CN110184381B - 一种与小麦每穗小穗数相关的snp位点及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种与小麦每穗小穗数相关的SNP位点及其应用。本发明通过对小麦自然变异群体中WFZP‑A基因启动子区的遗传变异分析，发现有一个SNP，对应于序列表1自5’末端第1501位，该SNP存在两种基因型：基因型甲(A)、基因型乙(G)。通过关联分析证明，这两种基因型的纯合类型中，每穗小穗数大小为：基因型甲纯合的小麦>基因型乙纯合的小麦。本发明还提供了检测所述SNP的dCAPS标记。实验证明，通过检测所述该SNP，即可找到每穗小穗数较高的小麦。本发明为小麦的分子标记辅助选择育种提供了一个新方法，在培育高产小麦品种或研究中具有重要意义。
Description
技术领域
本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及一种与小麦每穗小穗数相关的SNP位点及其应用。
背景技术
小麦(Triticum aestivum L)是世界和我国最主要的粮食作物之一。提升小麦单产是满足今年来粮食需求不断提高的重要方式，同时也是保证粮食安全的战略目标。每穗粒数是小麦单株产量构成的三大要素之一，而每穗小穗数则是每穗粒数的关键影响因素。因此，挖掘调控每穗小穗数的优异等位变异并开发功能标记在小麦穗粒数改良和小麦高产育种中具有重要的应用价值。
目前，研究者已经定位了大量调控每穗小穗数的QTL。Liu等利用近等基因系在1D、2D、3D、5A、5B和5D上检测到小穗数QTL。Li等利用“Chuang35050×Shangnong483”RIL群体在5D染色体上检测到一个贡献率高达51.79％的控制每穗小穗数的主效QTL。Sourdille等在六倍体小麦的2AS、5AL和2BS上检测到了每穗小穗数QTL。Kato等检测到了4个位于5A染色体上的每穗小穗数QTL，其中效应最大的QTL在春化基因Vrn-A1区域。Wang等在“Line3228×Jing”组配的F2:3群体中检测到大量控制每穗小穗数的QTL，分别位于1AS、1AL、4AL、4DL、5AL、5BS、6AL、6DL、7BL和7DL上。Manickavelu利用重组自交系群体在2A、2B和4D染色体上分别检测到了3个、2个和1个控制每穗小穗数的QTL。张坤普等利用双单倍体群体检测到控制每穗小穗数的4个加性QTL，分别位于1B、4A、5D和7A染色体上，还检测到位于染色体2A-2B上的1对上位性QTL。
尽管目前已经定位了如此大量的与小麦每穗小穗数相关的QTL。但是，由于绝大多数这些QTL的表型贡献率较小，且在不同年际及环境间重复性差，所以这些QTL难以应用于小麦每穗小穗数的遗传改良。
WFZP是小麦中已经克隆的一个调控穗型的基因，在小麦基因组中存在三个拷贝：WFZP-A、WFZP-B、WFZP-D。本发明针对其中WFZP-A的启动子区域，开发设计了一种用于鉴定小麦每穗小穗数的引物及相关分子标记。
发明内容
本发明的目的旨在提供一种与小麦每穗小穗数相关的SNP分子标记及其应用。
本发明具体通过以下技术方案实现：
一种与小麦每穗小穗数相关的SNP位点，所述的SNP位点对应于SEQ ID NO.1所示序列自5’末端第1501位碱基。当该位点为A/A纯合时，相对应的基因型是甲，当该位点为G/G纯合时，相对应的基因型是乙。
在本发明的另一方面，还提供了一种利用上述SNP位点鉴定或辅助鉴定小麦基因型的方法，包括对待测小麦基因组DNA中任意一段包括所述SNP位点在内的DNA片段进行PCR扩增，并将该PCR扩增产物进行酶切鉴定的步骤。
所述的PCR扩增的DNA片段为SEQ ID NO.1中5’末端1367-1525bp。
所述的PCR扩增的特异性引物对为SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3组成的引物对1F和1R，SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5组成的引物对2F和2R。
所述的酶切包括以下步骤：以小麦基因组DNA为模板，以引物1F和1R为引物对扩增得到PCR产物；将此PCR产物稀释100倍，以其做为模板，以引物2F和2R为引物对扩增得到PCR产物；用限制性内切酶HinfI酶切PCR产物。
若PCR产物可以被切开，则该核苷酸多态性位点为A/A，基因型为甲；
若PCR产物不能被切开，则该核苷酸多态性位点为G/G，基因型为乙。
被确定为基因型为甲的待测小麦，其每穗小穗数高于被确定为基因型为乙的待测小麦。
在本发明的另一方面，所述的引物对1F和1R、2F和2R也在本发明的保护范围之内。
在本发明的另一方面，本发明还提供了所述的SNP位点在鉴定或辅助鉴定每穗小穗数性状中的应用。
在本发明的另一方面，本发明还提供了所述的引物对1F和1R、2F和2R在鉴定或辅助鉴定每穗小穗数性状中的应用。
在本发明的另一方面，本发明还提供了一种鉴别或辅助鉴别小麦每穗小穗数性状的试剂或试剂盒，所述的试剂或试剂盒包括引物对1F和1R、2F和2R。优选的，还包括限制性内切酶HinfI。
本发明通过对小麦自然变异群体中WFZP基因启动子的遗传变异分析，发现有一个SNP，对应于序列表序列1自5’末端第1501位，该SNP存在两种基因型：基因型甲(A)、基因型乙(G)。通过关联分析证明，这两种单倍型的纯合类型中，每穗小穗数大小为：基因型甲纯合的小麦>基因型乙纯合的小麦。实验证明，通过检测所述SNP，即可找到每穗小穗数相对较高的小麦。本发明为小麦的分子标记辅助选择育种提供了一个新方法，在培育高产小麦品种和研究中具有重要意义。
附图说明
图1是本发明的SNP开发dCAPS标记酶切产物电泳检测结果；其中，用到M为分子量标准；泳道A为被HinfI切开的条带，泳道G为不能被HinfI切开的条带。
具体实施方式
下面将结合本发明具体的实施例，对本发明技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等。如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中所用的小麦材料均来自国家作物种质库(http://icscaas.com.cn/jiguoku/zhongzhiku.htm)，材料信息见中国作物种质信息网，网址：http://icgr.caas.net.cn。
实施例1与小麦每穗小穗数相关的SNP及其PCR-酶切多态性检测
1、扩增含小麦该SNP的基因组片段的特异引物及序列分析
在小麦基因组上的基因WFZP启动子区发现1个SNP，对应于序列表1自5’末端的第1501位、；该位点在小麦自然变异群体中存在两种基因型：
基因型甲：A
基因型乙：G
根据小麦不同基因组的序列差异，设计特异性引物PCR扩增分别包含该SNP位点在内的DNA片段：
F1：GCAGGCATCTTTACACCATCTTA
R1：GGCAGAAGTGAAGTGAGGT
F2：GCAAGGATTGTGGCATGCA
R2：CAAAGAGATGAGGAGAATGTTGAG
以F1和R1为引物对PCR扩增的靶序列如序列表的序列序列1所示的1083-1887位序列；以F2和R2为引物对PCR扩增的靶序列如序列表的序列序列1所示的1367-1525位序列。酶切分析显示，该多态性可分别被HinfI识别。
2、PCR-酶切多态性检测及基因分型方法的建立
1)提取待测小麦的基因组DNA；
2)以步骤1)的基因组DNA为模板，用引物F1和R1进行PCR扩增，PCR扩增的体系(10μL)为：ddH2OμL、10×PCR Buffer 1μL、引物F1(5μmol/L)和引物R1(5μmol/L)各0.3μL、dNTP(2.5μmol/L)0.6μL，Taq酶0.1μL、模板(20ng/μL)0.5μL。
PCR扩增条件为94℃4min；94℃30s，56℃30s，72℃30s，32次循环；72℃10min，16℃保存。
3)将步骤2)的PCR产物稀释100倍，以其为模板，用引物F1和R1进行PCR扩增，PCR扩增的体系(10μL)为：ddH2OμL、10×PCR Buffer 1μL、引物F2(5μmol/L)和引物R2(5μmol/L)各0.3μL、dNTP(2.5μmol/L)0.6μL，Taq酶0.1μL、模板(20ng/μL)0.5μL。
PCR扩增条件为94℃4min；94℃30s，56℃30s，72℃10s，32次循环；72℃10min，16℃保存。
4)将步骤3)得到的PCR产物用HinfI酶切，获得酶切产物，进行4％琼脂糖凝胶电泳检测，记录PCR产物是否被切为两个片段，并根据如下方法判断并记录待测小麦在所述位点的情况：
若所述酶切产物为两个片段，则待测小麦在所述位点为A纯合(表示为A/A)的小麦(图1中的泳道A)；
若所述酶切产物为一个片段，则待测小麦在所述位点为G纯合(表示为G/G)的小麦(图1中的泳道G)。
5)根据步骤4)的结果，将小麦分为在所述位点的情况为如下I、II两种类型：
I：A/A(即基因型甲纯合)；
II：G/G(即基因型乙纯合)；
所述“/”前为一条同源染色体上的情况，所述“/”后为另一条同源染色体上的情况。
3、利用dCAPs标记对自然群体进行分型并与每穗小穗数性状进行关联分析
以323份六倍体小麦组成的自然群体中各小麦分别作为待测小麦，按照步骤2的方法进行分型，随机对部分小麦的扩增产物进行测序验证，结果如表1所示。
表1小麦自然群体中所述多态性位点的情况
实施例2
2015年，在中国农业科学院作物科学研究所实验农场(北京顺义)的旱地，2016年在中国农业科学院作物科学研究所实验农场(北京顺义和昌平)的旱地和水地种植上述自然群体小麦，调查各小麦品种的每穗小穗数，用Tassel2.1软件对每穗小穗数和所述多态性位点的情况进行关联分析，选择混合线性模型+群体结构(MLM+(Q+K))方法进行分析，以P<0.05为显著性水平，结果如表2所示。
表2自然群体中WFZP-A基因多态性位点的情况与每穗小穗数的关联分析结果
表2的关联分析结果表明，表1所示的323份六倍体小麦组成的自然群体形成的两种类型的每穗小穗数差异均达到显著水平(P<0.05)。其中，类型I的小麦每穗小穗数高于类型II的小麦每穗小穗数。几个环境中，类型I的小麦材料的每穗小穗数分别较II的小麦高0.31、0.48、0.40、0.79和0.46个小穗。对自然群体的研究表明，类型I是提高小麦每穗小穗数的优异基因型。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。
序列表
<110> 中国科学院遗传与发育生物学研究所农业资源研究中心
<120> 一种与小麦每穗小穗数相关的SNP位点及其应用
<160> 5
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1887
<212> DNA
<213> 普通小麦(Triticum aestivum L)
<400> 1
aagtactctc tctctatctc tctctctctc tctctctctc tctctctctc tctctcaatg 60
ccttttttga ccccataaag ccatagatta ggctctatag aatggctcta gagagacatg 120
aaagggatag ttctcttgtt tcctgattta atatcgtcac tcctttcgat ttgttccggt 180
ttgaagctcg gcaccggcac gcacatgcgc actaattcgt agaatgtcca gtagggataa 240
agaatcagca taaatccaat gggtttgtag ggataatgat ccttgtccaa gcatttgtct 300
agctcatgca ggcaaagcaa agcttcacta gggaaaagga gtcaaagagg gccctcacct 360
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ggtggcataa gaaagagtgc cttgtacaca tctcacactg ttgttttatc ttgttttgag 480
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ttctagaatc tgagtggtca aggcggatta actttggcct ctgatgatac acacaagact 600
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<210> 2
<211> 23
<212> DNA
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<400> 2
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<211> 24
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Claims (4)
1.一种鉴定与小麦每穗小穗数相关SNP位点的引物组，其特征在于，所述的SNP位点对应于SEQ ID NO.1所示序列自5’末端第1501位碱基，该位点为A/A纯合时，相对应的基因型是甲；该位点为G/G纯合时，相对应的基因型是乙；
所述引物组为SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3组成的引物对1F和1R，和SEQ ID NO.4和SEQID NO.5组成的引物对2F和2R。
2.一种鉴定或辅助鉴定小麦每穗小穗数性状的方法，其特征在于，包括对待测小麦基因组DNA中包含权利要求1所述SNP位点在内的DNA片段进行PCR扩增，并将该PCR扩增产物进行酶切鉴定；
所述的PCR扩增的DNA片段为SEQ ID NO.1中5’末端1367-1525bp；所述的PCR扩增的特异性引物对为SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3组成的引物对1F和1R，SEQ ID NO.4和SEQ IDNO.5组成的引物对2F和2R；
所述的酶切包括以下步骤：以小麦基因组DNA为模板，以引物1F和1R为引物对扩增得到PCR产物；将此PCR产物稀释100倍，以其作为模板，以引物2F和2R为引物对扩增得到PCR产物；用限制性内切酶HinfI酶切PCR产物；若PCR产物可以被切开，则该核苷酸多态性位点为A/A，基因型为甲；若PCR产物不能被切开，则该核苷酸多态性位点为G/G，基因型为乙，基因型为甲的小麦的小麦每穗小穗数大于基因型为乙的小麦的小麦每穗小穗数。
3.权利要求1所述的引物组在鉴定或辅助鉴定小麦每穗小穗数性状中的应用，所述引物组用于检测权利要求1所述SNP位点，所述的SNP位点为A/A纯合时，相对应的基因型是甲；所述的SNP位点为G/G纯合时，相对应的基因型是乙，基因型为甲的小麦的小麦每穗小穗数大于基因型为乙的小麦的小麦每穗小穗数。
4.一种鉴别或辅助鉴别小麦每穗小穗数性状的试剂或试剂盒，其特征在于，所述的试剂或试剂盒包括权利要求1所述引物组。
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