CN109735652A - 小麦抗条锈病基因QYr.nwafu-6BL.2的连锁KASP分子标记、引物及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于小麦基因检测技术领域，特别涉及一种小麦抗条锈病主效应位点基因QYr.nwafu‑6BL.2的连锁KASP分子标记、引物及应用，该所述分子标记为分子标记KASP‑630和分子标记KASP‑162。本发明的两个分子标记的组合使用对条锈病主效位点QYr.nwafu‑6BL.2的预测准确率高达98％。
Description
技术领域
本发明属于小麦基因检测技术领域，特别涉及一种小麦抗条锈病基因QYr.nwafu-6BL.2的连锁KASP分子标记、引物及应用。
背景技术
小麦是我国最重要的粮食作物，保障小麦高产稳产既是人民生活基本需求的必然，也是维护国家和世界粮食安全的战略选择。影响小麦高产稳产因素有很多，其中环境大体分为生物胁迫和非生物胁迫，真菌病害是影响小麦生产安全的重要生物胁迫因素。小麦条锈病是世界性小麦病害，全球大多数小麦产区均有发生，中国是小麦条锈病发病面积最大，损失最严重的国家之一。小麦条锈病是由Puccinia striiformis West.f.sp.triticiEriks.&Henn.(条形柄锈菌小麦专化型，简称Pst)导致的气传叶部病害。解放后，条锈病在我国发生了多次，且造成大量减产。进入本世纪以来，由于小麦条锈菌毒性变异和新小种产生，小麦条锈病已在我国小麦产区连续流行了近10年，每年损失小麦在上亿公斤，因此防治和控制该病害是一项长期任务。长期研究和实践证明利用抗病品种是防治小麦条锈病最为经济有效的重要措施。因而要确保我国粮食安全生产，实现病害持久控制，就必须开展挖掘和利用新的抗病基因，选育抗病品种，进行抗病基因合理布局稳定病菌群体结构，为病害持久控制策略的制定提供理论依据。
优异的抗性来源是抗病育种的基础。目前我国小麦抗病品种利用所面临的突出问题是：小麦条锈病抗源较单一、匮乏；生产上大面积种植单一抗性基因的品种，使新毒性小种在寄主选择压力下很快发展为优势小种，导致品种抗病性“丧失”。利用与抗病基因连锁的分子标记培育抗病品种是控制小麦条锈病的有效措施。到目前为止，超过80个小麦抗条锈基因已经在普通小麦及其野生近缘属中被命名。但它们中的大多数至少在世界的某些地方已经失去抗病性。主效抗性基因，一般由单个基因就可提供近免疫的抗病性，而成株抗病性(adultplantresistance,APR)被认为是由多基因控制且有加性效应。由多个基因控制的数量性状位点与单个基因控制的抗病性相比，它的优势是抗性更持久。微效抗病基因通常对病原菌的作用方式会有一些变化，因此病原菌更难以克服其抗性。这些基因的抗病机制主要是抑制病菌生长，包括延长病菌潜育期，减少孢子堆的大小，减少侵染频率和降低孢子产量。因此，要解决小麦品种抗病性丧失的问题，首要任务是寻找有效新抗源、发掘新抗病基因，从而提高小麦生产品种抗病基因的多样性，培育并合理使用不同类型的抗病基因。
明确小麦抗病基因的类型、位置和遗传机制是聚合成株抗性的基础，QTL定位可提供位点数目、在染色体上的位置及效应大小等重要信息，与其紧密连锁的分子标记可用于小麦抗病基因聚合。通过分子辅助选择可有目的地进行基因累加，从而实现抗源积累，提高抗病品种的使用年限。更为重要的是，应用分子标记能够在基因型水平上对作物种质资源进行深入评价和鉴定，同时把抗性与小麦其它重要农艺性状结合起来，大大缩短抗病育种的年限。国际玉米小麦改良中心(CIMMYT)长期致力于小麦抗病育种工作，其选育的多个小麦品种因其具有优良的抗性基因而被广泛应用在世界各地。从上世纪八十年代开始，我国陆续从CIMMYT种质小麦中转移、育成抗病优良小麦品种。CIMMYT小麦材料P10078经过多年多点的表型鉴定，其在中国具有良好的成株期抗性，经过基因定位发现其在小麦染色体6BL上可能含有新的抗条锈病基因/QTL，暂命名为QYr.nwafu-6BL.2。开发与该抗条锈病位点的紧密连锁的SNP标记，对分子辅助多个抗病基因的聚合育种有重要意义。
分子标记辅助抗病育种实践中，常采用表型分析、生化标记和基因标记鉴定相结合的方法。目前常用于基因型鉴定的分子标记有STS、SSR、SNP等，相比之下SNP标记可以利用芯片进行高通量自动化操作。Affymetrix公司开发的Wheat 660K SNP芯片得到了很快的应用。LGC Genomics公司的研发的基于竞争性等位基因特异性PCR(Kompetitive Allele-Specific PCR，KASP)技术的SNP基因分型检测方案，相比于传统的SNP检测方法，如酶切引物CAPS等，KASP可以通过通用荧光探针来无差别的连接目标引物，具有准确性高、通量灵活、操作价格低、平台兼容性好的特点。
发明内容
本发明的两个分子标记的组合使用对条锈病主效位点QYr.nwafu-6BL.2的预测准确率高达98％。
本发明提供了一种小麦抗条锈病基因QYr.nwafu-6BL.2的连锁KASP分子标记，所述分子标记为分子标记KASP-630和分子标记KASP-162；
其中，分子标记KASP-630的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，为：5’-gagcgagtgaccgagcgtacacttacaaatgatga[g/t]ggccgagttactggtgagacgtaggcatatccttg-3’，且核酸序列自5’端起第36位碱基是SNP位点；
分子标记KASP-162的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，为：5’-cattttgcttttccaaagttgacggatcgttgaaa[a/g]ttgtggattggaaagatgaaagatccacgatccgt-3’，且核酸序列自5’端起第36位碱基是SNP位点。
一种上述小麦抗条锈病基因QYr.nwafu-6BL.2的连锁KASP分子标记的PCR特异性扩增引物，分子标记KASP-630的引物包括：
正向序列1：5’-gaaggtgaccaagttcatgctctcaccagtaactcggccc-3’，如SEQ IDNO.3所示；
正向序列2：5’-gaaggtcggagtcaacggattctcaccagtaactcggcca-3’，如SEQ IDNO.4所示；
反向序列3：5’-gagtgaccgagcgtacact-3’；如SEQ ID NO.5所示；
分子标记KASP-162的引物包括：
正向序列4：5’-gaaggtgaccaagttcatgctatctttcatctttccaatccacaat-3’，如SEQID NO.6所示；
正向序列5：5’-gaaggtcggagtcaacggattatctttcatctttccaatccacaac-3’，如SEQID NO.7所示；
反向序列6：5’-ttccaaagttgacggatcgt-3’，如SEQ ID NO.8所示。
一种上述的小麦抗条锈病基因QYr.nwafu-6BL.2的连锁KASP分子标记在小麦抗条锈病基因定位或者检测或者小麦辅助育种中的应用。
一种上述的小麦抗条锈病基因QYr.nwafu-6BL.2的连锁KASP分子标记的应用方法，包括以下步骤：
S1，用常规方法提取待测材料的基因组DNA；
S2，分别用分子标记KASP-630和分子标记KASP-162的引物组进行PCR扩增；
其中，扩增体系均为：2.5μL的2×KASP V4.0Mastermix，0.056μL引物混合溶液，DNA模板为50-100ng，ddH2O补足5μL；每条正向引物浓度均为12mmol/L，每条反向引物浓度均为30mmol/L。
扩增程序均为：94℃15min；94℃20s；61-55℃1min，且每个循环降0.6℃，10个循环；94℃20s、55℃60s、30个循环；
S3，分别通过酶标仪使用FAM HEX ROX光束扫描和Kluster Caller分型软件对PCR扩增产物进行分型检测；
S4，采用分子标记KASP-630引物组的判断目标SNP的基因型；
采用分子标记KASP-162引物组的判断目标SNP的基因型；
S5，将S4中两个判断结果结合，若同时含有两种标记目标SNP“A-C”组合型，则待测小麦为候选的具有抗条锈病性状的小麦；其他情况待测小麦为候选的具有感条锈病性状的小麦；
其中，所述两种标记KASP-630和KSAP-162的“A-C”组合型包括AA-CC、AA-CT、AC-CC和AC-CT四种组合。
与现有技术相比，本发明的有益效果：
本发明的两个分子标记定位的位点对该数量性状存在显著关联关系(P<0.01)，且贡献率较高。通过这两个分子标记的组合使用可以预测小麦对条锈病的抗性，组合使用对条锈病主效位点QYr.nwafu-6BL.2的预测准确率高达98％；根据分子标记及其引物可以快速、高效地应用于小麦品种改良分子辅助育种，为实现小麦抗条锈病性状的早期鉴定和筛选提供分子辅助选择技术支持，大大缩短了传统育种的时间。
附图说明
图1为本发明实施例2分子标记KASP-630的引物组对抗病亲本、感病亲本、F1群体株系、F7重组自交系群体的扩增分型散点图；
图2为本发明实施例2分子标记KASP-162的引物组对抗病亲本、感病亲本、F1群体株系、F7重组自交系群体的扩增分型散点图；
图3为本发明实施例2由660K芯片中的SNP标记构建的遗传连锁图及2个SNP标记在遗传连锁图中的位置图；
图4为本发明实施例3分子标记KASP-630的引物组对抗病亲本、感病亲本、F1群体株系、176份小麦品种的的扩增分型散点图；
图5为本发明实施例3分子标记KASP-162的引物组对抗病亲本、感病亲本、F1群体株系、176份小麦品种的的扩增分型散点图；
其中图1-2、图4-5中，FAM位于X轴，HEX位于Y轴，++表示与抗病亲本一致的分型，－－表示与感病亲本一致的分型，+－表示杂合型。
具体实施方式
下面结合附图1-5对本发明的一个具体实施方式进行详细描述，但应当理解本发明的保护范围并不受具体实施方式的限制，下述实验方法采用分子生物实验技术包括DNA提取、PCR扩增、PCR产物的荧光值读取等以及遗传学中的分子作图和QTL定位，如无特殊说明，均为常规方法。
实施例1
提供了一种小麦抗条锈病基因QYr.nwafu-6BL.2的连锁KASP分子标记，分子标记为分子标记KASP-630和分子标记KASP-162；
其中，分子标记KASP-630的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，为：5’-gagcgagtgaccgagcgtacacttacaaatgatga[g/t]ggccgagttactggtgagacgtaggcatatccttg-3’，且核酸序列自5’端起第36位碱基是SNP位点；
分子标记KASP-162的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，为：5’-cattttgcttttccaaagttgacggatcgttgaaa[a/g]ttgtggattggaaagatgaaagatccacgatccgt-3’，且核酸序列自5’端起第36位碱基是SNP位点。
一种上述小麦抗条锈病基因QYr.nwafu-6BL.2的连锁KASP分子标记的PCR特异性扩增引物，分子标记KASP-630的引物(由英潍捷基(上海)贸易有限公司合成)包括：
正向序列1：5’-gaaggtgaccaagttcatgctctcaccagtaactcggccc-3’，如SEQ IDNO.3所示；
正向序列2：5’-gaaggtcggagtcaacggattctcaccagtaactcggcca-3’，如SEQ IDNO.4所示；
反向序列3：5’-gagtgaccgagcgtacact-3’；如SEQ ID NO.5所示；
其中5’-gaaggtgaccaagttcatgct-3’(如SEQ ID NO.9所示)为FAM荧光通用引物，FAM荧光基团，在激发光485nm，发射光520nm波长下观察读值；5’-gaaggtcggagtcaacggatt-3’(如SEQ ID NO.10所示)为HEX荧光通用引物，HEX荧光基团，在激发光535nm，发射光556nm波长下观察读值。
分子标记KASP-162的引物包括：
正向序列4：5’-gaaggtgaccaagttcatgctatctttcatctttccaatccacaat-3’，如SEQID NO.6所示；
正向序列5：5’-gaaggtcggagtcaacggattatctttcatctttccaatccacaac-3’，如SEQID NO.7所示；
反向序列6：5’-ttccaaagttgacggatcgt-3’，如SEQ ID NO.8所示；
其中，5’-gaaggtgaccaagttcatgct-3’(如SEQ ID NO.11所示)为FAM荧光通用引物，FAM荧光基团，在激发光485nm，发射光520nm波长下观察读值；5’-gaaggtcggagtcaacggatt-3’(如SEQ ID NO.12所示)为HEX荧光通用引物，HEX荧光基团，在激发光535nm，发射光556nm波长下观察读值。
一种上述的小麦抗条锈病基因QYr.nwafu-6BL.2的连锁KASP分子标记在小麦抗条锈病基因定位或者检测或者小麦辅助育种中的应用。
一种上述的小麦抗条锈病基因QYr.nwafu-6BL.2的连锁KASP分子标记的应用方法，包括以下步骤：
S1，用常规方法(CTAB法)提取待测材料的基因组DNA；
S2，分别用分子标记KASP-630和分子标记KASP-162的引物组进行PCR扩增；
其中，扩增体系均为：2.5μL的2×KASP V4.0Mastermix(LGC Genomics)，0.056μL引物混合溶液，DNA模板为50-100ng，ddH2O补足5μL；每条正向引物浓度均为12mmol/L，每条反向引物浓度均为30mmol/L。
扩增程序均为：94℃15min；94℃20s；61-55℃1min，且每个循环降0.6℃，10个循环；94℃20s、55℃60s、30个循环；
S3，分别通过酶标仪使用FAM HEX ROX光束扫描和Kluster Caller分型软件对PCR扩增产物进行分型检测；
S4，采用分子标记KASP-630引物组的判断：若目标SNP的基因型为非CC纯合型，则待测小麦为候选的具有抗条锈病性状的小麦；若目标SNP的基因型为CC纯合型，则待测小麦为候选的具有感条锈病性状的小麦；非CC纯合型为AA纯合型或AC杂合型；
采用分子标记KASP-162引物组的判断：若目标SNP的基因型为非TT纯合型，则待测小麦为候选的具有抗条锈病性状的小麦；若目标SNP的基因型为TT纯合型，则待测小麦为候选的具有感条锈病性状的小麦；非TT纯合型为CC纯合型或CT杂合型；
S5，将S4中两个判断结果结合，根据表型及系谱分析得出若同时含有两种标记目标SNP“A-C”组合型，则待测小麦为候选的具有抗条锈病性状的小麦；其他情况待测小麦为候选的具有感条锈病性状的小麦；
其中，两种标记KASP-630和KSAP-162的“A-C”组合型包括AA-CC、AA-CT、AC-CC和AC-CT四种组合。
上述小麦为普通小麦，例如CIMMYT种质P10078材料及其衍生品种。上述条锈病具体可为当前条锈病菌流行小种CYR32、CYR33和CYR34引起的条锈病。
实施例2
1、遗传群体的构建及遗传分析
(1)供试小麦材料：CIMMYT种质P10078(Triticum aestivum)对条锈病具有良好的成株期抗性，该材料记载于如下参考文献：CIMMYT(1983)Report on wheatimprovement.International Maizeand Wheat Improvement Center,Mexico,p 20.而对条锈病感病的小麦品种“铭贤169”，是山西铭贤学校(山西农业大学的前身)在上世纪二十年代育成，可从国家作物种质资源库获得。以铭贤169为母本，P10078为父本杂交获得F1，F1自交获得F2，F2单株不断自交利用“单粒传”方式获得重组自交系(recombinant inbredline，RIL)群体，用于遗传分析和QTL定位。普通小麦小偃22为栽培品种，可从国家作物种质资源库获得。
(2)供试群体的表型评估及表性数据分析。田间成株期抗性鉴定步骤及方法如下：将124个F7RILs播种在杨凌(34°17’N,108°04’E,海拔519m)和江油(31°53’N,104°47’E,海拔571m)两个试验点。采用完全随机区组设计，设置三个重复，每个重复中单个家系约30-40粒种子。每个家系单行播种，1-1.2m行长，30cm行距。每隔20行各种植一行双亲及两行小偃22作为感病指示品种，每50行播种5行铭贤169，且在小区与小区的间距中每个1.5m播种30粒左右的铭贤169作为诱发行。江油属于条锈菌冬繁区，这个地点气候条件非常适合条锈菌自然发病及传播，因此无需进行人工接种。而杨陵属于条锈菌偶发区，所以每年3月中旬待小麦生长至拔节期进行人工接种。接种前一周先进行一次灌溉，如遇雨天，可免。田间接种使用CYR32、CYR33和CYR34小种，且一般选择傍晚6点以后，此时田间空气湿润，叶片上往往凝结水珠，非常利于条锈菌侵染。首先将夏孢子与石蜡油按照1:300比例进行充分混合，然后使用喉头喷雾器直接向诱发行铭贤169进行喷洒，再用塑料袋进行套袋保湿，于翌日中午前揭开袋子。每年根据实际情况调查条锈病发病情况，一般调查3次，即初发期、盛发期和终发期。但个别年份只调查终发期，此时条锈病发病最严重，即感病对照往往整个旗叶上布满了条锈孢子。根据历年调查经验，每年江油的4月1日-15日、杨陵的5月1日-20日为条锈病发病时期，因此选择在这段时间进行病害调查。病害调查记录同温室成株期试验。对于纯合家系，只记录一个值；对于分离家系，一般要记录两个或者更多的值，即最大、最小和中间值。本试验中，选用最大严重度(maximum disease severities，MDS)作为分析指标，随后MDS用来进行方差分析(Analysis of Variance，ANOVA)和相关性分析(correlation analysis)，利用IciMapping V4.1软件中的AOV功能进行计算，根据方差结果计算广义遗传力，其公式如下：其中 代表基因型方差，代表基因型与环境互作效应，代表误差；e为环境个数，r为每个环境内重复数。方差分析结果表明：条锈病抗病性在不同基因型间存在极显著差异，四个环境的相关系数在0.71-0.92之间，相关性较好，进而明确表现型数据的有效性。
2、遗传图谱构建和抗条锈病QTL定位
(1)集群分离分析法(bulked segregant analysis,BSA)结合小麦芯片分析：采用CTAB法提取群体各个家系的DNA，根据多环境的鉴定结果，各选取10个纯合抗病家系(IT 1,DS≤5)和10个纯合感病家系(IT 9,DS≥90)等量混池。然后送往北京博奥公司进行660K芯片分型。根据差异SNP数目所在染色体及在该染色体的集中程度，初步确定QTL位点的位置，然后设计KASP标记，对RIL群体进行基因分型并IciMapping软件绘制连锁图谱。
(2)QTL定位：结合表型数据包括4个环境条锈病的最大严重度及其平均值，在连锁图谱上用QTL作图软件IciMapping 4.1(http://www.isbreeding.net)中的完备区间作图法(Inclusive composite interval mapping，ICIM)估算主效QTL。铭贤169/P10078的RIL群体每个环境的表型数据及4个环境的平均值用于QTL分析。设置参数如下：“permutation”为1000次，软件自动赋值LOD，步长设为0.5cM，“control marker”和“Windowsize”使用默认值，回归方式采用“Forward and backward method”；寻找QTL时，把LOD值峰值设为5.0，QTL的置信区间划分时采用LOD≥2.5。每个QTL的区间距不超过20cM，用逐步回归估算表型变异。LOD值(a logarithm of odds)大于2.5的QTL被认为是具有显著效应。该群体定位到一个效应值较大且稳定的QTLQYr.nwafu-6BL.2，可解释表型变异56.8％。与前人研究比较发现，QYr.nwafu-6BL.2可能为新的抗条锈QTL，因此将该QTL两翼的KASP标记KASP-630(AX-110913630)和KASP-162(AX-110396162)进行自然群体的验证，用于小麦分子标记辅助选择育种。结果如图1-图3。
实施例3
抗条锈病基因的分子标记KASP-630和KASP-162及其专用引物组可行性验证：
方法：用KASP-630和KASP-162引物组检测176份小麦栽培品种的条锈病抗病基因。
1、用KASP-630引物组利用实施例的方法检测176份待测品种，DNA浓度为100ng/μl的模板溶液。
若PCR扩增产物中目标SNP的基因型为非CC纯合型，则待测小麦为候选的具有抗条锈病性状的小麦；若PCR扩增产物中目标SNP的基因型为CC纯合型，则待测小麦为候选的具有感条锈病性状的小麦；非CC纯合型为AA纯合型或AC杂合型，结果如图4。
用KASP-162引物组检测176份待测品种：
2、用KASP-162引物组利用实施例的方法176个待测品种的基因组DNA，DNA浓度为100ng/μlL的模板溶液。
若PCR扩增产物中目标SNP的基因型为非TT纯合型，则待测小麦为候选的具有抗条锈病性状的小麦；若PCR扩增产物中目标SNP的基因型为TT纯合型，则待测小麦为候选的具有感条锈病性状的小麦；非TT纯合型为CC纯合型或CT杂合型，结果如图5。
176份小麦栽培品种由KASP-630和KASP-162引物组检测的基因型和条锈病表型(最大严重度的平均值)如表1所示。将两个标记组合使用后，并结合表型及系谱分析后发现，两者结合可以将检测准确率提高到99％以上。
表1 176份小麦栽培品种由两个引物组检测的基因型和最大严重度平均值
综上，只要同时含有KASP-630这个位点中的T碱基和KASP-162这个点中的C碱基，则认为是含有抗病位点。
需要说明的是，本发明权利要求书中采用的步骤方法与上述实施例相同，为了防止赘述，本发明的描述了优选的实施例，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例做出另外的变更和修改。所以，所附权利要求意欲解释为包括优选实施例以及落入本发明范围的所有变更和修改。
显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。
序列表
<120> 小麦抗条锈病基因QYr.nwafu-6BL.2的连锁KASP分子标记、引物及应用
<141> 2019-02-21
<160> 12
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 71
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 1
gagcgagtga ccgagcgtac acttacaaat gatga[g/t]ggcc gagttactgg tgagacgtag 61
gcatatcctt g 72
<210> 2
<211> 71
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 2
cattttgctt ttccaaagtt gacggatcgt tgaaa[a/g]ttgt ggattggaaa gatgaaagat 61
ccacgatccg t 72
<210> 3
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 3
gaaggtgacc aagttcatgc tctcaccagt aactcggccc 40
<210> 4
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 4
gaaggtcgga gtcaacggat tctcaccagt aactcggcca 40
<210> 5
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 5
gagtgaccga gcgtacact 19
<210> 6
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 6
gaaggtgacc aagttcatgc tatctttcat ctttccaatc cacaat 46
<210> 7
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 7
gaaggtcgga gtcaacggat tatctttcat ctttccaatc cacaac 46
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 8
ttccaaagtt gacggatcgt 20
<210> 9
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 9
gaaggtgacc aagttcatgc t 21
<210> 10
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 10
gaaggtcgga gtcaacggat t 21
<210> 11
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 11
gaaggtgacc aagttcatgc t 21
<210> 12
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 12
gaaggtcgga gtcaacggat t 21
Claims (4)
1.一种小麦抗条锈病基因QYr.nwafu-6BL.2的连锁KASP分子标记，其特征在于，所述分子标记为分子标记KASP-630和分子标记KASP-162；
其中，分子标记KASP-630的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，为：5’-gagcgagtgaccgagcgtacacttacaaatgatga[g/t]ggccgagttactggtgagacgtaggcatatccttg-3’，且核酸序列自5’端起第36位碱基是SNP位点；
分子标记KASP-162的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，为：5’-cattttgcttttccaaagttgacggatcgttgaaa[a/g]ttgtggattggaaagatgaaagatccacgatccgt-3’，且核酸序列自5’端起第36位碱基是SNP位点。
2.一种权利要求1所述的小麦抗条锈病基因QYr.nwafu-6BL.2的连锁KASP分子标记的PCR特异性扩增引物，其特征在于，分子标记KASP-630的引物包括：
正向序列1：5’-gaaggtgaccaagttcatgctctcaccagtaactcggccc-3’，如SEQ ID NO.3所示；
正向序列2：5’-gaaggtcggagtcaacggattctcaccagtaactcggcca-3’，如SEQ ID NO.4所示；
反向序列3：5’-gagtgaccgagcgtacact-3’；如SEQ ID NO.5所示；
分子标记KASP-162的引物包括：
正向序列4：5’-gaaggtgaccaagttcatgctatctttcatctttccaatccacaat-3’，如SEQ IDNO.6所示；
正向序列5：5’-gaaggtcggagtcaacggattatctttcatctttccaatccacaac-3’，如SEQ IDNO.7所示；
反向序列6：5’-ttccaaagttgacggatcgt-3’，如SEQ ID NO.8所示。
3.一种根据权利要求1所述的小麦抗条锈病基因QYr.nwafu-6BL.2的连锁KASP分子标记在小麦抗条锈病基因定位或者检测或者小麦辅助育种中的应用。
4.一种如权利要求1所述的小麦抗条锈病基因QYr.nwafu-6BL.2的连锁KASP分子标记的应用方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1，提取待测材料的基因组DNA；
S2，分别用分子标记KASP-630和分子标记KASP-162的引物组进行PCR扩增；
其中，扩增体系均为：2.5μL的2×KASP V4.0 Mastermix，0.056μL引物混合溶液，DNA模板为50-100ng，ddH2O补足5μL；每条正向引物浓度均为12mmol/L，每条反向引物浓度均为30mmol/L；
扩增程序均为：94℃15min；94℃20s；61-55℃1min，且每个循环降0.6℃，10个循环；94℃20s、55℃60s、30个循环；
S3，分别通过酶标仪使用FAM HEX ROX光束扫描和Kluster Caller分型软件对PCR扩增产物进行分型检测；
S4，采用分子标记KASP-630引物组的判断目标SNP的基因型；
采用分子标记KASP-162引物组的判断目标SNP的基因型；
S5，将S4中两个判断结果结合，若同时含有两种标记目标SNP“A-C”组合型，则待测小麦为候选的具有抗条锈病性状的小麦；其他情况待测小麦为候选的具有感条锈病性状的小麦；
其中，所述两种分子标记KASP-630和KSAP-162的“A-C”组合型包括AA-CC、AA-CT、AC-CC和AC-CT四种组合。
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