KR102090157B1 - 식물체의 초장, 종자 크기 및 출수기를 조절하는 야생벼 유래 apx9 유전자 및 이의 용도 - Google Patents

Abstract

본 발명은 식물체의 초장, 종자 크기 및 출수기를 조절하는 야생벼(Oryza rufipogon) 유래 APX9(L-ascorbate peroxidase 9) 유전자 및 이의 용도에 관한 것이다.

Description

식물체의 초장, 종자 크기 및 출수기를 조절하는 야생벼 유래 APX9 유전자 및 이의 용도{APX9 gene derived from Oryza rufipogon controlling plant height, seed size and heading date and uses thereof}

본 발명은 식물체의 초장, 종자 크기 및 출수기를 조절하는 야생벼(Oryza rufipogon) 유래 APX9(L-ascorbate peroxidase 9) 유전자 및 이의 용도에 관한 것이다.

벼는 화본과에 속하는 1년생 초본식물로, 밀 다음으로 생산량이 많아 세계 인구의 약 50%가 주식으로 이용하고 있다. 오늘날 재배벼 식물 품종은 곡립이 크고 많이 수확할 수 있도록 계속적으로 품종을 개량해 신품종 식물을 보급해 왔기 때문에 단위당 수량은 대단히 많아진 반면, 각종 병충해에 대한 저항성은 일반적으로 감소하였다. 반면, 야생벼에는 도열병과 같은 곰팡이병 저항성과 벼멸구와 같은 충해 저항성 유전자가 다수 존재하는 것으로 알려져 있어 재배벼로 유용 유전자를 도입할 수 있는 중요한 유전자원의 보고라 할 수 있다.

야생벼는 많은 수의 유용한 농업형질을 가지고 있을 뿐만 아니라, 다양한 유전적 다양성을 가지고 있다. 중요한 생식질(germplasm)인 오리자 루피포곤(Oryza rufipogon)은 넓은 유전적 다양성으로 인해 특별히 가치있는 것으로 알려져 있다. 야생종의 AA 게놈으로부터 유용한 유전자의 전달의 성공적인 시험이 다수 보고되었다. 이전의 연구에서, 오리자 루피포곤으로부터 유래한 QTL(quantitative trait loci)이 생산량 증대와 연관되어 있음이 보고되었다(Xiao et al., (1996) Nature 384:223-224). 또한, 오리자 루피포곤의 다년생 생태형으로부터 유래한 세포질웅성불임성(cytoplasmic male sterility, CMS), 및 생산량 형질 관련 QTL의 침투교잡(introgression)이 보고된 바 있다. 최신 기술의 발전과 함께, NIL(near isogenic line)의 개발은 현대 벼 육종 프로그램에 있어서 중요한 방안을 제공해준다.

Ascorbate peroxidase (이하, APX) 단백질은 페록시다아제(peroxidase)를 포함하는 헴(Heme) 단백질 패밀리로, 다양한 유기분자의 과산화수소 의존적 산화를 촉매한다. APX 단백질은 식물계의 넓은 영역에 걸쳐 존재하고, 생장 조절에 중요한 역할을 한다. APX 단백질은 환원력의 소스로 아스코르브산염(ascorbate)에 의존하고, 아스코르브산염의 부재시 불안정해지는 점에서 다른 페록시다아제와 다르다. APX 단백질은 과산화수소 제거를 책임지는 주요 효소이며, 식물 세포의 세포질, 미토콘드리아, 엽록체 및 마이크로바디(peroxisome 및 glyoxisome 포함)에서 발견된다.

벼에서 APXs는 8개의 유전자로 이루어진 유전자 패밀리에 의해 암호화되어 있고, OsAPX1 및 OsAPX2는 세포질에, OsAPX3 및 OsAPX4는 퍼옥시좀(peroxisome)에, OsAPX6은 미토콘드리아에, OsAPX7 및 OsAPX8은 엽록체에, 그리고 OsAPX5는 미토콘드리아/엽록체에 위치한다. 또한, 신규의 ascorbate peroxidase related 패밀리에 속하는 유전자의 추가 그룹(OsAPx-R)이 단일 카피 유전자에 의해 암호화되어 있다. APx-R 단백질은 엽록체와 미토콘드리아를 이중으로 표적한다. APXs의 발현은 가뭄, 염, 온도 또는 산화적 스트레스와 같은 다양한 환경 스트레스에 의해 조절된다.

한편, 한국등록특허 제0924923호에는 '야생 벼로부터 분리된 OgPAE1 유전자 및 상기 유전자 산물에 의한 병 저항성'이 개시되어 있고, 한국등록특허 제1376520호에는 '벼 유래의 OsPrMC3 유전자를 이용한 바이오매스 또는 종자 생산량이 조절된 형질전환 식물체의 제조방법 및 그에 따른 식물체'가 개시되어 있으나, 본 발명의 식물체의 초장, 종자 크기 및 출수기를 조절하는 야생벼 유래 APX9 유전자 및 이의 용도에 대해서는 기재된 바가 없다.

본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명자들은 화성벼와 야생벼(Oryza rufipogon)간의 교배로 얻어진 BC₄F₇ 근동질 계통(near isogenic line, NIL)과 반복친(화성벼) 간의 농업적 형질을 조사한 결과, NIL이 화성벼에 비해 초장 및 종자 크기가 유의적으로 증가하였으며, 장일조건에서 출수기가 화성벼에 비해 지연됨을 확인하였다. 고밀도 유전자 지도를 이용하여 상기 형질 차이에 관여하는 후보유전자를 알아본 결과, NIL에서 화성벼의 유전적 배경에 야생벼의 단편이 9번 염색체의 RM215-CNR113 사이에서 탐지되었으며, 상기 표지인자 사이의 지역에서 LOC_Os09g36730 (MYB; MYB transcription factor), LOC_Os09g36735 (expressed protein), LOC_Os09g36740 (Ms5; male sterility 5) 및 LOC_Os09g36750 (APX9; L-ascorbate peroxidase 9)의 총 4종의 후보 유전자가 확인되었다. 화성벼와 NIL에서 상기 후보 유전자들의 발현 수준을 분석한 결과, APX9 유전자만이 화성벼에 비해 NIL의 조직에서 높은 수준으로 발현되는 것이 관찰되었다.

본 발명자들은 APX9 유전자의 기능을 규명하기 위해, 야생벼의 APX9 유전자를 과발현하는 형질전환체(화성벼)를 제조하였고, 화성벼, NIL, 및 형질전환체의 초장, 종자 형태 및 출수기를 비교하였다. 그 결과, OrAPX9 과발현체가 화성벼에 비해 초장과 종자 크기가 증가하였고, 출수가 지연되는 것으로 관찰되어, 야생벼 유래 APX9 유전자가 벼의 초장, 종자 크기 및 출수기 조절에 관여함을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.

상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진, 야생벼(Oryza rufipogon) 유래의 식물체의 초장, 종자 크기 및 출수기를 조절하는 APX9(L-ascorbate peroxidase 9) 단백질 및 상기 APX9 단백질을 코딩하는 유전자를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 재조합 벡터로 형질전환된 숙주세포를 제공한다.

또한, 본 발명은 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 야생벼 유래 APX9 단백질 코딩 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 식물 세포를 형질전환하는 단계; 및 상기 형질전환된 식물 세포로부터 형질전환 식물을 재분화하는 단계를 포함하는 초장, 종자 크기 및 출수기가 조절된 형질전환 식물체의 제조 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 방법에 의해 제조된 초장, 종자 크기 및 출수기가 조절된 형질전환 식물체 및 이의 형질전환된 종자를 제공한다.

또한, 본 발명은 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 야생벼 유래 APX9 단백질 코딩 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 식물 세포를 형질전환시켜 APX9 단백질 코딩 유전자의 발현을 조절하는 단계를 포함하는, 식물체의 초장, 종자 크기 및 출수기를 조절하는 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 야생벼 유래 APX9 단백질 코딩 유전자를 유효성분으로 포함하는, 식물체의 초장, 종자 크기 및 출수기 조절용 조성물을 제공한다.

본 발명의 야생벼(Oryza rufipogon) 유래 APX9(L-ascorbate peroxidase 9) 유전자는 중요한 농업적 형질인 식물체의 초장, 종자 크기 및 출수기 조절과 관련되어 있으므로, 신품종 벼 육종에 유용하게 활용될 수 있고, 자포니카 벼 순화 연구에 유용하게 사용될 수 있을 것이다.

도 1은 BC₄F₇ 집단의 개발 모식도이다.
도 2는 pUBI-APX9^Or 벡터맵이다. ZmUBQ P: Zea mays ubiquitin constitutive promoter, NOS polyA: nopaline synthase terminator, 35S P: cauliflower mosaic virus 35S promoter, Bar: selectable marker, 35S polyA: cauliflower mosaic virus 35S terminator, LB: left border, RB: right borer.
도 3은 화성벼와 NIL의 초장 및 절간장 비교 결과이다. scale bar = 30 cm, n=7, *: P < 0.05, **: P < 0.01.
도 4는 화성벼와 NIL의 낟알 크기 및 lemma inner-epidermal 세포를 비교한 결과이다. n=12, **: P < 0.01.
도 5는 BC₄F₇ NIL의 9번 염색체에 이입된 영역의 맵으로, 흰색과 검은색 영역은 각각 동형의 화성벼와 동형의 오리자 루피포곤(O. rufipogon) 서열을 의미한다. 회색 빗금은 염색체의 교차가 일어난 부위를 나타낸다.
도 6은 화성벼와 오리자 루피포곤 사이의 후보 유전자 서열 비교 결과이다. 흰색 박스는 5' 또는 3' UTR을, 검은색 박스 및 검은색 박스 사이의 실선은 각각 엑손과 인트론을, 화살표는 미스센스 돌연변이를 야기한 염기 치환을 나타낸다.
도 7은 OsMYB, OsMs5 및 OsAPX9 유전자의 semi-quantitative RT-PCR 수행 결과이다.
도 8은 APX 유전자 패밀리의 발현 경향을 분석한 것으로, qRT-PCR 결과이다. 1st pn: panicle 15 days before flowering, 2nd pn: panicle 10 days before flowering, 3rd pn: panicle at flowering day, 4th pn: panicle 10 days after flowering, 5th pn: panicle 15 days after flowering.
도 9는 애기장대 및 벼의 APXs 유전자 패밀리 단백질의 계통수와 아미노산 서열 정렬 결과이다. 빨간색 박스: 활성 자리, 파란색 박스: 헴(Heme) 결합 자리, 녹색 박스: 페록시다아제 모티프, 검음색 박스: 퍼옥시좀 표적화 서열.
도 10은 화성벼와 NIL의 항산화 활성을 측정한 것으로, (A)는 3,3'-DAB 염색 결과이고, (B)는 DPPH 라디칼 소거능 실험 결과이며, (C)는 APX 활성을 특정한 효소 실험 결과이다. black bar = 5 mm, *: P < 0.05, **: P < 0.01.
도 11 및 도 12는 각각 NLD(natural long day) 및 LD(long day) 조건에서 생장시킨 화성벼와 NIL의 개화 시기 및 개화 관련 유전자의 발현 패턴을 분석한 결과이다.
도 13은 T₀ 식물체에서 APX9 ^Or 유전자의 발현을 분석한 결과이다.
도 14는 화성벼, NIL 및 APX9 ^Or 과발현 식물체(OX #23)의 초장을 비교한 결과이다. n=10, *: P < 0.05, **: P < 0.01.
도 15는 화성벼, NIL 및 APX9 ^Or 과발현 식물체(OX #23)의 출수기를 비교한 결과이다. n=20, *: P < 0.05, **: P < 0.01.
도 16은 화성벼, NIL 및 APX9 ^Or 과발현 식물체(OX #23)의 종자(낟알) 특징을 비교한 결과이다. n=12, *: P < 0.05, **: P < 0.01.

본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진, 야생벼(Oryza rufipogon) 유래의 식물체의 초장, 종자 크기 및 출수기를 조절하는 APX9(L-ascorbate peroxidase 9) 단백질을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 APX9 단백질을 코딩하는 유전자를 제공한다. 본 발명의 상기 APX9 단백질을 코딩하는 유전자는 서열번호 1의 염기서열을 포함할 수 있다. 또한, 상기 염기서열의 상동체가 본 발명의 범위 내에 포함된다. 구체적으로, 상기 유전자는 서열번호 1의 염기서열과 각각 70% 이상, 더욱 바람직하게는 80% 이상, 더 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 가지는 염기 서열을 포함할 수 있다. 폴리뉴클레오티드에 대한 "서열 상동성의 %"는 두 개의 최적으로 배열된 서열과 비교 영역을 비교함으로써 확인되며, 비교 영역에서의 폴리뉴클레오티드 서열의 일부는 두 서열의 최적 배열에 대한 참고 서열(추가 또는 삭제를 포함하지 않음)에 비해 추가 또는 삭제(즉, 갭)를 포함할 수 있다.

본 발명은 또한, 상기 야생벼 유래 APX9 단백질 코딩 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다.

용어 "재조합"은 세포가 이종의 핵산을 복제하거나, 상기 핵산을 발현하거나 또는 펩티드, 이종의 펩티드 또는 이종의 핵산에 의해 암호된 단백질을 발현하는 세포를 지칭하는 것이다. 재조합 세포는 상기 세포의 천연 형태에서는 발견되지 않는 유전자 또는 유전자 절편을, 센스 또는 안티센스 형태 중 하나로 발현할 수 있다. 또한 재조합 세포는 천연 상태의 세포에서 발견되는 유전자를 발현할 수 있으며, 그러나 상기 유전자는 변형된 것으로서 인위적인 수단에 의해 세포 내 재도입된 것이다.

용어 "벡터"는 세포 내로 전달하는 DNA 단편(들), 핵산 분자를 지칭할 때 사용된다. 벡터는 DNA를 복제시키고, 숙주세포에서 독립적으로 재생산될 수 있다. 용어 "전달체"는 흔히 "벡터"와 호환하여 사용된다. 용어 "발현 벡터"는 목적한 코딩 서열과, 특정 숙주 생물에서 작동가능하게 연결된 코딩 서열을 발현하는데 필수적인 적정 핵산 서열을 포함하는 재조합 DNA 분자를 의미한다.

본 발명의 벡터는 전형적으로 클로닝 또는 발현을 위한 벡터로서 구축될 수 있다. 또한, 본 발명의 벡터는 원핵 세포 또는 진핵 세포를 숙주로 하여 구축될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 벡터가 발현 벡터이고, 원핵 세포를 숙주로 하는 경우에는, 전사를 진행시킬 수 있는 강력한 프로모터 (예컨대, pLλ프로모터, trp 프로모터, lac 프로모터, T7 프로모터, tac 프로모터 등), 해독의 개시를 위한 리보좀 결합 자리 및 전사/해독 종결 서열을 포함하는 것이 일반적이다. 숙주 세포로서 대장균(Escherichia coli)이 이용되는 경우, E. coli 트립토판 생합성 경로의 프로모터 및 오퍼레이터 부위, 그리고 파아지 λ의 좌향 프로모터 (pLλ프로모터)가 조절 부위로서 이용될 수 있다.

한편, 본 발명에 이용될 수 있는 벡터는 당업계에서 종종 사용되는 플라스미드 (예: pSC101, ColE1, pBR322, pUC8/9, pHC79, pGEX 시리즈, pET 시리즈 및 pUC19 등), 파지 (예: λgt4·λB, λ-Charon, λΔz1 및 M13 등) 또는 바이러스 (예: SV40 등)를 조작하여 제작될 수 있다.

한편, 본 발명의 벡터가 발현 벡터이고, 진핵 세포를 숙주로 하는 경우에는, 포유동물 세포의 게놈으로부터 유래된 프로모터 (예: 메탈로티오닌 프로모터) 또는 포유동물 바이러스로부터 유래된 프로모터 (예: 아데노바이러스 후기 프로모터, 백시니아 바이러스 7.5K 프로모터, SV40 프로모터, 사이토메갈로바이러스 프로모터 및 HSV의 tk 프로모터)가 이용될 수 있으며, 전사 종결 서열로서 폴리아데닐화 서열을 일반적으로 갖는다.

본 발명의 재조합 벡터는 바람직하게는 식물 발현 벡터이다.

식물 발현 벡터의 바람직한 예는 아그로박테리움 튜머파시엔스 (Agrobacterium tumefaciens)와 같은 적당한 숙주에 존재할 때 그 자체의 일부, 소위 T-영역을 식물 세포로 전이시킬 수 있는 Ti-플라스미드 벡터이다. 다른 유형의 Ti-플라스미드 벡터 (EP 0 116 718 B1호 참조)는 현재 식물 세포, 또는 잡종 DNA를 식물의 게놈 내에 적당하게 삽입시키는 새로운 식물이 생산될 수 있는 원형질체로 잡종 DNA 서열을 전이시키는데 이용되고 있다. Ti-플라스미드 벡터의 특히 바람직한 형태는 EP 0 120 516 B1호 및 미국 특허 제4,940,838호에 청구된 바와 같은 소위 바이너리(binary) 벡터이다. 본 발명에 따른 유전자를 식물 숙주에 도입시키는데 이용될 수 있는 다른 적합한 벡터는 이중 가닥 식물 바이러스 (예를 들면, CaMV) 및 단일 가닥 바이러스, 게미니 바이러스 등으로부터 유래될 수 있는 것과 같은 바이러스 벡터, 예를 들면 비완전성 식물 바이러스 벡터로부터 선택될 수 있다. 그러한 벡터의 사용은 특히 식물 숙주를 적당하게 형질전환 하는 것이 어려울 때 유리할 수 있다.

발현 벡터는 바람직하게는 하나 이상의 선택성 마커를 포함한다. 상기 마커는 통상적으로 화학적인 방법으로 선택될 수 있는 특성을 갖는 핵산 서열로, 형질전환된 세포를 비형질전환 세포로부터 구별할 수 있는 모든 유전자가 이에 해당된다. 그 예로는 글리포세이트(glyphosate) 또는 포스피노트리신(포스피노트리신)과 같은 제초제 저항성 유전자, 카나마이신, G418, 블레오마이신(Bleomycin), 하이그로마이신(hygromycin), 클로람페니콜(chloramphenicol)과 같은 항생제 내성 유전자가 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명에 따른 식물 발현 벡터에서, 프로모터는 SRPP(small rubber particle-associated protein), CaMV 35S, 액틴, 유비퀴틴, pEMU, MAS 또는 히스톤 프로모터일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. "프로모터"란 용어는 구조 유전자로부터의 DNA 업스트림의 영역을 의미하며 전사를 개시하기 위하여 RNA 폴리머라아제가 결합하는 DNA 분자를 말한다. "식물 프로모터"는 식물 세포에서 전사를 개시할 수 있는 프로모터이다. "구성적(constitutive) 프로모터"는 대부분의 환경 조건 및 발달 상태 또는 세포 분화하에서 활성이 있는 프로모터이다. 형질전환체의 선택이 각종 단계에서 각종 조직에 의해서 이루어질 수 있기 때문에 구성적 프로모터가 본 발명에서 바람직할 수 있다. 따라서, 구성적 프로모터는 선택 가능성을 제한하지 않는다.

본 발명에 따른 식물 발현 벡터에서, 터미네이터는 통상의 터미네이터를 사용할 수 있으며, 그 예로는 노팔린합성효소(nopaline synthase, NOS), 벼 α-아밀라아제 RAmy1 A 터미네이터, 파세올린(phaseoline) 터미네이터, 아그로박테리움 튜머파시엔스의 옥토파인(Octopine) 유전자의 터미네이터 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명은 또한, 본 발명의 상기 재조합 벡터로 형질전환된 숙주세포를 제공한다.

본 발명의 벡터를 안정되면서 연속적으로 클로닝 및 발현시킬 수 있는 숙주세포는 미세조류, 미생물 등을 포함한 당업계에 공지된 어떠한 숙주세포도 이용할 수 있으며, 예컨대, E. coli JM109, E. coli BL21, E. coli RR1, E. coli LE392, E. coli B, E. coli X 1776, E. coli W3110, 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 바실러스 츄린겐시스(B. thuringiensis)와 같은 바실러스 속 균주, 그리고 살모넬라 티피무리움(Salmonella typhimurium), 세라티아 마르세슨스(Serratia marcescens) 및 다양한 슈도모나스 종과 같은 장내균과 균주 등이 있다.

또한, 본 발명의 벡터를 진핵 세포에 형질전환시키는 경우에는 숙주세포로서, 효모 (예컨대, Saccharomyce cerevisiae), 곤충세포, 사람세포 (예컨대, CHO 세포주(Chinese hamster ovary), W138, BHK, COS-7, 293, HepG2, 3T3, RIN 및 MDCK 세포주) 및 식물세포 등이 이용될 수 있으며, 바람직하게는 식물 세포이다.

본 발명의 벡터를 숙주세포 내로 운반하는 방법은, 숙주 세포가 원핵 세포인 경우, CaCl₂ 방법, 하나한 방법 (Hanahan, D., J. Mol. Biol., 166:557-580(1983)) 및 전기천공 방법 등에 의해 실시될 수 있다. 또한, 숙주세포가 진핵세포인 경우에는, 미세주입법, 칼슘포스페이트 침전법, 전기천공법, 리포좀-매개 형질감염법, DEAE-덱스트란 처리법, 및 유전자 밤바드먼트 등에 의해 벡터를 숙주세포 내로 주입할 수 있다.

본 발명은 또한,

서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 야생벼 유래 APX9(L-ascorbate peroxidase 9) 단백질 코딩 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 식물 세포를 형질전환하는 단계; 및

상기 형질전환된 식물 세포로부터 형질전환 식물을 재분화하는 단계를 포함하는 초장, 종자 크기 및 출수기가 조절된 형질전환 식물체의 제조 방법을 제공한다.

식물의 형질전환은 DNA를 식물에 전이시키는 임의의 방법을 의미한다. 그러한 형질전환 방법은 반드시 재생 및(또는) 조직 배양 기간을 가질 필요는 없다. 식물 종의 형질전환은 이제는 쌍자엽 식물뿐만 아니라 단자엽 식물 양자를 포함한 식물 종에 대해 일반적이다. 원칙적으로, 임의의 형질전환 방법은 본 발명에 따른 잡종 DNA를 적당한 선조 세포로 도입시키는데 이용될 수 있다. 방법은 원형질체에 대한 칼슘/폴리에틸렌 글리콜 방법, 원형질체의 전기천공법, 식물 요소로의 현미주사법, 각종 식물 요소의 (DNA 또는 RNA-코팅된) 입자 충격법, 식물의 침윤 또는 성숙 화분 또는 소포자의 형질전환에 의한 아그로박테리움 투머파시엔스 매개된 유전자 전이에서 (비완전성) 바이러스에 의한 감염 등으로부터 적당하게 선택될 수 있다. 본 발명에 따른 바람직한 방법은 아그로박테리움 매개된 DNA 전달을 포함한다. 특히 바람직한 것은 EP A 120 516호 및 미국 특허 제4,940,838호에 기재된 바와 같은 소위 이원 벡터 기술을 이용하는 것이다.

본 발명의 방법은 본 발명에 따른 재조합 벡터로 식물 세포를 형질전환하는 단계를 포함하는데, 상기 형질전환은 아그로박테리움 튜머파시엔스(A. tumefiaciens)에 의해 매개될 수 있다. 또한, 본 발명의 방법은 상기 형질전환된 식물 세포로부터 형질전환 식물을 재분화하는 단계를 포함한다. 형질전환 식물 세포로부터 형질전환 식물을 재분화하는 방법은 당업계에 공지된 임의의 방법을 이용할 수 있다.

식물의 형질전환에 이용되는 "식물 세포"는 어떤 식물 세포도 된다. 식물 세포는 배양 세포, 배양 조직, 배양 기관 또는 전체 식물, 바람직하게는 배양 세포, 배양 조직 또는 배양 기관 및 더욱 바람직하게는 배양 세포의 어떤 형태도 된다. "식물 조직"은 분화된 또는 미분화된 식물의 조직, 예를 들면 이에 한정되진 않으나, 열매, 줄기, 잎, 꽃가루, 종자, 암 조직 및 배양에 이용되는 다양한 형태의 세포들, 즉 단일 세포, 원형질체(protoplast), 싹 및 캘러스 조직을 포함한다. 식물 조직은 인 플란타(in planta)이거나 기관 배양, 조직 배양 또는 세포 배양 상태일 수 있다.

본 발명의 일 구현 예에 따른 형질전환 식물체의 제조 방법에 있어서, 상기 형질전환된 식물 세포에서 야생벼 유래 APX9 단백질 코딩 유전자의 발현을 증가시키면 비형질전환 식물체에 비해 초장 및 종가 크기가 증가되고 출수가 지연되는 형질전환 식물체를 제조할 수 있다.

본 발명은 또한, 본 발명의 상기 제조 방법에 의해 제조된 초장, 종자 크기 및 출수기가 조절된 형질전환 식물체 및 이의 형질전환된 종자를 제공한다.

전술한 것과 같이, 본 발명의 형질전환 식물체는 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 야생벼 유래 APX9 단백질 코딩 유전자의 발현이 증가된 경우에는 초장 및 종자 크기가 증가되고 출수가 지연되는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 일 구현 예에 있어서, 상기 식물체는 벼, 보리, 밀, 호밀, 옥수수, 사탕수수, 귀리, 양파 등의 단자엽 식물 또는 애기장대, 감자, 가지, 담배, 고추, 토마토, 우엉, 쑥갓, 상추, 도라지, 시금치, 근대, 고구마, 샐러리, 당근, 미나리, 파슬리, 배추, 양배추, 갓무, 수박, 참외, 오이, 호박, 박, 딸기, 대두, 녹두, 강낭콩, 완두 등의 쌍자엽 식물일 수 있고, 바람직하게는 벼 식물체일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명은 또한, 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 야생벼 유래 APX9(L-ascorbate peroxidase 9) 단백질 코딩 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 식물 세포를 형질전환시켜 야생벼 유래 APX9 단백질 코딩 유전자의 발현을 조절하는 단계를 포함하는, 식물체의 초장, 종자 크기 및 출수기를 조절하는 방법을 제공한다.

본 발명의 일 구현 예에 따른 식물체의 초장, 종자 크기 및 출수기 조절 방법에 있어서, 상기 야생벼 유래 APX9 단백질 코딩 유전자의 발현이 증가된 경우에는 초장 및 종자 크기가 증가되고 출수가 지연될 수 있다.

본 발명은 또한, 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 야생벼 유래 APX9(L-ascorbate peroxidase 9) 단백질 코딩 유전자를 유효성분으로 포함하는, 식물체의 초장, 종자 크기 및 출수기 조절용 조성물을 제공한다. 본 발명의 조성물은 유효성분으로 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 야생벼 유래 APX9 단백질 코딩 유전자를 함유하며, 상기 유전자 또는 상기 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 식물 세포를 형질전환시킴으로써, 식물체 초장 또는 종자 크기 및 출수기를 조절할 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

재료 및 방법

1. 식물체 재료 및 집단 개발

이전의 보고에서 생산량과 연관된 QTL인 gw9.1가 오리자 사티바(Oryza sativa) 화성벼와 오리자 루피포곤(O. rufipogon) 간의 종간교배로부터 유래된 BC₃F₄ 계통의 9번 염색체 RM242와 RM215 사이에서 확인되었다. 단일 BC₃F₄와 화성벼간의 추가 교배를 통해 2,000개 F₂ 식물체의 분리 집단을 생산하였다. 상기 식물체들을 SSR(simple sequence repeat) 마커를 이용하여 스크리닝하고, RM215 및 CNR113에 접한 오리자 루피포곤 단편을 가진 2개의 재조합 BC₄F₂ 식물체를 선별한 후 BC₄F₇ 세대로 진전시켰다(도 1). 화성벼와 한 개의 NIL을 주요 재료 및 필드에서 경작용으로 사용하였다. Semi-quantitative RT-PCR을 위해서 화성벼와 NIL을 토양 또는 2% 수크로오스를 포함하며 pH가 5.8로 조정된 MS(Murashige & Skoog) 배지에 재배하였다. 개화 관련 유전자의 발현 분석을 위해, 화성벼와 NIL의 종자를 포트에 식재하고, 장일 조건(14시간 명기, 28℃, 70% 습도/10시간 암기, 25℃, 50% 습도)의 생장 챔버에서 재배하였다.

2. 필드 재배 및 형질 검정

2017년, 화성벼와 NIL의 27일령 유묘를 충남대학교 시험포장에 옮겨심었다. 필드 실험은 난괴법(randomized block design)으로 3반복 수행하였다. 식물체간 재식 및 열 간격은 각각 15 cm 및 30 cm로 하였다. 각 열의 중간 부위로부터 10개의 식물체로부터 다음 특징들을 기록하여 결과를 수집하였다: 초장(plant height), 절간장(internode length), 이삭 길이(panicle length), 출수기(days to heading), SPP(spikelets per panicle) 수, 낟알길이(grain length), 낟알너비(grain width) 및 천립중(1,000-grain weight). 초장은 지표부터 화서 끝(panicle tip)까지의 길이로 측정하였고, 절간장은 식물체를 뿌리채 뽑고 각 절간 간격을 측정하였으며, 이삭의 수는 각 식물체당 이삭의 수로 계산하였으며, 출수기는 각 식물체에서 끝잎엽초(flag leaf sheath)로부터 이삭 끝의 출현시기로 계산하였으며, SPP는 식물체 당 3개의 주요 화서의 평균으로 측정하였으며, 낟알 길이 및 너비는 식물체 당 60개의 낟알(현미)을 150 mm Vernier caliper (Mitutoyo Corp., Japan)를 이용하여 측정하였다. 천립중은 100개의 현미를 사용하여 3반복으로 측정하였다.

3. 후보 유전자의 전사체 수준 분석

총 RNA는 벼 식물체의 다양한 조직(2주령 유묘, 2주령 유묘의 뿌리, 출수 약 25일전 식물체의 끝잎, 5 mm 크기의 이삭)으로부터 plant RNA Purification Reagent (Invitrogen, USA)를 사용하여 추출하였다. 추출한 RNA (1 ㎍)를 PrimeScript High Fidelity RT-PCR Kit (TaKaRa, Japan)를 이용하여 cDNA로 합성하였다. MYB transcription factor(OsMYB), male sterility 5(OsMs5) 및 L-ascorbate peroxidase 9(OsAPX9) 유전자의 발현 패턴을 분석하기 위해서, 표 1에 개시된 프라이머 세트를 이용하여 semi-quantitative RT-PCR을 수행하였다. PCR 반응은 1 ㎕의 cDNA와 유전자 특이적 프라이머 세트 및 EmeraldAmp GT PCR Master Mix (TaKaRa)를 이용하였고, 반응 조건은 하기와 같다: 초기 변성 98℃, 2분; [98℃, 10초 → 55℃, 15초 → 72℃, 20초](25 반복); 72℃, 7분. 벼 유비퀴틴 유전자를 대조군으로 사용하였다.

RT-PCR용 프라이머 세트

Primers for semi-quantitative RT-PCR
Gene	Primer sequence (5'→3')	서열번호
OsMYB	F) GAACGGACAACGAGATCAAGAA	3
	R) GCCTCGAATGATATGGTGATGT	4
OsMs5	F) ACCAGATCTCGCTGCTCAAG	5
	R) GTCTGGTTGCTTCTTGCTCC	6
OsAPX9	F) GAAGAAAGGGAAAGGCACATCC	7
	R) GCCGTTGAACCATCTGATTTTG	8
OsUbiquitin	F) GTCCTCAGCCATGGAGC	9
	R) GGACACAATGATTAGGG	10
Primers for quantitative real time PCR
Gene	Primer sequence (5'→3')	서열번호
OsGI	F) TGGAGAAAGGTTGTGGATGC	11
	R) GATAGACGGCACTTCAGCAGAT	12
OsHd1	F) AACCAAGATCGGCAGTATGG	13
	R) GATTGATTGCTCCAGCAGGT	14
OsMADS51	F) GTTTGCTCTGCTCCTACTC	15
	R) ACTCCTCCTCCAGCATTGAA	16
OsId1	F) CCTCTTCTCCAGGAAGGACA	17
	R) GCTGCTGGTGATCAGAAGATT	18
OsEhd1	F) GTTGCCAGTCATCTGCAGAA	19
	R) GGATGTGGATCATGAGACAT	20
OsGhd7	F) ATATTGTGGGAGCACGTT	21
	R) ATCTGAACCATTGTCCAAGC	22
OsHd3a	F) AGCCCAAGTGACCCTAACCT	23
	R) GTTGTAGAGCTCGGCGAAGT	24
OsRFT1	F) TGACCTAGATTCAAAGTCTAATCCTT	25
	R) TGCCGGCCATGTCAAATTAATAAC	26
OsAPX1	F) ATACCCACCATCTCCTACGCC	27
	R) GTCAGAACCCTTGGTAGCATCA	28
OsAPX2	F) CCGACGGTGAGCGATGAGT	29
	R) CGAAGGTGCCAGCAGAGTG	30
OsAPX3	F) GGATTTGATGGTGCCTGGAC	31
	R) CATAGCGGCGGAATGTAGGA	32
OsAPX4	F) CGGGCACTTATGACGTGAAC	33
	R) CAGCATATGTGATCTTAGGG	34
OsAPX5	F) AGGCGTTATTCTTGGTCATTCC	35
	R) CATCAGCAACATCAGCCCTTC	36
OsAPX6	F) CCAGCCCATCAAAGACAAGC	37
	R) CAGCCACATCAACCCTTCCATA	38
OsAPX7	F) GTGGGCAATCGTGGACAGC	39
	R) TGCTTCTTGGTCCTCTGCGTAT	40
OsAPX8	F) CGGAGCCAATGCTGGTCTG	41
	R) CACTTGCCAACTGGAACAAATCA	42
OsUBQ5	F) GAAGTAAGGAAGGAGGAGGA	43
	R) AAGGTGTTCAGTTCCAAGG	44

PCR 산물은 2.5% 아가로스 겔에 전개시켜 확인하였으며, 각 유전자의 전사체 수준 분석을 위해 밴드 강도의 정량화는 OPTINITY, Digital Gel Documentation System (GDS200, Korea Lab Tech, Korea)을 사용하여 분석하였다.

4. 아미노산 서열에 기반한 APXs의 계통발생 분석

벼 APXs 단백질의 아미노산 서열을 NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/guide) 및 RAP-DB (http://rapdb.dna.affrc.go.jp)에서 다운로드받아 ClustalW를 사용하여 서열 정렬을 수행하고, MegAlign을 이용하여 계통도를 작성하였다.

5. 개화시기와 관련된 유전자의 발현 분석

장일(LD) 조건에서 개화와 관련된 유전자의 발현 프로파일을 분석하기 위해서, LD 조건에서 생장시킨 화성벼와 NIL 식물체의 잎새를 50, 53 및 66 DAG(days after germination)의 ZT (zeitgeber) 2시간 및 14시간째에 샘플링하였다. 또한, NLD(natural long day) 조건에서 생장시킨 화성벼와 NIL 식물체의 잎새를 80, 83 및 86 DAG의 점심 시간에 샘플링하였다. 총 RNA는 RNAiso Plus (TaKaRa)를 이용하여 추출하였으며, 추출한 총 RNA의 1 ㎍을 이용하여 cDNA를 합성하였다. 모든 실험은 각 조건에서 4개의 시료를 이용하여 최소 3반복으로 수행되었으며, 프라이머 세트의 정보는 상기 표 1과 같다. 발현 변화는 ΔΔCt (Livak and Schmittgen, (2001) Methods 25:402-408) 방법을 이용하여 계산하였다.

6. APX9 ^Or 과발현체의 제조

APX9 ^Or 과발현 식물체를 제조하기 위해서, T-Blunt™ PCR Cloning Kit (Solgent, Korea)를 이용하여 서브클로닝하였다. 첫 번째 단계는 제한효소 자리를 포함하는 유전자 특이적 프라이머 세트(Fw_BamHI-APX9: 5'-GGGATCCCGTCAATGGTTCTTTAATAAAT-3', 서열번호 45; Rv_SacI-APX9: 5'-CGAGCTCGCATTTAAACTGTCATTTCATAG-3', 서열번호 46)를 이용한 PCR 반응이다. 상기 PCR 산물을 T-Blunt 벡터에 재조합시켜 서브클론을 생성하였다. 라이게이션 혼합물을 대장균 DH5α 균주에 형질전환시키고, 50 ㎍/㎖ 카나마이신을 포함하는 LB 플레이트에서 형질전환체를 선별하였다. 표적 유전자의 삽입을 확인하기 위해서, M13 정방향 및 역방향 유니버설 프라이머와 EmeraldAmp^® GT PCR Master Mix (TaKaRa)를 이용하여 콜로니 PCR을 수행하였다(초기 변성 98℃, 2분; [98℃, 10초 → 55℃, 15초 → 72℃, 45초](30 반복); 72℃, 7분) 선별된 콜로니로부터 플라스미드 DNA를 추출하고, 시퀀싱을 의뢰하였다.

APX9 ^Or 유전자의 코딩 영역 전장을 데스티네이션 벡터(pUBI1300)를 사용하여 라이게이션시켜 최종 벡터를 제조하였다. 상기 벡터를 APX9 ^Or 유전자의 과발현을 위해 사용하였다(도 2). 생산된 10개의 T₀ 식물체 중에서 APX9의 높은 발현 수준을 보이는 5개의 T₀ 식물체를 선발하였고, 추후 분석을 위해 그들의 T₁ 종자를 생산하였다.

7. 통계 분석

모든 실험은 최소 삼반복으로 수행되었다. 두 평균 값의 비교를 위해 Student's t-test를 사용하여 1% 또는 5% 유의성 수준을 검증하였다.

실시예 1. NIL의 표현형 분석

화성벼와 NIL의 표현형 비교 결과, 하기 표 2와 같이 8개의 형질 중 7개의 형질에서 큰 차이가 관찰되었다. 식물체의 초장과 절간장은 NIL에서 화성벼보다 길게 확인되었고, 특히 NIL에서 첫 번째와 네 번째 절간이 현저히 길어진 것이 관찰되었다(도 3). NIL의 낟알은 화성벼의 낟알에 비해 길고 넓어져 천립중이 증가된 것으로 판단되었다(도 4).

화성벼와 NIL간의 농업 형질 비교

Agronomic traits	Mean ± SD		Differences (A) and (B)
	Hwaseong (A)	NIL (B)
Plant height (cm)	110.6±3.0	116±3.0	**
Panicle length (cm)	20.1±1.6	22.1±1.4	*
Panicle number	12.5±1.6	12.8±2.5	NS
Spikelet per panicle	121±22.7	152±23.6	**
Days to heading	102	108	**
Grain length (mm)	7.13±0.1	7.23±0.1	*
Grain width (mm)	3.06±0.1	3.14±0.1	**
1,000-grain weight (g)	24.3±0.8	26.0±0.5	*

*, **: 유의성 P < 0.05, P < 0.01, NS: not significant.

낟알 크기는 낟알의 무게에 영향을 미치고, 낟알 무게 및 이삭 당 꽃차례(spikelets per panicle)의 증가는 생산량 증가를 야기한다. NLD 조건 하에서, NIL은 화성벼에 비해 출수기가 6일 정도 지연되었다. 그래서, 영양생장 단계의 기간이 길어질 수 있을 가능성이 있는 것으로 판단되었다. 종합하면, NIL은 화성벼에 비해 증가된 초장, 낟알 크기 및 무게, 그리고 지연된 출수기의 특징을 보여주었다. 그래서, 오리자 루피포곤(O. rufipogon)의 단편이 식물체의 성장 및 발달과 연관된 유전자를 가지고 있음을 유추할 수 있었다.

실시예 2. 표적 부위의 후보 유전자

서열 주석 데이터베이스(http://www.gramene.org)로부터 접근 가능한 데이터에 기반하여, RM215 및 CNR113 사이의 25.5 kb 영역으로 정의된 QTL에서 4개의 유전자가 예측되었다(도 5). 4개의 후보 유전자의 기능적 주석은 다음과 같다: MYB transcription factor (OsMYB, LOC_Os09g36730), expressed protein (LOC_Os09g36735), male sterility (OsMs5, LOC_Os09g36740) 및 L-ascorbate peroxidase 9 (OsAPX9, LOC_Os09g36750). OsMYB는 RNA 폴리머라제 Ⅱ 전사인자 활성을 가지고 있으며, OsMs5는 tetratricopeptide 반복 도메인을 포함하는 단백질이며, OsAPX9는 추정적 퍼옥시좀 유형 아스코르브산염 페록시다제이다.

Expressed protein (LOC_Os09g36735)을 제외하고, 3개의 후보 유전자에 기반하여 화성벼와 오리자 루피포곤의 게노믹 DNA 서열을 비교하였다(도 6). 그 결과, OsMYB 전사인자는 5' 및 3' UTR 영역에서 각각 하나의 SNP(single nucleotide polymorphism)와 9-bp InDel(Insertion/Delition)이 확인되었다. 그리고, OsMs5에서는 첫 번째 엑손에서 화성벼의 글루탐산(E)이 오리자 루피포곤에서 알라닌(A)으로, 세 번째 엑손에서 화성벼의 글리신(G)이 오리자 루피포곤에서 세린(S)으로 변한 비동의(non-synonymous) SNP가 확인되었다. OsAPX9의 경우 오리자 루피포곤에서 첫 번째 및 두 번째 인트론에서 각각 31- 및 621-bp 염기 삽입이 확인되었으며, 여섯 번째 엑손의 종결 코돈 근처에 화성벼와 오리자 루피포곤 서열 간에 3-bp 염기 차이가 확인되었다. 화성벼에서 상기 3-bp 삽입 염기는 OsAPX9에 발린(V) 아미노산의 추가를 초래하였다.

후보 유전자 3개의 공간적인 발현 경향을 관찰하기 위해서, semi-quantitative RT-PCR을 수행하였다. 그 결과, OsMYB 및 OsMs5 유전자는 화성벼와 NIL에서 유사한 수준의 발현을 보여주었으나, OsAPX9 유전자는 화성벼에 비해 NIL에서 모든 조직에서 높은 발현 수준을 보여주었다(도 7). 상기 결과를 통해 OsAPX9 유전자가 강력한 후보 유전자로 추정되었다.

실시예 3. OsAPX9 유전자의 특성 분석

3-1. 벼에서 APX 유전자 패밀리의 발현 특성

5개의 다른 발달 단계의 화성벼와 NIL의 화서(panicle)를 이용하여 qRT-PCR 분석을 수행하였다. 그 결과, OsAPX1, OsAPX2, OsAPX4, OsAPX5, OsAPX6, OsAPX7 및 OsAPX8 유전자는 화성벼와 NIL에서 유사한 발현 경향을 보여주었다(도 8). OsAPX2 유전자는 개화 후 15일째(15 DAF)에 가장 높은 발현 수준을 나타내었고, OsAPX4 및 OsAPX8 유전자는 개화 시작일에 가장 높은 발현 수준을 나타내었다. 반면, OsAPX3 유전자는 5번째 단계 동안에 화성벼의 두 번째 화서에서 가장 높은 발현 수준을 보였다. 오리자 루피포곤의 APX9 유전자(이하, APX9 ^Or ) 발현 경향은 OsAPX4와 가장 유사하였고, NIL에서 출수기의 화서에서 가장 높은 발현 수준을 보여주었다.

3-2. 벼에서 APX 유전자 패밀리의 인 실리코( In silico ) 분석

APX9 유전자 및 APX 유전자 패밀리의 아미노산 서열을 비교하여 계통수를 분석하였다. APX9 ^Or 유전자는 170개의 아미노산으로 이루어진 단백질을 암호화하며, APX 유전자 패밀리는 C-말단에 퍼옥시좀을 표적화하기 위한 막관통 도메인을 가지고 있다. 애기장대 At4g35000 (AtAPX3, 52% identity)와 벼 LOC_Os08g43560 (OsAPX4, 57% identity)가 가장 높은 서열 유사성을 보여주었다. 도 9B는 애기장대의 퍼옥시좀 APX(AtAPX3 및 AtAPX5)와 벼 APX(OsAPX4, APX9^HS 및 APX9^Or) 단백질의 아미노산 서열을 정렬한 것으로, 5개의 APX 단백질은 공통적으로 페록시다아제 모티프(녹색 박스) 및 퍼옥시좀 표적화 서열(검은색 박스)을 가지고 있었다. 그러나, APX9^HS 및 APX9^Or는 활성 자리(빨간색 박스) 및 헴(Heme) 결합 자리(파란색 박스)는 포함하고 있지 않은 것으로 확인되었다. 퍼옥시좀 표적화 서열에 있어서, APX9^HS와 APX9^Or는 3개의 염기 차이를 보여주었는데, APX9^HS에서 발린 아미노산이 삽입된 것을 알 수 있었다. 상기 결과를 통해, APX9 ^Or 유전자가 APX 유전자 패밀리에 속하고, 퍼옥시좀 막에 위치하는 것을 유추할 수 있었다.

3-3. 화성벼와 NIL의 항산화 능력 비교 및 APX 활성 측정

과산화수소와 반응하여 짙은 갈색의 산물을 만들어내는 DAB 염색을 이용하여 화성벼와 NIL의 항산화 능력을 비교하였다. 도 10에 개시된 바와 같이, NIL의 잎과 비교하여 화성벼의 잎에서 짙은 갈색의 점들이 많이 관찰되었다. 이를 통해 NIL이 화성벼에 비해 과산화수소에 의한 스트레스를 적게 받음을 유추할 수 있었다. NIL에서 증진된 APX 함량의 결과로 항산화 활성을 조사하기 위해서, DPPH 라디칼 소거능을 분석하였다. NIL에서의 DPPH 라디칼 소거능은 화성벼에 비해 약 1.3배 증가된 것으로 확인되었고, 이는 APX9 ^Or 가 APX9 ^HS 대립 유전자보다 활성산소종의 제거 및 항산화 능력에 있어 보다 우수함을 의미하였다. 또한 APX 활성을 측정하여 화성벼와 NIL 간 비교 분석한 결과, 약 1.7배 증가된 것으로 확인되었다.

실시예 4. 생장 조건에 따른 개화 시기 조절자의 발현 경향

NLD 조건에서 NIL의 개화 시기는 화성벼에 비해 약 6일 지연되는 것으로 관찰되었다(도 11). 개화 시기 조절과 관련된 8개의 유전자의 발현 수준을 분석한 결과, 80 및 86 DAG의 시료에서 OsEhd1, OsId1, OsHd3a 및 OsRFT1는 화성벼와 비교하여 NIL에서 발현감소한 것으로 관찰되었고, OsAPX9는 화성벼에 비해 NIL에서 모든 단계에서 높게 발현하는 것으로 관찰되었다. 단일(SD) 조건에서는 화성벼와 NIL에서 개화 시기에 차이가 없는 것으로 확인되었으며, LD 조건에서 NIL은 화성벼와 비교하여 3일 지연된 개화 시기를 보여주었다(도 12). OsId1, OsEhd1 및 OsRFT1 유전자의 발현은 화성벼와 비교하여 NIL에서 유사하거나 유의적으로 감소한 것이 관찰되었고(도 12E, G 및 J), 이러한 결과들은 NIL의 지연된 개화 시기가 상기 유전자들의 발현 감소 때문인 것으로 사료되었다.

실시예 5. APX9 형질전환 식물체의 표현형 분석

5-1. 형질전환 식물체에서 유전자 발현 경향 분석 및 계통 선별

APX9 유전자의 기능을 알아보기 위해서, 화성벼에 APX9 ^Or 을 포함하는 벡터를 형질전환시켜 과발현 식물체를 제조하였다. 총 10개의 T₀ 계통을 획득하였고, 이들 중 5개의 계통(#1, #2, #8, #13, #23)을 선별하여 필드에서 재배하였다(도 13).

5-2. APX9 과발현 및 녹아웃 식물체의 표현형 분석

성숙기에 화성벼, NIL, APX9 ^Or 과발현 식물체(OX #23)의 중요한 농업적 특징들을 비교하였다. 그 결과, 화성벼와 NIL 사이에 초장, 출수기 및 낟알 크기에 있어서 큰 차이가 확인되었고(도 14 내지 도 16), APX9 ^Or 과발현 식물체에서 화성벼에 비해 초장 및 낟알 크기가 증가되었으며, 출수가 지연됨을 확인할 수 있었다. 상기의 결과들을 통해 야생벼 유래 APX9 유전자가 초장, 낟알 크기 및 출수기의 변이와 연관되어 있음을 알 수 있었으며, 벼에서 전반적인 성장 및 발달에 중요한 역할을 수행하는 유전자임을 알 수 있었다.

<110> The Industry & Academic Cooperation in Chungnam National University (IAC) <120> APX9 gene derived from Oryza rufipogon controlling plant height, seed size and heading date and uses thereof <130> PN19085 <160> 46 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 513 <212> DNA <213> Oryza rufipogon <400> 1 atgctgatct ttatcagctt gctggagtgg ttgcagttga agttactgga ggtccaaccg 60 ttgactttgt tcctggaaga agggactcat cagtttgccc gcgagaagga cgtcttcctg 120 atgcgaagaa agggaaaggc acatcctgaa agatctggat ttgacggtgc atggaccaag 180 gaaccactta agtttgacaa ctcttacttc ctagaactgc tgagggagga atcagaggga 240 cttttgaaac ttccaactga cagggctctc ctggaagatc ctgaattcag gcgctttgtg 300 gatcattacg cgaaggatga ggatgccttc ttcaaggact acgctgaatc acacaagaag 360 ctctccgaac ttgggttcgc tccacgtagc tctgcaaaat cagatggttc aacggctgct 420 gctacactcg cgcagagtgc gtttggggtc gcagttgctg cagccgtagt tatcgcaggt 480 tacctctacg agtcttctaa gaaaaccaag tag 513 <210> 2 <211> 170 <212> PRT <213> Oryza rufipogon <400> 2 Met Leu Ile Phe Ile Ser Leu Leu Glu Trp Leu Gln Leu Lys Leu Leu 1 5 10 15 Glu Val Gln Pro Leu Thr Leu Phe Leu Glu Glu Gly Thr His Gln Phe 20 25 30 Ala Arg Glu Lys Asp Val Phe Leu Met Arg Arg Lys Gly Lys Ala His 35 40 45 Pro Glu Arg Ser Gly Phe Asp Gly Ala Trp Thr Lys Glu Pro Leu Lys 50 55 60 Phe Asp Asn Ser Tyr Phe Leu Glu Leu Leu Arg Glu Glu Ser Glu Gly 65 70 75 80 Leu Leu Lys Leu Pro Thr Asp Arg Ala Leu Leu Glu Asp Pro Glu Phe 85 90 95 Arg Arg Phe Val Asp His Tyr Ala Lys Asp Glu Asp Ala Phe Phe Lys 100 105 110 Asp Tyr Ala Glu Ser His Lys Lys Leu Ser Glu Leu Gly Phe Ala Pro 115 120 125 Arg Ser Ser Ala Lys Ser Asp Gly Ser Thr Ala Ala Ala Thr Leu Ala 130 135 140 Gln Ser Ala Phe Gly Val Ala Val Ala Ala Ala Val Val Ile Ala Gly 145 150 155 160 Tyr Leu Tyr Glu Ser Ser Lys Lys Thr Lys 165 170 <210> 3 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 3 gaacggacaa cgagatcaag aa 22 <210> 4 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 4 gcctcgaatg atatggtgat gt 22 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 5 accagatctc gctgctcaag 20 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 6 gtctggttgc ttcttgctcc 20 <210> 7 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 7 gaagaaaggg aaaggcacat cc 22 <210> 8 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 8 gccgttgaac catctgattt tg 22 <210> 9 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 9 gtcctcagcc atggagc 17 <210> 10 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 10 ggacacaatg attaggg 17 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 11 tggagaaagg ttgtggatgc 20 <210> 12 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 12 gatagacggc acttcagcag at 22 <210> 13 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 13 aaccaagatc ggcagtatgg 20 <210> 14 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 14 gattgattgc tccagcaggt 20 <210> 15 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 15 gtttgctctg ctcctactc 19 <210> 16 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 16 actcctcctc cagcattgaa 20 <210> 17 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 17 cctcttctcc aggaaggaca 20 <210> 18 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 18 gctgctggtg atcagaagat t 21 <210> 19 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 19 gttgccagtc atctgcagaa 20 <210> 20 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 20 ggatgtggat catgagacat 20 <210> 21 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 21 atattgtggg agcacgtt 18 <210> 22 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 22 atctgaacca ttgtccaagc 20 <210> 23 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 23 agcccaagtg accctaacct 20 <210> 24 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 24 gttgtagagc tcggcgaagt 20 <210> 25 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 25 tgacctagat tcaaagtcta atcctt 26 <210> 26 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 26 tgccggccat gtcaaattaa taac 24 <210> 27 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 27 atacccacca tctcctacgc c 21 <210> 28 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 28 gtcagaaccc ttggtagcat ca 22 <210> 29 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 29 ccgacggtga gcgatgagt 19 <210> 30 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 30 cgaaggtgcc agcagagtg 19 <210> 31 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 31 ggatttgatg gtgcctggac 20 <210> 32 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 32 catagcggcg gaatgtagga 20 <210> 33 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 33 cgggcactta tgacgtgaac 20 <210> 34 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 34 cagcatatgt gatcttaggg 20 <210> 35 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 35 aggcgttatt cttggtcatt cc 22 <210> 36 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 36 catcagcaac atcagccctt c 21 <210> 37 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 37 ccagcccatc aaagacaagc 20 <210> 38 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 38 cagccacatc aacccttcca ta 22 <210> 39 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 39 gtgggcaatc gtggacagc 19 <210> 40 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 40 tgcttcttgg tcctctgcgt at 22 <210> 41 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 41 cggagccaat gctggtctg 19 <210> 42 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 42 cacttgccaa ctggaacaaa tca 23 <210> 43 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 43 gaagtaagga aggaggagga 20 <210> 44 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 44 aaggtgttca gttccaagg 19 <210> 45 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 45 gggatcccgt caatggttct ttaataaat 29 <210> 46 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 46 cgagctcgca tttaaactgt catttcatag 30

Claims (12)

1. 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진, 야생벼(Oryza rufipogon) 유래의 APX9(L-ascorbate peroxidase 9) 단백질.
2. 제1항의 APX9 단백질을 코딩하는 유전자.
3. 제2항에 있어서, 상기 유전자는 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 것을 특징으로 하는 유전자.
4. 제2항의 유전자를 포함하는 재조합 벡터.
5. 제4항의 재조합 벡터로 형질전환된 숙주세포.
6. 제5항에 있어서, 상기 숙주세포는 식물인 것을 특징으로 하는 숙주세포.
7. 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 야생벼 유래 APX9(L-ascorbate peroxidase 9) 단백질 코딩 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 식물 세포를 형질전환하여 APX9 단백질 코딩 유전자를 과발현시키는 단계; 및
   상기 형질전환된 식물 세포로부터 형질전환 식물을 재분화하는 단계를 포함하는 비형질전환 식물체에 비해 초장 및 종자 크기는 증가되고, 출수기가 지연된 형질전환 식물체의 제조 방법.
8. 삭제
9. 제7항의 제조 방법에 의해 제조된, 비형질전환 식물체에 비해 초장 및 종자 크기는 증가되고, 출수기가 지연된 형질전환 식물체.
10. 제9항에 따른 식물체의 형질전환된 종자.
11. 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 야생벼 유래 APX9(L-ascorbate peroxidase 9) 단백질 코딩 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 식물 세포를 형질전환시켜 APX9 단백질 코딩 유전자의 발현을 증가시키는 단계를 포함하는, 비형질전환 식물체에 비해 식물체의 초장 및 종자 크기는 증가시키고, 출수기는 지연시키는 방법.
12. 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 야생벼 유래 APX9(L-ascorbate peroxidase 9) 단백질 코딩 유전자를 유효성분으로 포함하는, 비형질전환 식물체에 비해 식물체의 초장과 종자 크기 증가 및 출수기 지연용 조성물.

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