CN116103433A - 用于鉴定水稻穗长性状的caps分子标记及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明用于鉴定水稻穗长性状的CAPS分子标记及应用，其为CAPS730标记，在水稻基因组DNA中使用引物可扩增出302bp的条带，长穗品种的水稻扩增条带经限制性内切酶SapI酶切后，得到两条条带；短穗品种的水稻扩增条带经限制性内切酶SapI酶切后，只有一条条带，用于扩增分子标记的特异性引物序列如SEQ ID NO.1～2所示。本发明提供的鉴定水稻穗长性状的分子标记可应用于水稻高产性状的分子标记辅助育种，不用进行田间统计即可快速筛选出具有长穗性状的水稻，既避免了环境因子对表型鉴定的影响又大大缩短了育种周期，对于培育水稻长穗性状新品种具有重要的理论和实践意义。

Description

用于鉴定水稻穗长性状的CAPS分子标记及其应用

【技术领域】

本发明涉及分子生物学领域，特别涉及用于鉴定水稻穗长性状的CAPS分子标记及其应用。

【背景技术】

水稻(Oryza sativaL.)是重要的粮食作物，养活了全球一半以上的人口。我国是水稻的生产和消费大国，因此水稻对我国乃至世界的粮食生产和安全起着至关重要的作用。水稻的生长发育以及生理调控过程影响着最终的产量和品质，因此利用分子生物学技术对水稻进行育种，以达到加强品质、提高产量的研究已经成为提高水稻生产水平的有效途径。

水稻的产量与水稻各种穗部性状有密切的关系，穗长是与水稻产量正相关的一个穗部性状选择指标，克隆控制水稻穗长的基因，可以为了解水稻稻穗发育机制，培育高产水稻品种奠定基础。尽管大量水稻穗长QTL被鉴定，且少量得以克隆，但仍有很多未知基因需要挖掘。

单核苷酸多态性(single nucleotidepolymorphsim,SNP)标记因其在基因组中遗传多态性丰富，基因内部频率较高，因而较利于开发与功能基因共分离的标记。检测SNP比较经济简便的方法是剪切扩增多态性(cleavedamplifiedpolymorphic sequences,CAPS)标记。这种方法是将PCR扩增与酶切反应相结合，利用限制性内切酶识别目标SNP位点序列进行酶切，再通过电泳分型鉴定。对于天然存在酶切位点的SNP序列可以开发CAPS标记。CAPS具有共显性、位点特异性、操作简单、检测快速、成本低廉且不依赖于精密仪器设备等特点，可用于植物基因分型、定位、遗传多样性分析、品种鉴定等方面。

在前期工作中，发明人根据基因定位结果克隆了控制穗长的基因LOC_Os09g36730,其基因组序列在长穗品种K1561和短穗品种G1025第793个碱基G/C突变是决定穗长的关键位点。如果能针对这一多态性位点开发适合的CAPS分子标记，通过对标记的筛选，可提高水稻穗长这一重要产量性状选择的育种效率，节约育种成本并提升水稻产业经济效益。

【发明内容】

本发明的目的是提供一种用于鉴定水稻穗长性状的CAPS分子标记；本发明的另一目的是提供一种利用分子标记鉴定水稻穗长性状的方法。

为实现本发明的目的，首先利用水稻品种G1025(短穗)与K1561(长穗)杂交构建重组自交系(RILs)群体，提取RILs群体的基因组DNA，利用特异性位点扩增片段(SLAF)测序技术构建高密度的遗传连锁图谱，定位并克隆了控制水稻穗长的基因LOC_Os09g36730，进行了功能验证。通过序列比对发现了上述SNP位点，并将其转化成CAPS分子标记，利用转化成功的CAPS分子标记在自然群体和上述重组自交系(RILs)群体中进行水稻穗长性状的鉴定，分子标记鉴定结果与表型鉴定结果一致。

本发明提供的用于鉴定水稻穗长性状的CAPS分子标记命名为CAPS730标记，在水稻基因组DNA中使用引物对可扩增出302bp的条带，长穗品种的水稻扩增条带经限制性内切酶Sap I酶切后，得到260bp和42bp的两条条带；短穗品种的水稻扩增条带经限制性内切酶Sap I酶切后，只有一条302bp的条带。

进一步地，本发明的CAPS730标记通过以下特异性引物对扩增获得：

上游引物F：5’-CGACGACAAGACCCTGAGCAGCAGCCATGATGATGAAGCCGGTG-3’(SEQ IDNO.1)；

下游引物R：5’-AGAGCAGCAGAGGAGATGTT-3’(SEQ ID NO.2)；

本发明提供了用于鉴定水稻穗长性状的CAPS730分子标记的特异性引物对，其为：

上游引物F：5’-CGACGACAAGACCCTGAGCAGCAGCCATGATGATGAAGCCGGTG-3’(SEQ IDNO.1)；

下游引物R：5’-AGAGCAGCAGAGGAGATGTT-3’(SEQ ID NO.2)；

本发明提供了含有上述特异性引物对的试剂盒。

进一步地，本发明的试剂盒中，还含有限制性内切酶Sap I。

本发明提供了分子标记CAPS730在鉴定水稻穗长性状中的应用。

本发明提供了分子标记CAPS730在水稻分子标记辅助育种中的应用。

本发明提供了SEQ ID NO.1～2所示的特异性引物对或含有该特异性引物对的试剂盒在鉴定水稻穗长性状中的应用。

本发明提供了SEQ ID NO.1～2所示的特异性引物对或含有该特异性引物对的试剂盒在水稻分子标记辅助育种中的应用。

本发明还提供了一种鉴定水稻穗长性状的方法，包括以下步骤：

(1)提取待检测水稻的基因组DNA；

(2)以待测水稻的基因组DNA为模板，利用SEQ ID NO.1～2所示的特异性引物对进行PCR扩增反应；

(3)扩增产物经限制性内切酶Sap I进行酶切，酶切产物经琼脂糖凝胶电泳进行分型，酶切产物包含260bp和42bp的两条条带，则待测水稻为长穗品种，酶切产物只包含一条302bp的条带，则待测水稻为短穗品种。

上述方法中，步骤(2)的PCR扩增反应20μL体系为：待测基因组DNA 1μL，上下游引物各0.5μL，2×Es Taq DNAPolymerase Reaction mix10μL，蒸馏水8μL；

PCR扩增反应程序为：94℃变性5min；94℃30s，57℃30s，72℃30s，共35个循环；72℃延伸5min；

其中，步骤(3)的20μL酶切体系为：10μL PCR产物，1μL的Sap I，9μL蒸馏水，酶切反应条件为37℃反应4h；

其中，酶切结束后，取10μL酶切产物用2％琼脂糖凝胶电泳进行分型。

本发明提供了上述鉴定水稻穗长性状的方法在水稻育种中的应用。

与现有技术相比较，本发明具有以下有益效果：

本发明提供的鉴定水稻穗长性状的分子标记可应用于水稻高产性状的分子标记辅助育种，不用进行田间统计即可快速筛选出具有长穗性状的水稻，既避免了环境因子对表型鉴定的影响又大大缩短了育种周期，对于培育水稻长穗性状新品种具有重要的理论和实践意义。。

【附图说明】

图1为CAPS730标记引物扩增G1025和K1561的电泳图；M为Marker；

图2为CAPS730标记在自然群体中的验证；M为Marker，1，5-8，14-19，21，23，24为14长穗品种；2-4，9-13，20，22为10个短穗品种；

图3为CAPS730标记在RILs群体中的验证；M为Marker，1,3,5-8,14-19,21,23,24为水稻长穗单株；2，4，9-13，20，22为短穗单株。

【具体实施方式】

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1：用于鉴定水稻穗长性状的dCAPS分子标记的开发

1、通过图位克隆方法克隆控制水稻穗长的基因

(1)选取2份来源不同，且穗长性状具有显著差异的水稻品种G1025(短穗)与K1561(长穗)杂交构建重组自交系(RILs)群体；

(2)使用特异性位点扩增片段(SLAF)测序技术，利用RILs群体的基因型数据构建了高密度的遗传连锁图谱；

(3)以遗传连锁图谱为基础，对RILs群体的穗长的数量性状基因位点(QTL)进行分析，检测到一个控制穗长的主效QTL(称为PL9)，通过精细定位克隆了候选基因LOC_Os09g36730,并获得与水稻长穗性状显著关联的SNP位点,序列如SEQ ID NO.3所示。

2、SNP位点特异性酶切位点分析及引物设计

(1)LOC_Os09g36730在长穗品种K1561和短穗品种G1025基因组中距离基因起始密码碱基793位点处存在一个碱基C/G的差异。

(2)利用在线酶切识别软件dCAPS Finder 2.0(http://helix.wustl.edu/dcaps/dcaps.html)查找步骤(1)中所选择的SNP位点突变所引起的限制性内切酶信息，选用合适的内切酶Sap I，该酶的酶切识别序列为GCTCTTC(1/4)^位点，在K1561中LOC_Os09g36730基因组正向793bp处的C碱基形成了一个SapI的识别位点(识别反向互补序列，位于正向序列的787-793bp处)。

(3)LOC_Os09g36730基因组793位点在RILs群体中进行基因型分析，共有C、G和S三种基因型，其中S代表CG简并碱基，若某材料的基因型为S表示该材料在该位点为杂合状态；根据限制性内切酶Sap I的识别序列可知，若该SNP位点为C，能被酶切；若为G，不能被酶切；若为S，则可以部分酶切；对LOC_Os09g36730基因组793位点的三种基因型分别计算平均表型值，发现C或S基因型的材料的穗长显著大于G基因型(P＜0.01)，因此认为长穗水稻品种的PCR产物更有可能被酶切；

(4)将设计的LOC_Os09g36730基因组793位点的CAPS分子标记命名为CAPS730标记，并设计引物：首先利用在线酶切识别软件dCAPS Finder 2.0(http://helix.wustl.edu/dcaps/dcaps.html)找出SapI的识别位点，再利用Primer Primer 5.0软件设计包含识别位点的上下游PCR引物；引物设计标准为长度18～25bp，GC含量40～60％，退火温度为55℃～65℃，上下游引物的GC含量和退火温度尽量保持接近，无引物二聚体及发卡结构，上下游引物能够配对扩增出目的基因产物。考虑到上游引物中酶切位点发生酶切后只能切下5’端14个碱基，而PCR产物也只有302bp，为了能够更好的通过琼脂糖凝胶区分发生酶切和未发生酶切的产物，因此在上游引物的5’端加上了一段28bp接头序列，使得上游引物中酶切位点发生酶切后切下5’端42个碱基。根据上述原则设计的上游引物序列为：

上游引物F：5’-CGACGACAAGACCCTGAGCAGCAGCCATGATGATGAAGCCGGTG-3’(SEQ IDNO.1)；

下游引物R：5’-AGAGCAGCAGAGGAGATGTT-3’(SEQ ID NO.2)；

其中，上游引物F的下划线部分为接头序列；

使用上述引物对，对水稻品种G1025(短穗)与K1561(长穗)的基因组DNA进行PCR扩增，均可扩增得到302bp的条带(图1)，说明所设计的引物特异性好。

经过上述设计得到用于鉴定水稻穗长性状的CAPS730分子标记和用于该分子标记的特异性引物对，在水稻基因组DNA中使用引物可扩增出302bp的条带，长穗品种的水稻扩增条带经限制性内切酶Sap I酶切后，得到260bp和42bp的两条条带；短穗品种的水稻扩增条带经限制性内切酶Sap I酶切后，只有一条302bp的条带。

实施例2：用于鉴定水稻穗长性状的CAPS730分子标记的验证

(1)采用CTAB法提取10份短穗水稻品种和14份长穗水稻品种的基因组DNA，用核酸仪检测DNA的浓度和纯度后，用ddH2O稀释至300ng/L备用；

(2)使用实施例1设计的特异性引物对对24份材料进行PCR扩增，PCR扩增反应20μL体系为：待测基因组DNA 1μL，上下游引物各0.5μL，2×Es Taq DNAPolymeraseReactionmix10μL(TIANGEN,北京)，蒸馏水8μL。PCR扩增反应程序为：94℃变性5min；94℃30s，57℃30s，72℃30s，共35个循环；72℃延伸5min；

(3)PCR反应结束后，取10μL反应产物经2％琼脂糖凝胶电泳检测，24个样本均获得单一条带，说明引物特异性好；再对扩增产物测序，条带长302bp，序列如SEQ ID NO.4所示，该步骤的PCR产物测序并非必要步骤，但是通过对产物测序既可以验证引物设计的准确性，也能因此推断酶切条带的大小；

(4)对步骤(2)的PCR产物使用限制性内切酶Sap I进行酶切，20μL酶切体系为：10μl PCR产物，1μL的Sap I(Takara，大连)，9μL蒸馏水，酶切反应条件为37℃反应4h；酶切结束后，取10μL酶切产物用2％琼脂糖凝胶电泳进行分型(图2)，酶切扩增多态性分析发现：14份长穗水稻品种材料都能被酶切(100％)，而10份短穗水稻品种都不能被酶切(100％)，酶切条带大小符合分子标记设计的预期(由于另一条42bp的酶切条带太小，电泳时沉到电泳液中不能显示)，所开发的CAPS730标记准确率为100％；

(5)从实施例1的水稻品种G1025(短穗)与K1561(长穗)杂交构建RILs群体中，随机选择24个单株进一步验证CAPS730标记和水稻穗长性状共分离情况；

DNA提取、PCR扩增、酶切反应、电泳检测等均与上述24个自然品种的验证方法相同；

酶切扩增多态性分析发现(图3)：15个长穗株系中14份能被酶切(93.3％)，而9份短穗株系都不能被酶切(100％)，平均准确率为95.8％。

经过在自然群体和RILs群体中的验证，说明该标记对水稻穗长的鉴定结果与田间鉴定结果吻合率极高，具有很好的应用价值。

以上所述仅为本发明的优选实施方式，应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明创造构思的前提下，做出若干改进和变化，这些都属于本发明的保护范围。

Claims (10)

1.用于鉴定水稻穗长性状的CAPS分子标记，其特征在于，其为CAPS730标记，在水稻基因组DNA中使用引物对可扩增出302bp的条带，长穗品种的水稻扩增条带经限制性内切SapI酶切后，得到260bp和42bp的两条条带；短穗品种的水稻扩增条带经限制性内切酶Sap I酶切后，只有一条302bp的条带；所述引物对的上游引物序列如SEQ ID NO.1所示，下游引物序列如SEQ ID NO.2所示。

2.用于检测权利要求1所述分子标记的特异性引物对，其特征在于，所述特异性引物对中上游引物序列如SEQ ID NO.1所示，下游引物序列如SEQ ID NO.2所示。

3.含有权利要求2所述特异性引物对的试剂盒。

4.如权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还含有限制性内切酶Sap I。

5.如权利要求1所述的分子标记在鉴定水稻穗长性状中的应用。

6.如权利要求1所述的分子标记在水稻分子标记辅助育种中的应用。

7.如权利要求2所述的特异性引物对或权利要求3所述的试剂盒或权利要求4所述的试剂盒在鉴定水稻穗长性状中的应用。

8.一种鉴定水稻穗长性状的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)提取待检测水稻的基因组DNA；

(2)以待测水稻的基因组DNA为模板，利用SEQ ID NO.1～2所示的特异性引物对进行PCR扩增反应；

(3)PCR扩增产物经限制性内切酶Sap I进行酶切，酶切产物经琼脂糖凝胶电泳进行分型，酶切产物包含260bp和42bp的两条主带，则待测水稻为长穗品种；酶切产物只包含一条302bp的主带，则待测水稻为短穗品种。

9.如权利要求8所述的方法，其特征在于：

所述步骤(2)的PCR扩增反应20μL体系为：待测基因组DNA 1μL，上下游引物各0.5μL，2×Es Taq DNAPolymerase Reaction mix 10μL，蒸馏水8μL；PCR扩增反应程序为：94℃变性5min；94℃30s，57℃30s，72℃30s，共35个循环；72℃延伸5min；

所述步骤(3)的20μL酶切体系为：10μL PCR产物，1μL的Sap I，9μL蒸馏水，酶切反应条件为37℃反应4h；酶切结束后，取10μL酶切产物用2％琼脂糖凝胶电泳进行分型。

10.如权利要求8所述的方法在水稻育种中的应用。

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