CN114317807B - 小麦千粒重性状相关snp位点及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种与小麦千粒重性状相关的SNP位点及其应用，包括用于鉴定或辅助鉴定小麦千粒重性状的试剂盒、引物、相关的分子标记，以及上述元素在鉴定或辅助鉴定小麦千粒重性状中的用途。本发明为小麦的分子标记辅助选择育种提供了一个新方法，在培育高产小麦品种农业实践中和/或相关的科学研究中均具有重要意义。

Description

小麦千粒重性状相关SNP位点及其应用

技术领域

本发明属于分子生物学技术领域，尤其涉及一种与小麦千粒重相关的SNP位点及其应用。

背景技术

小麦(Triticum aestivum L.)是我国第二大口粮作物，近年来随着我国小麦播种面积趋于稳定，如何进一步提高小麦产量成为小麦育种的关键问题。小麦单位面积产量由单位面积穗数、每穗粒数和千粒重三要素构成。研究表明，千粒重在三要素中遗传力最高；育种实践也表明,千粒重的遗传改良成效最为显著。因此，粒重是小麦高产育种的关键性状之一，其关键基因的克隆和鉴定是分子遗传改良的基础。

目前，研究者已经定位了大量调控千粒重的QTL。Ye等利用冬小麦品种陇鉴19与水地高产品种Q9086杂交，通过杂交创建的小麦重组近交系群体RIL，在1D、2A、3A、3B、3D、5A、7A、7B染色体上，Xmag747-Xfba382a(7A)标记区间是千粒重的热点区域。Guan等利用近等基因系在4A染色体长臂上定位了一个多环境稳定表达的千粒重主效QTL(QTgw-4A)。Zhai发现在冬播环境下，QTgw-6A.1、QTgw-6A.2和QTgw-6A.3为主效QTL，表型变异贡献率分别为6.95％-12.85％、10.15％-24.00％和10.20％-15.87％。Li等也找到了QTL，将QKW4B.4-14、QKL4B.4-14、QKL/W4B.4-14定位于RAC875_611-EX_C1_705，且遗传贡献率都大于10％。Zhu利用TaPTF1-B1基因与京411/红芒春21群体中定位于染色体7BL，可解释千粒重表型变异的23.9％-39.1％。

尽管目前已经定位了如此大量的与小麦千粒重相关的QTL。但是，由于绝大多数这些QTL的表型贡献率较小，且在不同年际及环境间重复性差，所以这些QTL难以应用于小麦千粒重的遗传改良。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种小麦千粒重性状相关SNP位点及其应用。

为解决上述技术问题，本发明所采取的技术方案如下。

一种用于鉴定或辅助鉴定小麦千粒重性状的引物，用于检测小麦基因组中如下SNP位点的单核苷酸多态性：所述SNP位点对应于SEQ ID NO.1所示序列自5’末端第66位碱基；所述SNP位点处的核苷酸为C或T，C/C纯合时的基因型是甲，T/T纯合时的基因型是乙；基因型甲纯合小麦的千粒重小于/候选小于基因型乙纯合小麦的千粒重。

作为本发明的一种优选技术方案，所述引物为序列表中SEQ ID NO.2和SEQ IDNO.3组成的引物对1F和1R，和/或序列表中SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5组成的引物对2F和2R。

一种用于鉴定或辅助鉴定小麦千粒重性状的分子标记，其核苷酸序列为SEQ IDNO.1中5’末端40-163位序列。

一种用于鉴定或辅助鉴定小麦千粒重性状的试剂盒，用于检测序列表中SEQ IDNO.1自5’末端第66位碱基的SNP位点单核苷酸多态性；所述SNP位点处的核苷酸为C或T；所述SNP位点处的核苷酸为C/C纯合时，相对应的基因型是甲；所述SNP位点处的核苷酸为T/T纯合时，相对应的基因型是乙；基因型甲纯合小麦的千粒重小于/候选小于基因型乙纯合小麦的千粒重。

作为本发明的一种优选技术方案，所述试剂盒包含序列表中SEQ ID NO.2和SEQID NO.3组成的引物对1F和1R，和/或序列表中SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5组成的引物对2F和2R。

所述引物、分子标记、试剂盒用于鉴定或辅助鉴定小麦千粒重性状的用途。

所述引物、分子标记、试剂盒用于小麦分子标记育种和/或小麦辅助育种的用途。

一种鉴定或辅助鉴定小麦千粒重性状的方法，包括如下步骤：

A、对待测小麦基因组D NA中任意一段包含如下SNP位点的DNA片段进行PCR扩增，并将该PCR扩增产物进行酶切鉴定；所述SNP位点对应于SEQ ID NO.1所示序列自5’末端第66位碱基；

B、确定待测小麦的基因型，所述SNP位点处的核苷酸为C/C纯合时，相对应的基因型是甲；所述SNP位点处的核苷酸为T/T纯合时，相对应的基因型是乙；

C、根据待测小麦基因型按照如下标准确定待测小麦的千粒重性状：基因型甲纯合小麦的千粒重小于/候选小于基因型乙纯合小麦的千粒重。

作为本发明的一种优选技术方案，步骤A中：所述的PCR扩增的DNA片段为SEQ IDNO.1中5’末端40-163bp；所述的PCR扩增的特异性引物对为SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3组成的引物对1F和1R，SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5组成的引物对2F和2R。

作为本发明的一种优选技术方案，步骤A中：所述的酶切包括以下步骤：以小麦基因组DNA为模板，以引物1F和1R为引物对扩增得到PCR产物；将此PCR产物稀释100倍，以其作为模板，以引物2F和2R为引物对扩增得到PCR产物；用限制性内切酶PstI酶切PCR产物。

作为本发明的一种优选技术方案，步骤B中：若PCR产物不能被切开，则该核苷酸多态性位点为C/C，基因型为甲；若PCR产物能被切开，则该核苷酸多态性位点为T/T，基因型为乙。

采用上述技术方案所产生的有益效果在于：本发明开发的SNP存在两种基因型：基因型甲(C)、基因型乙(T)；通过关联分析证明，基因型甲纯合小麦的千粒重小于/候选小于基因型乙纯合小麦的千粒重。本发明还提供了检测所述SNP的dCAPS标记，通过检测所述SNP即可找到千粒重较高的小麦。本发明为小麦的分子标记辅助选择育种提供了一个新方法，在培育高产小麦品种的农业实践和/或相关科学研究中均具有重要意义。

附图说明

图1是本发明的SNP开发dCAPS标记酶切产物电泳检测结果；其中，泳道M为分子量标准；泳道A为被PstI切开的条带，泳道G为不能被PstI切开的条带。

具体实施方式

以下实施例详细说明了本发明。本发明所使用的各种原料及各项设备均为常规市售产品，均能够通过市场购买直接获得。

应当理解，当在本申请说明书和所附权利要求书中使用时，术语“包括”指示所描述特征、整体、步骤、操作、元素的存在，但并不排除一个或多个其它特征、整体、步骤、操作、元素的存在或添加。

还应当理解，在本申请说明书和所附权利要求书中使用的术语“和/或”是指相关联列出的项中的一个或多个的任何组合以及所有可能组合，并且包括这些组合。

如在本申请说明书和所附权利要求书中所使用的那样，术语“如果”可以依据上下文被解释为“当...时”或“一旦”或“响应于确定”或“响应于检测到”。类似地，短语“如果确定”或“如果检测到[所描述条件或事件]”可以依据上下文被解释为意指“一旦确定”或“响应于确定”或“一旦检测到[所描述条件或事件]”或“响应于检测到[所描述条件或事件]”。

另外，在本申请说明书和所附权利要求书的描述中，术语“第一”、“第二”、“第三”等仅用于区分描述，而不能理解为指示或暗示相对重要性。

在本申请说明书中描述的参考“一个实施例”或“一些实施例”等意味着在本申请的一个或多个实施例中包括结合该实施例描述的特定特征、结构或特点。由此，在本说明书中的不同之处出现的语句“在一个实施例中”、“在一些实施例中”、“在其他一些实施例中”、“在另外一些实施例中”等不是必然都参考相同的实施例，而是意味着“一个或多个但不是所有的实施例”，除非是以其他方式另外特别强调。术语“包括”、“包含”、“具有”及它们的变形都意味着“包括但不限于”，除非是以其他方式另外特别强调。

下述实施例中所用的小麦材料均来自国家作物种质库(http://icscaas.com.cn/jiguoku/zhongzhiku.htm)，材料信息见中国作物种质信息网，网址：http://icgr.caas.net.cn。

实施例1、与小麦千粒重相关的SNP及其PCR-酶切多态性检测

1.1、扩增含小麦该SNP的基因组片段的特异引物及序列分析

在小麦基因组上的基因TaROXY1-2A启动子区发现1个SNP，对应于序列表1自5’末端的第66位；该位点在小麦自然变异群体中存在两种基因型：

基因型甲：C

基因型乙：T

根据小麦不同基因组的序列差异，设计特异性引物PCR扩增分别包含该SNP位点在内的DNA片段：

F1：CCAGTAACGGTGTCACTGACAATATCG(SEQ ID NO.2)；

R1：GCACTAAAACAGCTCACGCTAGCTCC(SEQ ID NO.3)；

F2：GGTGCTTCACGGCGTGGCACATGCAGC(SEQ ID NO.4)；

R2：CCGGCGATGCCGGTCACCTTGGCTGC(SEQ ID NO.5)；

以F1和R1为引物对PCR扩增的靶序列如序列表的序列1所示的-111-438位序列；以F2和R2为引物对PCR扩增的靶序列如序列表的序列1所示的40-163位序列。酶切分析显示，该多态性可分别被PstI识别。

1.2、PCR-酶切多态性检测及基因分型方法的建立

1)提取待测小麦的基因组DNA；

2)以步骤1)的基因组DNA为模板，用引物F1和R1进行PCR扩增，PCR扩增的体系(10μL)为：ddH₂OμL、10×PCR Buffer 1μL、引物F1(5μmol/L)和引物R1(5μmol/L)各0.3μL、dNTP(2.5μmol/L)0.6μL，Taq酶0.1μL、模板(20ng/μL)0.5μL。

PCR扩增条件为94℃4min；94℃30s，56℃30s，72℃30s，32次循环；72℃10min，16℃保存。

3)将步骤2)的PCR产物稀释100倍，以其为模板，用引物F2和R2进行PCR扩增，PCR扩增的体系(10μL)为：ddH₂OμL、10×PCR Buffer 1μL、引物F2(5μmol/L)和引物R2(5μmol/L)各0.3μL、dNTP(2.5μmol/L)0.6μL，Taq酶0.1μL、模板(20ng/μL)0.5μL。

PCR扩增条件为94℃4min；94℃30s，56℃30s，72℃10s，32次循环；72℃10min，16℃保存。

4)将步骤3)得到的PCR产物用PstI酶切，获得酶切产物，进行4％琼脂糖凝胶电泳检测，记录PCR产物是否被切为两个片段，并根据如下方法判断并记录待测小麦在所述位点的情况：

若所述酶切产物为一个片段，则待测小麦在所述位点为C纯合(表示为C/C)的小麦(图1中的泳道C)；

若所述酶切产物为两个片段，则待测小麦在所述位点为T纯合(表示为T/T)的小麦(图1中的泳道T)。

5)根据步骤4)的结果，将小麦分为在所述位点的情况为如下I、II两种类型：

I：C/C(即基因型甲纯合)；

II：T/T(即基因型乙纯合)；

所述“/”前为一条同源染色体上的情况，所述“/”后为另一条同源染色体上的情况。

1.3、利用dCAPs标记对自然群体进行分型并与千粒重性状进行关联分析

以320份六倍体小麦组成的自然群体中各小麦分别作为待测小麦，按照步骤2的方法进行分型，随机对部分小麦的扩增产物进行测序验证，结果如表1所示。

表1 小麦自然群体中所述多态性位点的情况

实施例2、TaROXY1-2A基因多态性位点与小麦千粒重的关联分析

2018年，在中国科学院农业资源研究中心栾城实验站(河北栾城)的旱地，2019年在中国科学院农业资源研究中心衡水实验农场(河北栾城和衡水)的旱地和水地种植上述自然群体小麦，调查各小麦品种的千粒重，用Tassel2.1软件对千粒重和所述多态性位点的情况进行关联分析，选择混合线性模型+群体结构(MLM+(Q+K))方法进行分析，以P<0.05为显著性水平，结果如表2所示。

表2 自然群体中TaROXY1-2A基因多态性位点的情况与千粒重的关联分析结果

表2的关联分析结果表明，表1所示的320份六倍体小麦组成的自然群体形成的两种类型的千粒重差异均达到显著水平(P<0.05)。其中，类型II的小麦千粒重高于类型I的小麦千粒重。几个环境中，类型II的小麦材料的千粒重分别较I的小麦高2.42g、2.47g、2.17g、2.86g、3.42g、3.18g、3.74g和3.69g。对自然群体的研究表明，类型II是提高小麦千粒重的优异基因型。

在上述实施例中，对各个实施例的描述都各有侧重，某个实施例中没有详述或记载的部分，可以参见其它实施例的相关描述。

综上实施例可见，本发明公开了本发明公开了一种与小麦千粒重相关的SNP位点及其应用。本发明通过对小麦自然变异群体中ROXY1-2A基因启动子区的遗传变异分析，发现有一个SNP，对应于序列表1自5’末端第66位，该SNP存在两种基因型：基因型甲(C)、基因型乙(T)。通过关联分析证明，这两种基因型的纯合类型中，基因型甲纯合小麦的千粒重小于/候选小于基因型乙纯合小麦的千粒重。本发明还提供了检测所述SNP的dCAPS标记。实验证明，通过检测所述该SNP，即可找到千粒重较高的小麦。本发明为小麦的分子标记辅助选择育种提供了一个新方法，在培育高产小麦品种或研究中具有重要意义。

以上所述实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 河北师范大学

<120> 小麦千粒重性状相关SNP位点及其应用

<160> 5

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1269

<212> DNA

<213> 普通小麦(Triticum aestivum L)

<400> 1

aaagttgcat gcgtctcttg agatcgtcta gtatcgaaaa cctgcatgta catcttggaa 60

aagaaaaagg cattccttct cctttccgtg aagacgcacc acccttggac cccaaaagaa 120

aaaaacgaaa cgccgctgcc cccgctctat aaatacatgc gcctcttctc acttgtagct 180

cgccagcact aaaacagctc acgctagctc cctcaaacca cctcccgcgc ttagctactt 240

aataagcagt tgtttagcca cctaattagc tagttaattt cgcagctgta tcgaacaatg 300

cagtacggcg cggcggccga gcaggcgtgg tacatgccgg cgatgccggt caccttggcg 360

gcggaaacgg cggcggagcg ggtggagcgc ctggcgtcgg agagcgccgt ggtggtgttc 420

agcgtgagca gctgctgcat gtgccacgcc gtgaagcacc tcttctgcgg catgggcgtg 480

caccccaccg tgcacgagct ggacctcgac ccgcgcggcc tcgaactgga gcgcgccctc 540

gccgacctcc tcggctgcgc cgtccccgga ggagccgcac cggtcgttcc cgtcgtattc 600

atcggcggca agctggtcgg cgccatggac cgcgtgatgg ccgcgcacat caacggctcc 660

ctcgtgccgc tgctcaagga ggccggcgct ctctggctct gagcgccacg atattgtcag 720

tgacaccgtt actggttggg gctaatagta ggatagatgt ttacatccac aaaggtcagt 780

taattataga tcactggtgt gcgtgtgcgt gagtgtgaga gagtgagagg tcggtgtttt 840

ttttttacca ctactgcctc cgtcttgttt gagcttctgg gagctagtgc gtgcatgctt 900

gcactaccag tctaccgggt gtatgtgcgt gtgtgcagtg tgctcgattg gtgctaaaga 960

gatctagtgt tcatctccct ttgattagta tttggcttgc cttgtttaaa acttctgtta 1020

gtcgtgtgtt catcctttgg cattttgtct cgtgtgtcct ttcggcgtta atggtcagat 1080

gctggcttca gattttggtt gcctgtttaa tctacaatgt tgctatatga taagagaaat 1140

tcttatatat tagatacaca tagagagacc gggatacaac tactattctt tgaaaaaata 1200

aagacaactt atattaaatt tgcttagcca gatgaacatc aaatggctat aaataattat 1260

acaaacttg 1269

<210> 2

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

ccagtaacgg tgtcactgac aatatcg 27

<210> 3

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

gcactaaaac agctcacgct agctcc 26

<210> 4

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

ggtgcttcac ggcgtggcac atgcagc 27

<210> 5

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

ccggcgatgc cggtcacctt ggctgc 26

Claims (4)

1.一种用于鉴定或辅助鉴定小麦千粒重性状的引物，用于检测小麦基因组中如下SNP位点的单核苷酸多态性：所述SNP位点对应于SEQ ID NO.1所示序列自5’末端297bp算起的第66位碱基；所述SNP位点处的核苷酸为C或T，C/C纯合时的基因型是甲，T/T纯合时的基因型是乙；基因型甲纯合小麦的千粒重小于/候选小于基因型乙纯合小麦的千粒重；

所述引物为序列表中SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3组成的引物对F1和R1，和序列表中SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5组成的引物对F2和R2。

2.一种用于鉴定或辅助鉴定小麦千粒重性状的试剂盒，用于检测序列表中SEQ IDNO.1自5’末端297bp算起的第66位碱基的SNP位点单核苷酸多态性；所述SNP位点处的核苷酸为C或T；所述SNP位点处的核苷酸为C/C纯合时，相对应的基因型是甲；所述SNP位点处的核苷酸为T/T纯合时，相对应的基因型是乙；基因型甲纯合小麦的千粒重小于/候选小于基因型乙纯合小麦的千粒重；

所述试剂盒包含序列表中SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3组成的引物对F1和R1，和序列表中SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5组成的引物对F2和R2。

3.权利要求1所述的引物或权利要求2所述的试剂盒用于鉴定或辅助鉴定小麦千粒重性状的用途。

4.一种鉴定或辅助鉴定小麦千粒重性状的方法，其特征在于：该方法包括如下步骤：

A、对待测小麦基因组DNA中任意一段包含如下SNP位点的DNA片段进行PCR扩增，并将该PCR扩增产物进行酶切鉴定；所述SNP位点对应于SEQ ID NO.1所示序列自5’末端297bp算起的第66位碱基；

B、确定待测小麦的基因型，所述SNP位点处的核苷酸为C/C纯合时，相对应的基因型是甲；所述SNP位点处的核苷酸为T/T纯合时，相对应的基因型是乙；

C、根据待测小麦基因型按照如下标准确定待测小麦的千粒重性状：基因型甲纯合小麦的千粒重小于/候选小于基因型乙纯合小麦的千粒重；

步骤A中：所述的PCR扩增的DNA片段为SEQ ID NO.1中5’末端40-163bp；所述的PCR扩增的特异性引物对为SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3组成的引物对F1和R1，SEQ ID NO.4和SEQID NO.5组成的引物对F2和R2；所述的酶切包括以下步骤：以小麦基因组DNA为模板，以引物F1和R1为引物对扩增得到PCR产物；将此PCR产物稀释100倍，以其作为模板，以引物F2和R2为引物对扩增得到PCR产物；用限制性内切酶PstI酶切PCR产物；

步骤B中：若PCR产物不能被切开，则该核苷酸多态性位点为C/C，基因型为甲；若PCR产物能被切开，则该核苷酸多态性位点为T/T，基因型为乙。

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