CN112779348A - 一种小麦单位面积穗数主效qtl位点及紧密连锁的kasp引物和应用 - Google Patents

一种小麦单位面积穗数主效qtl位点及紧密连锁的kasp引物和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种小麦单位面积穗数主效QTL位点及紧密连锁的KASP引物和应用，该主效QTL位点QSn.sau‑2D.2在小麦的2D染色体上，在中国春参考基因组上的物理位置为82.2Mb‑95.9Mb之间，其两侧的SNP分子标记分别是AX‑110544009和AX‑109283238。本发明首次公开了一个控制小麦单位面积穗数的主效QTL位点QSn.sau‑2D.2，这是一个位于2D染色体上物理位置82.2Mb‑95.9Mb的新的控制小麦单位面积穗数的QTL，此QTL能够显著地增加小麦单位面积穗数，对于小麦高产育种具有很高的价值。

Description

一种小麦单位面积穗数主效QTL位点及紧密连锁的KASP引物 和应用
技术领域
本发明涉及一种小麦单位面积穗数主效QTL位点，具体涉及一种小麦单位面积穗数主效QTL位点及紧密连锁的KASP引物和应用。
背景技术
小麦是世界上最重要的粮食作物之一，“养育”了世界范围内大约三分之一的人口，在所有的人类食物中，提供的蛋白质和卡路里大约占到了20％左右。此外，小麦同时也是我国第二大粮食作物，小麦的产量与国家粮食安全息息相关。作为小麦产量三要素之一的单位面积穗数，与小麦产量更是直接相关，提高小麦的单位面积穗数一直以来也是小麦的重要育种目标。
研究表明，小麦的单位面积穗数是由多基因控制的,并且相对于小麦的另外两个产量要素千粒重和穗粒数来说更容易受到环境的影响。因此在多环境实验中，很少有小麦单位面积穗数稳定且主效的QTL位点报道。Li等人的研究表明，4B染色体上存在一个控制单位面积穗数并且横跨矮秆基因Rht-B1的QTL(Li F,WenW,He Z，et al.Genome-widelinkage mapping ofyield-related traits in three Chinese bread wheatpopulations using high-density SNP markers[J].TheorAppl Genet，2018，131：1903-1924)。Heidari等人通过构建双单倍体群体，在两个环境下将控制单位面积穗数的QTL定位在了1A染色体上，平均解释表型变异率为10.5％(Heidari B,Sayed-Tabatabaei B E,Saeidi G,et al.Mapping QTL for grain yield,yield components,and spikefeatures in a doubled haploidpopulation ofbread wheat[J].Genome,2011,54(6):517-527)。
小麦品种川农18是2003年由四川省品种审定委员会审定，具有分蘖能力强，成穗数高，千粒重高，单穗较大的特点(RenTH,Chen F,et al.Application of 1RS.1BLTranslocation in the Breeding of"Chuannong"Series Wheat Cultivars[J].JournalofTriticeae Crops,2011)。而小麦材料T1208相对于川农18，千粒重更低，分蘖能力更弱，单位面积穗数也更少。因此利用川农18和T1208构建高代自交群体，定位控制单位面积穗数的基因，寻找紧密连锁的分子标记，促进控制单位面积穗数基因的图位克隆，为小麦高产育种提供新的基因资源，进一步利用与该基因紧密连锁的分子标记进行育种的辅助选择，将提高育种效率，增强单位面积穗数预测的准确性，达到提高育种效率的目的。
传统的杂交育种可以将不同的优良等位基因聚合在一起，从而获得理想性状。但是对于其遗传的分子机制并不了解，并且育种时间长。分子标记辅助育种则能够很好地解决这一问题，它允许目标性状的早期世代选择，尤其是当一些性状受到复杂的遗传控制或不易研究时。竞争性等位基因特异性PCR(KompetitiveAllele Specific PCR)技术目前已经成为国内外主流的基因分型方法之一，是由英国LGC(Laboratory ofthe GovernmentChemist政府化学家实验室)有限公司开发的。该技术利用引物与模板之间的碱基错配可以有效地抑制PCR反应，进而达到模板区分(等位基因区分)的目的。相比于Taqman探针，KASP方法通过荧光探针来代替针对位点的荧光探针，大大节约成本。另外，KASP技术可以在短时间内实现大规模的样本检测，具有准确性高稳定性强的特点。
因此，开发与控制单位面积穗数基因紧密连锁的分子标记，并且利用该标记筛选出单位面积穗数性状优良的小麦品种，对于小麦的高产育种奠定具有重要意义。
发明内容
本发明的目的是提供一种小麦单位面积穗数主效QTL位点及紧密连锁的KASP引物和应用，该主效QTL位点QSn.sau-2D.2能够显著地增加小麦单位面积穗数，对于小麦高产育种具有很高的价值。
为了达到上述目的，本发明提供了一种小麦单位面积穗数主效QTL位点QSn.sau-2D.2，该主效QTL位点QSn.sau-2D.2在小麦的2D染色体上，在中国春参考基因组IWGSCRefSeqv1.0上的物理位置为82.2Mb-95.9Mb之间，其两侧的SNP分子标记分别是AX-110544009和AX-109283238。
本发明的另一目的是提供针对SNP分子标记AX-111151907的KASP引物，该KASP引物的正向引物1的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，其正向引物2的核苷酸序列如SEQ IDNO.3所示，其反向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；其中，所述正向引物1和正向引物2的5’端连接有不同的荧光标签序列。
优选地，所述正向引物1的5’端连接有F探针，F探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；所述正向引物2的5’端连接有H探针，H探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。
本发明的另一目的是提供一种鉴定小麦单位面积穗数主效QTL位点QSn.sau-2D.2的试剂盒，该试剂盒中的引物为所述的KASP引物。
本发明的另一目的是提供一种鉴定单位面积穗数主效QTL QSn.sau-2D.2的方法，该方法包含：利用所述的KASP引物进行荧光定量PCR扩增，根据PCR扩增结果对待测小麦材料进行基因分型，为：若待测小麦材料出现KASP引物的正向引物1的荧光探针的荧光信号，而不含有正向引物2的荧光探针的荧光信号，则该待测小麦材料含有所述的小麦单位面积穗数主效QTL位点QSn.sau-2D.2；若待测小麦材料出现KASP引物的正向引物2的荧光探针的荧光信号，而不含有正向引物1的荧光探针的荧光信号，则该待测小麦材料不含所述的小麦单位面积穗数主效QTL位点QSn.sau-2D.2。
优选地，含有所述的小麦单位面积穗数主效QTL位点QSn.sau-2D.2的待测小麦材料的基因型记为A基因型，不含所述的小麦单位面积穗数主效QTL位点QSn.sau-2D.2的待测小麦材料的基因型记为B基因型，所述A基因型小麦株系的单位面积穗数显著性高于B基因型小麦株系。
优选地，所述荧光定量PCR扩增的反应体系包含：KASP Mastermix、所述的KASP引物、待测小麦材料的基因组DNA、RNase-free去离子水；其中，所述KASP引物中，正向引物1、正向引物2和反向引物的体积比为2:2:5。
优选地，所述荧光定量PCR扩增的反应程序包含：95℃预变性10min；95℃变性20s；61℃退火延伸40s，循环10次，每次循环退火延伸温度下降0.6℃；95℃变性20s；55℃退火延伸40s；循环30次；25℃保温，采集荧光信号。
本发明的另一目的是提供针对SNP分子标记AX-111151907设计的KASP引物的应用，该应用包含以下任意一种：
(1)在用于检测单位面积穗数主效QTL位点QSn.sau-2D.2和基因定位中的应用；
(2)在选育和创制不同单位面积穗数的小麦资源中的应用；
(3)在用于推广单位面积穗数主效QTL位点QSn.sau-2D.2与小麦的其它优良性状位点间聚合育种的应用。
本发明的小麦单位面积穗数主效QTL位点及紧密连锁的KASP引物和应用，具有以下优点：
本发明首次公开了一个控制小麦单位面积穗数的主效QTL位点QSn.sau-2D.2，这是一个位于2D染色体上物理位置82.2Mb-95.9Mb的新的控制小麦单位面积穗数的QTL，此QTL能够显著地增加小麦单位面积穗数，对于小麦高产育种具有很高的价值。
此外，本发明还提供了基于荧光定量PCR平台精确检测川农18单位面积穗数新的QTL QSn.sau-2D.2的KASP分子标记KASP-AX-111151907，此分子标记与QSn.sau-2D.2紧密连锁，呈现共分离标记特征，具有扩增稳定，检测方便快捷的特点，可用于分子标记辅助育种，可以促进单位面积穗数主效QTL QSn.sau-2D.2在高产小麦育种中的应用。而且，此分子标记可以大大减少表型鉴定工作，在小麦苗期就可以利用，从而淘汰非目标植株，节约育种成本，提高育种效率。
附图说明
图1为控制单位面积穗数的主效QTL QSn.sau-2D.2在染色体上的位置。
图2为本发明在实验例2中的KASP分子标记KASP-AX-111151907利用荧光定量PCR对亲本川农18和T1208三叶期DNA基因分型的结果。
图3为本发明在实验例3中的KASP分子标记KASP-AX-111151907利用荧光定量PCR在川农18×T1208高代自交群体后代中基因分型的结果。
具体实施方式
下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1单位面积穗数主效QTL QSn.sau-2D.2及KASP-AX-111151907分子标记的获得
(1)以成穗数高的材料川农18为母本，以小麦材料T1208为父本杂交获得F1代，F1代自交得到F2代，通过单粒传法获得含有371个株系的高代自交遗传群体；
(2)利用55K SNP基因芯片对川农18×T1208构建的包含371个株系(F11-F13)的重组自交群体进行基因组扫描，构建连锁遗传图谱，遗传连锁图谱覆盖小麦的21条染色体，全长4192.62cM；
(3)在2015-2016,2016-2017,2017-2018年间种植于四川农业大学邛崃小麦育种基地(四川省邛崃市前进镇，北纬30°25′，东经103°28′，海拔493.3m)。采用随机区组设计，小区行长2m，每行10株，行距0.25m，每个株系种植4行，三次重复，栽培管理同大田标准化管理方法，使用除草剂和杀菌剂，以保证生长过程中田间无虫害和病害；
(4)单位面积穗数调查则是成熟时期每行调查5株，每个株系三个重复，最后取平均值，再乘以4得到单位面积的成穗数，结合三个环境的单位面积穗数表型数据，利用软件IciMapping 4.1进行QTL定位，最终在小麦的2D染色体定位到一个来源于川农18的控制单位面积穗数并且三个环境下都检测到的主效QTL QSn.sau-2D.2，平均LOD值达到17.20，平均解释表型变异率达到19.04％。此QTL两侧的SNP分子标记分别是AX-110544009和AX-109283238，在中国春参考基因组上的物理位置为82.2Mb-95.9Mb之间；
(5)通过查找位于此QTL区间内的SNP分子标记，查找了5个SNP分子标记，即AX-109283238(SEQ ID NO.19，第36位的碱基具有C或T多态性，序列表中用n表示)、AX-111151907(SEQ ID NO.1，第36位的碱基具有G或T多态性，序列表中用n表示)、AX-86163992(SEQ ID NO.20，第36位的碱基具有A或G多态性，序列表中用n表示)、AX-108802182(SEQ IDNO.21，第36位的碱基具有A或G多态性，序列表中用n表示)和AX-110073027(SEQ ID NO.22，第36位的碱基具有G或T多态性，序列表中用n表示)。随后利用SNP分子标记的序列在PolyMarker网站上设计成KASP引物，一共针对5个SNP标记，将其序列转化为KASP引物，所涉及到的引物序列如下表1所示，每一对引物由3条序列组成，即：正向引物1：F探针+扩增引物序列；正向引物2：H探针+扩增引物序列；反向引物：扩增引物序列；其中，F探针和H探针的核苷酸序列如下：
F探针(SEQ ID NO.5)：5’-GAAGGTGACCAAGTTCATGCT-3’(可结合FAM荧光基团)
H探针(SEQ ID NO.6)：5’-GAAGGTCGGAGTCAACGGATT-3’(可结合HEX荧光基团)
表1为五对KASP引物序列
Figure BDA0002879479890000061
实验例2亲本之间KASP分子标记多态性引物筛选
(1)采用CTAB法提取亲本川农18和T1208三叶期的DNA；
(2)利用上述合成的引物进行荧光定量PCR扩增，根据PCR扩增结果对亲本小麦进行多态性分析。所选的荧光定量PCR扩增的反应体系：KASP Mastermix 4.5μL，KASPAssayMix 2μL，50ng模板DNA，RNase-free去离子水加至总量为10μL，其中KASPAssay Mix含有的每对引物核苷酸序列如表1所示，三条引物体积比分别为2:2:5；
荧光定量PCR反应程序如下所示：95℃预变性10min；95℃变性20s；61℃退火延伸40s，循环10次，每次循环退火延伸温度下降0.6℃；95℃变性20s；55℃退火延伸40s；循环30次；25℃保温，采集荧光信号；
(3)亲本之间多态性分子标记的筛选，最终筛选出一对引物在亲本川农18和T1208之间具有良好的多态性，命名为KASP-AX-111151907，对亲本基因型分型结果如图1所示，亲本川农18具有的基因型的荧光类型是FAM荧光基团类型，T1208具有的基因型的荧光类型是HEX荧光基团类型。
实验例3 KASP-AX-111151907分子标记在川农18×T1208高代自交群体中的应用
采用与上述相同的方法随机选取川农18×T1208高代自交群体中的109个株系(包括两个亲本)提取DNA进行荧光定量PCR基因分型，最终结果与川农18相同荧光信号的记为A基因型，与T1208相同荧光信号的记为B基因型，最终可以看到，带有A基因型的株系有47个，B基因型的株系有62个，并且带有A基因型株系的单位面积穗数显著性高于B基因型株系的单位面积穗数，结果如表2和表3所示。
表2为川农18×T1208高代自交群体中的109个株系的基因分型
Figure BDA0002879479890000071
Figure BDA0002879479890000081
Figure BDA0002879479890000091
Figure BDA0002879479890000101
注：A:和川农18相同；B:和T1208相同；单位为:个/每平方米。
表3为t检验结果
Figure BDA0002879479890000102
注：括号内数字表示携带相应基因型材料株系数量。
尽管本发明的内容已经通过上述优选实施例作了详细介绍，但应当认识到上述的描述不应被认为是对本发明的限制。在本领域技术人员阅读了上述内容后，对于本发明的多种修改和替代都将是显而易见的。因此，本发明的保护范围应由所附的权利要求来限定。
序列表
<110> 四川农业大学
<120> 一种小麦单位面积穗数主效QTL位点及紧密连锁的KASP引物和应用
<160> 22
<170> SIPOSequenceListing 1.0
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Claims (9)

1.一种小麦单位面积穗数主效QTL位点QSn.sau-2D.2，其特征在于，该主效QTL位点QSn.sau-2D.2在小麦的2D染色体上，在中国春参考基因组IWGSC RefSeq v1.0上的物理位置为82.2Mb-95.9Mb之间，其两侧的SNP分子标记分别是AX-110544009和AX-109283238。
2.针对SNP分子标记AX-111151907的KASP引物，其特征在于，该KASP引物的正向引物1的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，其正向引物2的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，其反向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；其中，所述正向引物1和正向引物2的5’端连接有不同的荧光标签序列。
3.根据权利要求2所述的KASP引物，其特征在于，所述正向引物1的5’端连接有F探针，F探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；所述正向引物2的5’端连接有H探针，H探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。
4.一种鉴定小麦单位面积穗数主效QTL位点QSn.sau-2D.2的试剂盒，其特征在于，该试剂盒中的引物为权利要求2或3所述的KASP引物。
5.一种鉴定单位面积穗数主效QTL QSn.sau-2D.2的方法，其特征在于，该方法包含：
利用如权利要求2或3所述的KASP引物进行荧光定量PCR扩增，根据PCR扩增结果对待测小麦材料进行基因分型，为：
若待测小麦材料出现KASP引物的正向引物1的荧光探针的荧光信号，而不含有正向引物2的荧光探针的荧光信号，则该待测小麦材料含有如权利要求1所述的小麦单位面积穗数主效QTL位点QSn.sau-2D.2；
若待测小麦材料出现KASP引物的正向引物2的荧光探针的荧光信号，而不含有正向引物1的荧光探针的荧光信号，则该待测小麦材料不含如权利要求1所述的小麦单位面积穗数主效QTL位点QSn.sau-2D.2。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，含有如权利要求1所述的小麦单位面积穗数主效QTL位点QSn.sau-2D.2的待测小麦材料的基因型记为A基因型，不含如权利要求1所述的小麦单位面积穗数主效QTL位点QSn.sau-2D.2的待测小麦材料的基因型记为B基因型，所述A基因型小麦株系的单位面积穗数显著性高于B基因型小麦株系。
7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述荧光定量PCR扩增的反应体系包含：KASP Mastermix、如权利要求2或3所述的KASP引物、待测小麦材料的基因组DNA、RNase-free去离子水；其中，所述KASP引物中，正向引物1、正向引物2和反向引物的体积比为2:2:5。
8.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述荧光定量PCR扩增的反应程序包含：95℃预变性10min；95℃变性20s；61℃退火延伸40s，循环10次，每次循环退火延伸温度下降0.6℃；95℃变性20s；55℃退火延伸40s；循环30次；25℃保温，采集荧光信号。
9.针对SNP分子标记AX-111151907设计的KASP引物的应用，其特征在于，该应用包含以下任意一种：
(1)在用于检测单位面积穗数主效QTL位点QSn.sau-2D.2和基因定位中的应用；
(2)在选育和创制不同单位面积穗数的小麦资源中的应用；
(3)在用于推广单位面积穗数主效QTL位点QSn.sau-2D.2与小麦的其它优良性状位点间聚合育种的应用。
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