去杂蛋白。然后用洗脱缓冲液C(50mmol/L PBS磷酸盐缓冲液，300mmol/L NaCl，100mmol/L咪唑，pH 7.6)洗脱蛋白并收集洗脱液。用截留量50kDa的超滤管对蛋白进行离心超滤浓缩，浓缩后样品经平衡缓冲液(200mmol/L KCl，10 mmol/L Tris-HCl，pH8.0)平衡过的Sephadex G-25进行脱盐处理后收集，最后将收集液再次用截留量50kDa的超滤管浓缩至所需浓度。
四、GmPUB8的E3泛素连接酶活性检测
将纯化的GmPUB8-6×His重组蛋白中加入1.5μl 20×反应缓冲液[含1M Tris pH7.5，100mM腺嘌呤核苷三磷酸(ATP)，50mM MgCl2，2mM二硫苏糖醇 (DTT)]，3μl兔子泛素激活酶E1，3μl人泛素结合酶E2(UBC5B)，5μl泛素(Ub)，加双蒸水至总体积为30μl；37℃孵育90min；SDS-PAGE电泳、转膜，用anti-Ub或anti-His抗体进行杂交检测。
结果如图5显示：GmPUB8具有体外泛素连接酶活性。
实施例4 转GmPUB8基因拟南芥的获得
利用Invitrogen公司的Technology with ClonaseTM II试剂盒，将GmPUB8正向插入到表达载体pMDC83(图6)中，转化大肠杆菌DH5α，转化液涂布于含50mg/L潮霉素+50mg/L卡那霉素的LB固体培养基上筛选阳性克隆。经测序验证后，提取质粒，得pMDC83-GmPUB8植物过量表达载体(图6)。用热激法分别将pMDC83-GmPUB8转入根癌农杆菌菌株EHA105(Biovector Co.，LTD)中。拟南芥转化使用“floral dip”方法(Clough andBent，1998，The Plant Journal，16：735–743)。获得的T1代种子经次氯酸钠处理后，均匀涂布于添加 30mg/L潮霉素的1/2MS培养基，4℃春化3天后于19-23℃温室中萌发。待筛选培养基中拟南芥幼苗出现第一对真叶时移植到装满蛭石的小花盆内生长。
待筛选后的拟南芥长出多片叶子后提取RNA进行检测。RNA提取纯化及cDNA第一链合成同实施例1，具体步骤参照试剂盒说明书进行。反转录产物 cDNA第一链稀释10-20倍后利用各基因的引物对每个样品进行PCR扩增，以非转基因拟南芥植株作为阴性对照。根据GmPUB8基因序列设计半定量RT-PCR 检测引物GmPUB8-sPCR-F：5'-GAAGGCGCAGTTAATTTCCTAGC-3'(SEQ ID NO.11)，GmPUB8-sPCR-R：5'-CACCATCTCCTGCACCAAGC-3'(SEQ ID NO.12)；内参基因采用拟南芥UBC10基因(Czechowskiet al，2005，Plant Physiology，139：5–17)，引物序列为UBC10-F：5'-ATGGCGTCGAAGCGGATC-3' (SEQ ID NO.13)，UBC10-R：5'-TTAGCCCATGGCATACTTCTG-3'(SEQID NO.14)。方法如下：
用GmPUB8基因半定量RT-PCR检测上下游引物SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10进行PCR扩增，10μL PCR反应体系包括：5μL mix反应液，上、下游引物(5pmol)各1μL，模板2μL(大约含0.03μg)，加ddH2O 1μL。其程序为95℃变性4min；再94℃40sec，49.7℃30sec，72℃1min，共30个循环；然后72℃延伸10min；4℃保存。
上述PCR鉴定结果见图7，部分经潮霉素筛选获得的转基因植株表现出较强的目标基因表达。
实施例5 GmPUB8基因的功能验证
将鉴定出的GmPUB8转基因T2代种子和野生型拟南芥种子同时播种到栽培基质中，人工培养条件为：相对湿度80％，光照强度150μmol m-2s-1，温度 22-23℃；同时设置不同的光周期(长日照：16h光照/8h黑暗；中日照：12h 光照/12h黑暗；短日照：8h光照/16h黑暗)并观察其在不同光周期下生长表型(图8)。
结果可见：在长日照生长条件下，过量表达GmPUB8的转基因拟南芥相比于野生型具有明显的晚开花表型(图8)，开花时间推迟5d以上，开花时莲座叶片数较对照增加11片以上(图9)；在中日照和短日照生长条件下，过表达 GmPUB8拟南芥植株与对照组相比，开花比野生型植株早(图8)，开花时间分别提前9d和13d以上，开花时莲座叶片数较对照分别减少11片和13片以上 (图9)。

Claims (3)

1.SEQ ID NO.2 所示的大豆PUB类E3泛素连接酶GmPUB8在不同光周期下调控拟南芥开花时间方面的应用。
2.SEQ ID NO.2 所示的大豆PUB类E3泛素连接酶GmPUB8的编码基因在不同光周期下调控拟南芥开花时间方面的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，所述的大豆PUB类E3泛素连接酶GmPUB8开放阅读框核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
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