CN116287373A - 小麦穗粒数主效qtl紧密连锁的kasp分子标记及其方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种小麦穗粒数主效QTL紧密连锁的KASP分子标记，小麦穗粒数主效QTL定位在小麦7B染色体的短臂，命名为小麦穗粒数QKns.cau‑7BS；穗粒数QKns.cau‑7BS包括两个紧密连锁的KASP分子标记分别为AX‑110397140和KASP.cau‑7BS，对应物理位置为4,013,158‑11,678,791，可解释穗粒数表型变异的6.07％‑9.19％，加性效应为1.59‑1.98；AX‑110397140的引物组包括AX‑110397140正向引物1、AX‑110397140正向引物2和AX‑110397140共用反向引物；KASP.cau‑7BS的引物组包括KASP.cau‑7BS正向引物1、KASP.cau‑7BS正向引物2和KASP.cau‑7BS共用反向引物；核苷酸序列如SEQ ID NO.1‑6所示。还提供了应用，用于小麦分子育种、小麦穗粒数鉴定和小麦穗粒数检测试剂盒。本发明可提高小麦高产育种的效率。
Description
技术领域
本发明属于分子遗传学技术领域，具体涉及一种小麦穗粒数主效QTL紧密连锁的KASP分子标记及其检测方法与应用。
背景技术
小麦(Triticum aestivum L.)是世界的重要粮食作物，也是中国第二大口粮作物，高产是小麦遗传改良的永恒目标。随着人口不断增长和耕地面积的减少，提高单产是保障小麦总产和保障国家粮食安全的根本途径。小麦产量由单位面积穗数、每穗粒数和千粒重三要素构成。然而，由于品种及环境条件的差异，产量三要素对产量的影响效应各不相同。对我国不同年代和产量水平不同的小麦品种的产量要素分析发现，中国小麦品种穗粒数优异等位基因在传统育种进程中经历了强烈的正向选择，产量的提升与穗粒数的增加直接相关。穗粒数是品种选育时重点考察的农艺性状，是提高产量重要且可靠的关键指标，最终穗粒数决定小麦的产量，因此对小麦穗粒数进行遗传研究，发掘其优异单倍型是小麦高产育种的重要途径。
穗粒数是由多基因控制的数量性状，其表型呈连续变异且易受环境影响。此外，穗粒数表型只有在小麦成株期才能表现，因此基于表型选择的传统育种方法周期长、选择效率低，加大了小麦穗粒数遗传改良难度。随着新一代测序技术和基于芯片分型技术的快速发展，以标记辅助选择为代表的分子育种不受环境和植株生育期等限制，可在苗期进行筛选和鉴定，极大的提高了选择效率和单位时间的遗传增益。因此，发掘控制穗粒数性状的关键遗传位点，鉴定优异等位变异并开发与之紧密连锁的分子标记，对小麦高产育种具有重要理论意义和应用价值。
目前已经定位了大量穗粒数相关QTL，在小麦小麦21条染色体上均有遗传调控位点。Cuthbert等利用Superb和BW278杂交衍生的402个DH家系进行6个环境产量性状鉴定，结合268个SSR标记构建的遗传图谱及基因型值进行QTL定位，共检测到5个控制穗粒数性状的QTL，可解释群体穗粒数表型变异率的7.0-12.8％。Liu等对‘20828’与国审小麦川农16杂交创制的含有199个株系的重组自交系群体进行基因分型，并对小穗数位点进行QTL定位，在2D、4B、5A、5B和5D染色体上共检测到了5个稳定的小穗数QTL。Guan et al.以Nongda3338和Jingdong6构建的DH群体为材料，基于SNP和SSR标记构建了遗传连锁图谱，结合12个环境的表型数据对产量性状进行QTL定位，共检测到34个穗粒数QTL，单个QTL能解释表型变异3.13-21.36％，其中位于4A染色体上的QGus.cau-4A.4为多环境稳定的主效QTL，可解释的表型变异率高达21.36％。Zhang等结合9个不同环境的表型数据对穗粒数进行QTL分析,在1B、2B、2D、4A、4B、5B、6B、7A、7D染色体上共检测到30个与小穗数相关的QTL,其中多个QTL为多个环境中稳定表达的主效QTL。目前已报道的多数穗粒数QTL多为微效QTL，且未开发与之紧密连锁的分子标记，难以直接应用于小麦高产分子育种。
综上，定位小麦穗粒数相关的主效QTL并开发与之紧密连锁的分子标记是开展小麦高产分子育种的重要基础，也是进行小麦重要产量性状基因克隆和分子机理解析的必要前提，可为小麦高产遗传改良和分子设计育种提供重要基因资源和标记信息。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于针对上述现有技术的不足，踢出了一种小麦穗粒数主效QTL紧密连锁的KASP分子标记及其检测方法与应用，本发明在发掘与小麦穗粒数主效QTL紧密连锁的分子标记的基础上，开发并提供了与小麦穗粒数主效QTL的KASP分子标记及其应用。利用该分子标记可以进行辅助选择育种，快速筛选出多小穗数的小麦品系，从而加速小麦高产育种分子进程。
为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：
一种小麦穗粒数主效QTL紧密连锁的KASP分子标记，所述小麦穗粒数主效QTL定位在小麦7B染色体的短臂，命名为小麦穗粒数QKns.cau-7BS；所述穗粒数QKns.cau-7BS包括两个紧密连锁的KASP分子标记分别为AX-110397140和KASP.cau-7BS，对应物理位置为4,013,158-11,678,791，可解释穗粒数表型变异的6.07％-9.19％，加性效应为1.59-1.98；
所述AX-110397140的引物组包括AX-110397140正向引物1、AX-110397140正向引物2和AX-110397140共用反向引物；所述AX-110397140正向引物1的核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示，所述AX-110397140正向引物2的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述AX-110397140共用反向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；
所述KASP.cau-7BS的引物组包括KASP.cau-7BS正向引物1、KASP.cau-7BS正向引物2和KASP.cau-7BS共用反向引物，所述KASP.cau-7BS正向引物1的核苷酸序列如SEQ IDNO.4所示，所述KASP.cau-7BS正向引物2的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，所述KASP.cau-7BS共用反向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。
本发明还提供了上所述的小麦穗粒数主效QTL紧密连锁的KASP分子标记的检测方法，该方法为：
提取小麦基因组DNA，用AX-110397140的引物组和KASP.cau-7BS的引物组对提取的小麦基因组DNA进行PCR扩增；
所述PCR扩增的反应体系为：小麦基因组DNA 50～100ng，KASP引物工作液0.1μl，HiGeno 2x Probe Mix 4.0μl；无菌水补至8μl；
所述PCR扩增的反应程序：95℃预变性10min；95℃变性20s，61℃～55℃退火/延伸40s，其中，61℃～55℃梯度PCR，每循环降低-0.6℃，共10个循环；95℃变性20s，55℃退火/延伸40s，共28～34个循环；12℃保存；
KASP引物工作液包括：正向引物1、正向引物2、共用反向引物和无菌水；所述正向引物1的浓度为12μmol/ml，所述正向引物2的浓度为12μmol/ml，所述共用反向引物的浓度为30μmol/ml；
PCR扩增循环结束后，在终点荧光模式下，利用Bio-rad CFX-96instrument real-time PCR仪器进行荧光信号值读取,37℃读取1min。
分析PCR扩增产物，并进行基因型分型，鉴定小麦穗粒数，具体的分型标准为：如果SNP位点的基因型是纯合的，则仅会生成一种的荧光信号，HEX型荧光显示为蓝色，FAM型荧光显示为橙色，而如果SNP位点是杂合的，则结果将是绿色的荧光信号；空白对照(NTC)荧光显示为黑色。
下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细说明。
附图说明
图1为本发明中QKns.cau-7BS遗传连锁图。
图2为本发明中QKns.cau-7BS近等基因系NIL-JM120/NIL-JM325穗粒数及抽穗期表型。
图3为本发明中KASP.cau-7BS标记JM120/JM325部分RIL群体基因型分型图。
图4为本发明中AX-110397140标记JM120/JM325部分RIL群体基因型分型图。
具体实施方式
实施例1
(1)实验材料及田间种植
实验材料：以冀麦120(JM120)和冀麦325(JM325)为亲本构建的193个高代重组自交系定位群体RIL(Recombinant Inbreed Lines)，亲本JM325和JM120穗粒数存在明显差异，单株稀播充分生长的条件下，JM120平均穗粒数63粒，JM325平均穗粒数88粒。所述JM120和JM325分别是于2015年和2016年通过河北省和国家黄淮北片麦区审定的品种。
田间种植：将JM120和JM325以及构建的高代RIL群体分别于2019年10月种植于河北省邯郸市(环境E1)、2020年10月种植于河北省邯郸市(环境E2)和河北省石家庄市(环境E3)三个环境，设置2个重复，亲本和RIL群体双行种植，行长2m，行距30cm，每行点播40粒。采用随机区组设计，田间管理按照普通大田生产标准进行。
本实施例中对穗粒数(kernel number per spike，KNS)进行表型测量，所述穗粒数均为每株的主茎单穗上所有结实籽粒的数量。对三个环境下JM120/JM325构建的RIL群体的穗粒数表型数据利用SPSS version 20.0(SPSS，Chicago，IL，USA)和Microsoft Excel等软件进行统计分析。
(2)SNP基因分型及遗传连锁图谱的构建
提取亲本JM120和JM325及其衍生的193个RIL群体的全基因组DNA，使用55K SNP(Affymetrix 55K SNP Array，CapitalBio Technology Company,Beijing,China)芯片对两亲本和RILs群体进行基因分型，该芯片在本群体中共检测到11975个SNP多态性标记，其中7B染色体上共810个亲本间具有多态性标记。利用软件JoinMap 4.0构建遗传连锁图谱；
所述遗传连锁图谱构建流程如下：首先挑选出具有亲本多态性的SNPs，对其中基因型缺失率＞10％的SNPs进行过滤，基于过滤后的高质量SNPs，利用回归映射(Regressionmapping)的作图方法，选择Kosambi函数进行遗传连锁图谱构建，设置不同的检测(LOD)阈值，最终获得遗传连锁图谱；
(3)穗粒数主效QTL初级定位
利用IciMapping 4.2软件进行穗粒数主效QTL的定位，设置步长为1.0cM，p值以0.001为临界值，统计检测阈值LOD为2.5，即当LOD＞2.5时认为该处存在一个真实有效的QTL。QTL加性效应正负表明增效等位变异分别来自JM120和JM325，JM325基因型赋值为0，JM120基因型赋值为2，因此，当加性效应为正值时，表明增效等位变异来自于JM120，反之，则表明增效等位变异来自于JM325。所述QTL定位是利用IciMapping 4.2软件的复合区间作图法进行QTL区间的计算。
利用小麦55K SNP芯片对JM120/JM325构建的高代RIL群体193个家系基因型进行检测，将基因型检测结果与E1、E2和E3三个环境穗粒数表型数据进行整合分析，利用软件IciMapping 4.2的完备区间作图法进行穗粒数QTL定位分析。
以JM120/JM325构建的高代RIL群体为材料进行穗粒数QTL定位，结果表明，在小麦7B染色体上检测到一个主效且稳定的穗粒数QTL，即QKns.cau-7BS，该位点位于AX-110397140-AX-109278740之间，LOD值为4.94～6.56，变异率7.76％-12.04％，加性效应为1.94-2.12，遗传距离为8cM,增效等位基因(Allele)来自于亲本JM120。
(4)QKns.cau-7BS区间标记的加密
根据QKns.cau-7BS侧翼55K SNP芯片序列所在的染色体位置，利用冀麦120和冀麦325重测序及外显子捕获(Exon capture)序列信息，获得QKns.cau-7BS区间内的基因组序列，根据亲本间序列的SNP信息并将其转化成KASP(Kompetitive allele specific PCR)标记。经亲本间PCR扩增及RIL群体验证，获得目标QTL区间内两对多态性KASP标记并通过RIL群体将其加密于目标QTL区段。利用加密的遗传连锁图进行千粒重QTL的遗传定位。
具体过程及引物序列信息如下：
①分子标记AX-110397140的引物组包括AX-110397140正向引物1、AX-110397140正向引物2和AX-110397140共用反向引物；
AX-110397140正向引物1的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述AX-110397140正向引物2的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述AX-110397140共用反向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；
AX-110397140正向引物1和AX-110397140正向引物2中分别在5’末端连上FAM和HEX接头(adaptor)序列，作为KASP正向引物来分别检测主效QKns.cau-7B紧密连锁标记，AX-110397140的单核苷酸标记(SNP)的多态性，其中，等位基因为JM120类型接FAM荧光基团，等位基因为JM325类型接HEX荧光基团。
②分子标记KASP.cau-7BS的引物组包括KASP.cau-7BS正向引物1、KASP.cau-7BS正向引物2和KASP.cau-7BS共用反向引物；
所述KASP.cau-7BS正向引物1的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，所述KASP.cau-7BS正向引物2的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，所述KASP.cau-7BS共用反向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示；
KASP.cau-7BS正向引物1和KASP.cau-7BS正向引物2中分别在5’末端连上FAM和HEX接头(adaptor)序列，作为KASP正向引物来分别检测主效QKns.cau-7B紧密连锁标记，KASP.cau-7BS的单核苷酸(SNP)位点的多态性,其中，等位基因为JM120类型接FAM荧光基团，等位基因为JM325类型接HEX荧光基团。
(5)KASP标记的实施
S1、引物配置：新合成的引物(primer)的浓度稀释为100μMol/mL，然后按表2比例配置成引物工作液：
表2 KASP引物工作液成分、体积及浓度
| 成分 | 体积(μl) | 工作液浓度(μM/L) |
| Forward primer-FAM(100μM/L) | 12 | 12 |
| Forward primer-HEX(100μM/L) | 12 | 12 |
| Common reverse primer(100μM/L) | 30 | 30 |
| Pure water | 46 | - |
| Total | 100 | - |
S2、KASP标记PCR反应体系及程序：
PCR扩增的反应体系为：小麦基因组DNA 50～100ng，KASP引物工作液0.1μl，HiGeno 2x Probe Mix 4.0μl；无菌水补至8μl；
KASP引物工作液包括：正向引物1、正向引物2、共用反向引物和无菌水；所述正向引物1的浓度为12μmol/ml，所述正向引物2的浓度为12μmol/ml，所述共用反向引物的浓度为30μmol/ml；
PCR扩增的反应程序：95℃预变性10min；95℃变性20s，61℃～55℃退火/延伸40s，其中，61℃～55℃梯度PCR，每循环降低-0.6℃，共10个循环；95℃变性20s，55℃退火/延伸40s，共28～34个循环；12℃保存；PCR扩增循环结束后，在终点荧光模式下，利用Bio-radCFX-96instrument real-time PCR仪器进行荧光信号值读取,37℃读取1min(图3、图4)。
图4中坐标及横坐标数字分别表示HEX和FAM荧光性信号的强度；圆点表示携带JM120等位基因型(多穗粒数型)；正方形表示携带JM325等位基因型(少穗粒数型)；三角形表示杂合基因型，左下角为NTC阴性对照。
(6)穗粒数主效QTL QKns.cau-7BS紧密连锁标记的开发
利用“冀麦120/325”193个RIL系群体，结合QKns.cau-7B区间内的新开发的KASP.cau-7BS多态性KASP标记进行基因型检测，其中基因型与冀麦120(JM120)相同的接FAM荧光基团，荧光信号颜色显示为橙色，基因型与冀麦325(JM325)相同的接HEX荧光基团，荧光信号颜色显示为蓝色，杂合基因型荧光信号显示为绿色，无信号的显示为黑色。借助JoinMap 4.0重新进行遗传图谱构建，获得目标区段标记间新的遗传连锁图谱(图1，左侧数字表示各分子标记间的相对遗传距离，单位为cM)。图1中▲，◆，
分别表示邯郸(2019)、邯郸(2020)和石家庄(2020)穗粒数QTL定位区间。
利用加密后的图谱信息，通过“冀麦120/325”RIL群体，结合2019年河北邯郸(E1)、2020年河北邯郸(E2)和2020年河北石家庄(E3)三个不同环境下穗粒数表型数据，利用IciMapping4.2软件的复合区间作图法的对穗粒数进行QTL定位，参数设置如下：步长为1.0cM，P值以0.001为临界值，统计检测阈值为LOD＝2.5。穗粒数QTL定位结果如表1所示，穗粒数QTL QKns.cau-7BS定位在AX-110397140-KASP.cau-7BS之间，其LOD值为4.15-7.35，可解释穗粒数表型变异的6.07％-9.19％，加性效应为1.59-1.98，遗传距离为6cM,增效等位基因(Allele)来自于亲本JM120。AX-110397140和KASP.cau-7BS可作为目标QTL紧密连锁的分子标记。
表1冀麦120/冀麦325构建的RIL群体穗粒数QTLQKns.cau-7BS效应分析
(7)穗粒数主效QTL位点QKns.cau-7BS遗传效应的验证
利用其侧翼标记(AX-110397140和KASP.cau-7BS)，在重组自交系定位群体中筛选目标区段的剩余杂合体(Residual heterozygous RIL)用于构建QKns.cau-7B的近等基因系(Near Isogenic Line)。根据两侧侧翼标记检测NIL穗粒数多/少基因型纯合个体作为目标QTL的近等基因系用于穗粒数大小遗传效应的验证。
由JM120和JM325构建的高代RIL群体中，利用QKns.cau-7B侧翼标记AX-110397140和KASP.cau-7BS，筛选RILs群体基因型，鉴定到该群体的Line-28在该侧翼标记位点为杂合类型。根据其两侧侧翼标记的基因型，Line-28自交产生的JM120/JM325基因型纯合个体作为QKns.cau-7BS的近等基因系用于该位点穗粒数遗传效应的验证，利用软件graphpadprism 9.0对构建的近等基因系NIL-120和NIL-325穗粒数及抽穗期表型均值进行差异显著性检验。结果如图2所示，QKns.cau-7BS近等基因系NIL-120和NIL-325的平均穗粒数(KNS)分别为69.92和64.21，穗粒数表型数据表现为极显著差异(p＜0.01)；近等基因系NIL-120和NIL-325平均抽穗天数(HD)分别为194.6d和192.6d，抽穗表型数据表现为极显著差异(p＜0.01)；近等基因系NIL-JM120和NIL-JM325进一步验证了该位点的遗传效应稳定性，且该位点可能存在一因多效效应，能同时影响小麦穗粒数及抽穗期。
综上，AX-110397140和KASP.cau-7BS标记与穗粒数QTL QKns.cau-7B紧密连锁，为共显性标记(图3，图4)，其穗粒数增效等位变异来自于冀麦120。AX-110397140和KASP.cau-7BS在小麦高产标记辅助选择育种中具有重要的应用价值。
具体分型方法如下：基因分型系统包含有两个竞争性的等位基因特异的正向引物和一个通用反向引物。两个正向引物3'末端存在单碱基的差异，5'端分别带有不同的接头序列。HiGeno 2x Probe Mix中包含有两个不同的荧光探针，两个探针的5'端分别标记有FAM和HEX荧光基团，中间特定碱基带有特异的淬灭基团，3'端序列则分别与正向引物5'端接头序列互补；通过发夹结构，探针的荧光基团与淬灭基团相互靠近，在PCR无扩增情况下，淬灭基团吸收荧光基团的发射光，检测不到荧光信号；HiGeno DNA Polymerase是一种高保真的热启动DNA聚合酶，在碱基存在错配的情况下不能对DNA模板进行有效扩增。
为保证基因分型数据的准确性，除测试样品外，还需在PCR板上使用对照样品，在每个基因分型板上包括两个无模板对照孔。无模板对照孔的荧光信号强度与模板DNA孔的信号强度差异可以提高对基因分型数据有效性的检测。通常，无模板对照样品的信号值位于原点，无模板对照孔中观察到的任何扩增都表明存在污染或非特异性扩增。在分型实验中，也需要使用阳性对照样品，阳性对照样品应该是已知基因型DNA样品。在实验中，阳性对照样品应聚集在其基因型的预期区域中。综上，根据无模板对照孔及阳性对照样品结合实验样品基因分型结果来综合判定待检测样品基因型。如图3和图4所示，圆点表示携带JM120等位基因型(多穗粒数型)；正方形表示携带JM325等位基因型(少穗粒数型)；三角形表示杂合基因型，NTC为阴性对照。
本发明小麦穗粒数主效QTL紧密连锁的KASP分子标记能应用于小麦分子育种中，用于鉴定小麦穗粒数，还能用于小麦穗粒数检测试剂盒。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例，并非对本发明作任何限制。凡是根据发明技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、变更以及等效变化，均仍属于本发明技术方案的保护范围内。
Claims (5)
1.一种小麦穗粒数主效QTL紧密连锁的KASP分子标记，其特征在于，所述小麦穗粒数主效QTL定位在小麦7B染色体的短臂，命名为小麦穗粒数QKns.cau-7BS；所述穗粒数QKns.cau-7BS包括两个紧密连锁的KASP分子标记分别为AX-110397140和KASP.cau-7BS，对应物理位置为4,013,158-11,678,791，可解释穗粒数表型变异的6.07％-9.19％，加性效应为1.59-1.98；
所述AX-110397140的引物组包括AX-110397140正向引物1、AX-110397140正向引物2和AX-110397140共用反向引物；所述AX-110397140正向引物1的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述AX-110397140正向引物2的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述AX-110397140共用反向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；
所述KASP.cau-7BS的引物组包括KASP.cau-7BS正向引物1、KASP.cau-7BS正向引物2和KASP.cau-7BS共用反向引物，所述KASP.cau-7BS正向引物1的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，所述KASP.cau-7BS正向引物2的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，所述KASP.cau-7BS共用反向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。
2.一种如权利要求1所述的小麦穗粒数主效QTL紧密连锁的KASP分子标记的检测方法，其特征在于，该方法为：
提取小麦基因组DNA，用AX-110397140的引物组和KASP.cau-7BS的引物组对提取的小麦基因组DNA进行PCR扩增；
所述PCR扩增的反应体系为：小麦基因组DNA 50～100ng，KASP引物工作液0.1μl，HiGeno 2x Probe Mix 4.0μl；无菌水补至8μl；
所述PCR扩增的反应程序：95℃预变性10min；95℃变性20s，61℃～55℃退火/延伸40s，其中，61℃～55℃梯度PCR，每循环降低-0.6℃，共10个循环；95℃变性20s，55℃退火/延伸40s，共28～34个循环；12℃保存；
KASP引物工作液包括：正向引物1、正向引物2、共用反向引物和无菌水；所述正向引物1的浓度为12μmol/ml，所述正向引物2的浓度为12μmol/ml，所述共用反向引物的浓度为30μmol/ml。
3.一种如权利要求1所述的小麦穗粒数主效QTL紧密连锁的KASP分子标记的应用，其特征在于，所述小麦穗粒数主效QTL紧密连锁的KASP分子标记在小麦分子育种中的应用。
4.一种如权利要求1所述的小麦穗粒数主效QTL紧密连锁的KASP分子标记的应用，其特征在于，所述小麦穗粒数主效QTL紧密连锁的KASP分子标记在小麦穗粒数鉴定中的应用。
5.一种如权利要求1所述的小麦穗粒数主效QTL紧密连锁的KASP分子标记的应用，其特征在于，所述小麦穗粒数主效QTL紧密连锁的KASP分子标记用于小麦穗粒数检测试剂盒。
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