CN110093352B

CN110093352B - 一种与芹菜花青素合成相关的转录因子AgMYB1基因序列及其应用

Info

Publication number: CN110093352B
Application number: CN201810100013.4A
Authority: CN
Inventors: 熊爱生; 冯凯; 徐志胜
Original assignee: Nanjing Agricultural University
Current assignee: Nanjing Agricultural University
Priority date: 2018-01-29
Filing date: 2018-01-29
Publication date: 2022-05-10
Anticipated expiration: 2038-01-29
Also published as: CN110093352A

Abstract

R2R3‑MYB转录因子属于MYB转录因子家族，是植物中与花青素合成相关的转录因子。本发明从芹菜中克隆了一个新的R2R3‑MYB基因AgMYB1。该基因编码316个氨基酸，具有典型的R2R3结构域。荧光定量表达分析表明AgMYB1基因在紫色芹菜叶柄的表达量明显比在非紫色芹菜叶柄中的表达量高。过表达AgMYB1基因的转基因拟南芥与对照拟南芥相比植株颜色更深，花青素含量也更高。本发明利用RT‑PCR技术从芹菜中克隆得到AgMYB1基因，该基因能够提高植物的花青素含量。

Description

一种与芹菜花青素合成相关的转录因子AgMYB1基因序列及其应用

技术领域

本发明属于植物基因工程领域，涉及植物的一个MYB转录因子及应用。具体为从芹菜中克隆得到一个花青素合成相关的基因AgMYB1，该基因可以用于芹菜的花青素合成研究及应用。

背景技术

芹菜(Apium graveolens L.)是伞形科芹属一年或多年生草本植物，起源于非洲北部和欧洲南部地中海地带，在世界上广泛种植，是一种重要的蔬菜作物(Li et al.，CritRev Biotechnol 2018，38：172-183)。芹菜不仅营养价值丰富，还具有多种药用功效。‘六合黄心芹’为南京六合地区芹菜品种，抗逆性较强。‘南选六合紫芹’是从‘六合黄心芹’中选育得到，叶柄为紫色，富含丰富的花青素。

花青素是一种类黄酮代谢物，广泛存在于植物种子、花、果实和其他营养组织内(Li et al.，Plant Cell Rep 2016，35：2151-2165)。花青素在植物生长发育进程中具有重要作用，例如植物组织着色，吸引昆虫授粉，减少紫外线对植物的损伤等。影响花青素合成的主要有结构基因和调节基因两类。结构基因可以直接产生花青素生物合成途径中所需的酶。目前研究表明，参与调节花青素合成的基因主要包括MYB转录因子、bHLH转录因子和WD40蛋白，其中MYB转录因子对于花青素的合成通常具有关键作用(Gonzalez et al.，Plant J 2008，53：814-827)。MYB转录因子家族数量庞大，功能多样，广泛存在于真核生物中。花青素合成过程中，MBW复合体能够与靶基因的启动子结合，直接激活花青素合成途径中结构基因的转录(Jin et al.，Plant Biotechnol J 2016，14：2120-2133)。目前已经从许多植物中克隆得到花青素合成相关的MYB转录因子，MdMYB10表达水平的差异导致苹果的红色和绿色条纹的花青素含量不同(Telias et al.，BMC Plant Biol 2011，11：93)。

发明内容

本发明提供了一种芹菜转录因子AgMYB1基因制备方法和用途。所获得的AgMYB1基因有利于进一步了解紫色芹菜花青素合成机制，同时也能用于培育富含高花青素的植物。

附图说明

图1.芹菜AgMYB1蛋白与其他物种花青素合成相关MYB蛋白的序列比对。

图2.芹菜AgMYB1蛋白与其他物种MYB蛋白的进化分析。

图3.芹菜AgMYB1基因在不同品种芹菜中的表达分析。

图4.过表达AgMYB1基因拟南芥和对照拟南芥的表型差异及总花青素含量。

具体实施方式

1.植物材料：本发明所用植物材料为芹菜品种‘南选六合紫芹’和‘六合黄心芹’以及哥伦比亚野生型拟南芥，所有种子均保存于南京农业大学伞形科蔬菜作物遗传与种质创新实验室，植株均种植于南京农业大学作物遗传与种质创新国家重点实验室的人工气候室。

2.使用RNA simple Total RNA Kit(北京Tiangen公司)从‘南选六合紫芹’和‘六合黄心芹’的成熟叶柄提取总RNA。然后通过Prime Script RT reagent Kit(大连TaKaRa公司)将提取的芹菜总RNA反转成cDNA。

3.芹菜转录因子AgMYB1基因的克隆：将拟南芥AtMYB75(PAP1)的氨基酸序列在芹菜转录组数据库内进行检索，分析得到花青素合成相关的AgMYB1基因，并设计一对克隆引物。正向引物：5’-ATGAAGAGTGGCAACGCTTCAAAG-3’，反向引物：5’-TTAATTATCATCTGCTGGATTTAGA-3’。以‘南选六合紫芹’的cDNA为模板进行PCR扩增，PCR反应程序为：94℃ 5min；94℃ 30s，54℃ 30s，72℃ 65s，35个循环；72℃ 10min。通过12g·L^-1琼脂糖凝胶电泳分离PCR产物，回收后连接到pMD19-T载体(大连TaKaRa公司)，转化大肠杆菌DH5α后委托南京金斯瑞生物科技有限公司测序。

4.序列分析：通过测序得到芹菜转录因子AgMYB1基因的序列，并对其编码的氨基酸序列进行分析。通过Clustal X软件进行氨基酸的序列比对，利用MEGA 5.0软件绘制进化树。

5.实时定量PCR反应：利用Primer 6.0软件设计AgMYB1基因实时定量PCR试验引物，正向引物：5’-AACAGATGGTCACTAATCGGTGGAAG-3’，反向引物：5’-CAGCAGTAGTTGGAGCAATGTAACG-3’。按操作说明书利用SYBR Premix Ex Taq(大连TaKaRa公司)检测AgMYB1基因在两个芹菜品种叶柄中的表达量，选用芹菜AgTUB-B基因作为数据处理的内参基因(Li et al.，Front Plant Sci 2016，7：313.)，利用2^-ΔΔC _T方法计算AgMYB1基因在不同芹菜的相对表达值(Schmittgen et al.，Nat Protoc，2008，3：1101-1108)。

6.转基因载体构建和拟南芥转化：使用特异引物(正向：5′-TTTACAATTACCATGGGATCCATGTATCCAAAGGCTAAGAAGAGTA-3′，反向5′-ACCGATGATACGAACGAGCTCTTAATTATAGTCCCAGTTGAGAAGA-3′)扩增AgMYB1基因，然后构建到pCAMBIA-1301载体上。通过电击转化法将重组载体转化入农杆菌菌株GV3101，拟南芥侵染采用蘸花法完成(Zhang et al.，Nat Protoc2006，1：641-646)。本发明以含有pCAMBIA-1301空载体的拟南芥作为对照。

7.转基因拟南芥筛选和花青素含量测定：在含有35mg/L潮霉素的1/2MS培养基上筛选转基因拟南芥。生长期为4周时，对T2代转基因拟南芥和对照植株进行取样，并测定花青素含量。花青素含量测定方法参考之前的研究(Li et al.，Plant Physiol 2012，160(2)：1011-1022)。

8.试验结果：1).将本发明克隆得到的AgMYB1基因编码的蛋白序列与其他物种中R2R3-MYB转录因子进行序列比对并构建同源进化树，序列分析结果表明AgMYB1蛋白含有高度保守的R2R3结构域(图1)。进化分析显示AgMYB1蛋白与水芹的OjMYB1蛋白进化关系最近(图2)。2).荧光定量PCR试验结果表明，AgMYB1基因在不同品种芹菜的表达量有明显差异，在‘南选六合紫芹’的表达量是‘六合黄心芹’表达量的18倍左右(图3)。3).利用转基因技术得到过表达AgMYB1基因的拟南芥植株，转基因拟南芥与对照植株相比叶片的颜色更深。花青素含量测定结果显示，转基因拟南芥植株的总花青素含量明显比照植株花青素含量更高(图4)。

Claims

1.一种芹菜中获得的MYB转录因子基因AgMYB1，其核苷酸序列如SEQ IDNo 1所示。

2.一种制备权利要求1所述的源于芹菜的MYB类转录因子AgMYB1基因的方法，包括以下步骤：

1)设计克隆引物，正向引物：5’-ATGAAGAGTGGCAACGCTTCAAAG-3’，反向引物：5’-TTAATTATCATCTGCTGGATTTAGA-3’；

2)通过PCR方法从芹菜中克隆AgMYB1转录因子基因。

3.一种研究权利要求1所述的芹菜MYB类转录因子AgMYB1基因功能的方法，其特征在于，具体步骤如下：

1)采用荧光定量PCR方法，检测不同品种芹菜的MYB类转录因子AgMYB1基因的转录水平；

2)通过转基因技术在拟南芥中过表达AgMYB1基因，验证该芹菜转录因子具有提高植物花青素含量的作用。

4.权利要求1所述的芹菜MYB转录因子AgMYB1基因在提高植物花青素含量中的应用。