CN117568521B - 小麦条锈菌snp分子标记、kasp检测引物组及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了小麦条锈菌SNP分子标记、KASP检测引物组及应用。本发明所述小麦条锈菌的SNP分子标记由12个SNP位点组成，本发明进一步提供了扩增所述小麦条锈菌SNP分子标记的KASP引物组，该引物组由SEQ ID NO.1‑SEQ ID NO.36所示的核苷酸序列组成，本发明进一步提供了检测SNP分子标记的KASP引物组以及用于小麦条锈菌遗传多样性分析中的应用。本发明基于KASP基于开发小麦条锈菌SNP分子标记，获得了不同于现有技术的具有高多态性、分型效果好、重复性好的SNP分子标记，能够应用于快速有效的分析小麦条锈菌群体遗传结构。

Description

小麦条锈菌SNP分子标记、KASP检测引物组及应用
技术领域
本发明涉及SNP分子标记以及检测引物，尤其涉及小麦条锈菌SNP分子标记、KASP检测引物组及其在小麦条锈菌遗传多样性分析中的应用，属于小麦条锈菌SNP分子标记及其应用领域。
背景技术
小麦条锈菌（Pucciniastriiformisf.sp. tritici）是一种全世界范围内的气传性真菌病害。小麦条锈菌一般侵染小麦叶片、叶鞘、茎秆及穗部。一方面，病原菌寄生吸食小麦体内营养物质，破坏叶绿素，导致光合作用减弱及破坏正常生理机能；另一方面，小麦叶片表皮遭到破坏，蒸腾作用显著增加，缺失水分导致灌浆不良。感病小麦籽粒干瘪，产量下降，蛋白质含量降低，品质变劣，同时因植株孱弱而易受低温冻害和干旱影响。因此有必要开发适宜的分子标记，对小麦条锈菌群体遗传结构及遗传分化进行系统研究，了解小麦条锈菌遗传变异与环境变化之间的演化规律，为合理防控小麦条锈菌病害提供理论依据。
单核苷酸多态性（Single-Nucleotide Polymorphism，SNP）技术着眼于单个位点上不同的等位基因，基于核苷酸之间的区别，实现对单一核苷酸完成分子层面研究，适合高通量检测（Brookes 1999），其发展推广与 DNA 芯片的联系密不可分。SNP分子标记具有分布广泛，多态性高，遗传稳定性高等优点，被广泛应用于种质资源遗传多样性分析、目标性状基因的标记与定位、抗性育种、作物品种纯度鉴定及品质鉴定等方面。
竞争性等位基因特异性聚合酶链式反应 (kompetitive allele specific PCR，KASP) 是一种基于单核苷酸多态性(SNP) 的新型基因分型技术，可从基因组水平对SNP和插入缺失多态性 (Indel) 进行精准分型，该技术原理是依据引物末端碱基特异性配对，利用沉降式PCR进行扩增与荧光淬灭探针相结合，检测发出的荧光信号类型进行基因分型。
目前，基于KASP技术开发小麦条锈菌SNP分子标记的研究相对较少，且现有的KASP-SNP引物分型效果差，应用于小麦条锈菌遗传结构的研究存在较多的缺陷。
发明内容
为此，本发明根据国内外小麦条锈菌全基因组比较，筛选出12个分布均匀，多态性高的SNP位点，并将12个位点都转化为了KASP标记。
目前基于KASP技术开发小麦条锈菌SNP分子标记的报道相对较少，本发明用生物信息学的方法，开发了具有多态性的小麦条锈菌KASP-SNP分子标记，为小麦条锈菌群体遗传结构及遗传分化研究提供有效的工具。
为实现上述目的，本发明所主要采取的技术方案包括：
本发明首先提供了基于KASP技术开发的小麦条锈菌SNP分子标记，所述分子标记由以下（1）-（12）所述的12个SNP位点组成：
（1）SNP位点1的等位变异碱基为C/T，其位于小麦条锈菌基因组序列Supercont.3的第442202位；
（2）SNP位点2的等位变异碱基为C/T，其位于小麦条锈菌基因组序列Supercont.1的第298417位；
（3）SNP位点3的等位变异碱基为C/T，其位于小麦条锈菌基因组序列Supercont.16的第108630位；
（4）SNP位点4的等位变异碱基为C/T，其位于小麦条锈菌基因组序列Supercont.23的第73782位；
（5）SNP位点5的等位变异碱基为C/G，其位于小麦条锈菌基因组序列Supercont.109的第152246位；
（6）SNP位点6的等位变异碱基为C/T，其位于小麦条锈菌基因组序列Supercont.116的第239091位；
（7）SNP位点7标记的等位变异碱基为A/G，其位于小麦条锈菌基因组序列Supercont.117的第206340位；
（8）SNP位点8的等位变异碱基为C/T，其位于小麦条锈菌基因组序列Supercont.113的第62255位；
（9）SNP位点9的等位变异碱基为C/T，其位于小麦条锈菌基因组序列Supercont.120的第53959位；
（10）SNP位点10的等位变异碱基为C/T，其位于小麦条锈菌基因组序列Supercont.136的第207251位；
（11）SNP位点11的等位变异碱基为A/G，其位于小麦条锈菌基因组序列Supercont.24的第180282位；
（12）SNP位点12的等位变异碱基为A/T，其位于小麦条锈菌基因组序列Supercont.15的第804248位；
本发明的另一方面是提供了用于扩增上述小麦条锈菌SNP分子标记的KASP引物组，所述KASP引物组由以下（1）-（12）所述的12个KASP引物组组成，其中，每个KASP引物组合由两条3'末端碱基不同的正向引物F1和F2及一条反向引物R构成；
（1）KASP引物组合1：该KASP引物组合1用于扩增SNP位点1，由核苷酸序列为SEQ IDNO.1所示的正向引物F1、核苷酸序列为SEQ ID NO.2所示的正向引物F2以及核苷酸序列为SEQ ID NO.3所示的反向引物R组成；
（2）KASP引物组合2：该KASP引物组合2用于扩增SNP位点2，由核苷酸序列为SEQ IDNO.4所示的正向引物F1、核苷酸序列为SEQ ID NO.5所示的正向引物F2以及核苷酸序列为SEQ ID NO.6所示的反向引物R组成；
（3）KASP引物组合3：该KASP引物组合3用于扩增SNP位点3，由核苷酸序列为SEQ IDNO.7所示的正向引物F1、核苷酸序列为SEQ ID NO.8所示的正向引物F2以及核苷酸序列为SEQ ID NO.9所示的反向引物R组成；
（4）KASP引物组合4：该KASP引物组合4用于扩增SNP位点4，由核苷酸序列为SEQ IDNO.10所示的正向引物F1、核苷酸序列为SEQ ID NO.11所示的正向引物F2以及核苷酸序列为SEQ ID NO.12所示的反向引物R组成；
（5）KASP引物组合5：该KASP引物组合5用于扩增SNP位点5，由核苷酸序列为SEQ IDNO.13所示的正向引物F1、核苷酸序列为SEQ ID NO.14所示的正向引物F2以及核苷酸序列为SEQ ID NO.15所示的反向引物R组成；
（6）KASP引物组合6：该KASP引物组合6用于扩增SNP位点6，由核苷酸序列为SEQ IDNO.16所示的正向引物F1、核苷酸序列为SEQ ID NO.17所示的正向引物F2以及核苷酸序列为SEQ ID NO.18所示的反向引物R组成；
（7）KASP引物组合7：该KASP引物组合7用于扩增SNP位点7，由核苷酸序列为SEQ IDNO.19所示的正向引物F1、核苷酸序列为SEQ ID NO.20所示的正向引物F2以及核苷酸序列为SEQ ID NO.21所示的反向引物R组成；
（8）KASP引物组合8：该KASP引物组合8用于扩增SNP位点8，由核苷酸序列为SEQ IDNO.22所示的正向引物F1、核苷酸序列为SEQ ID NO.23所示的正向引物F2以及核苷酸序列为SEQ ID NO.24所示的反向引物R组成；
（9）KASP引物组合9：该KASP引物组合9用于扩增SNP位点9，由核苷酸序列为SEQ IDNO.25所示的正向引物F1、核苷酸序列为SEQ ID NO.26所示的正向引物F2以及核苷酸序列为SEQ ID NO.27所示的反向引物R组成；
（10）KASP引物组合10：该KASP引物组合10用于扩增SNP位点10，由核苷酸序列为SEQ ID NO.28所示的正向引物F1、核苷酸序列为SEQ ID NO.29所示的正向引物F2以及核苷酸序列为SEQ ID NO.30所示的反向引物R组成；
（11）KASP引物组合11：该KASP引物组合11用于扩增SNP位点11，由核苷酸序列为SEQ ID NO.31所示的正向引物F1、核苷酸序列为SEQ ID NO.32所示的正向引物F2以及核苷酸序列为SEQ ID NO.33所示的反向引物R组成；
（12）KASP引物组合12：该KASP引物组合12用于扩增SNP位点12，由核苷酸序列为SEQ ID NO.34所示的正向引物F1、核苷酸序列为SEQ ID NO.35所示的正向引物F2以及核苷酸序列为SEQ ID NO.36所示的反向引物R组成。
本发明的优选的具体实施方案，所述正向引物F1和F2的5'-端分别连接着FAM-tail（5'-GAAGGTGACCAAGTTCATGCT-3'）通用荧光标签序列和HEX-tail（5'-GAAGGTCGGAGTCAACGGATT-3）通用荧光标签序列。
本发明的再一方面是将所述的小麦条锈菌SNP分子标记或检测小麦条锈菌SNP分子标记的KASP引物组应用于小麦条锈菌遗传多样性的分析；包括：
(1)对小麦条锈菌进行采集、分离、鉴定；
(2)提取小麦条锈菌基因组DNA；
(3)对步骤（2）得到的基因组DNA为模板、并分别以检测小麦条锈菌SNP分子标记的12个KASP引物组合为检测引物建立PCR反应体系进行PCR扩增得到PCR扩增产物；
(4)将步骤（3）得到的PCR扩增产物进行荧光信号值的读取获取KASP-SNP 分型数据；
(5)根据所获取的KASP-SNP 分型数据对小麦条锈菌遗传多样性进行分析。
本发明的一种优选的具体实施方案，步骤（3）中所述的基因组DNA的添加量为1μL，所述的12个KASP引物组合的PCR反应体系分别包括：2×KASP mix 170μL，上游引物F1 0.51μL ，上游引物F2 0.51μL，下游引物1.36μL ；总反应体系为172.38μL (96个样品量)；所述的PCR扩增的程序为：95℃预变性10 min；95℃变性20 s，61℃(-0.6℃/循环)退火45 s，10个循环；95℃变性20 s，55℃退火45 s，35个循环。
本发明的一种优选的具体实施方案，步骤（5）中根据所获取的KASP-SNP 分型数据进行转化生成二元基因型数据矩阵后对小麦条锈菌遗传多样性进行分析，其中，所获取的KASP-SNP分型数据进行转化的方法包括：将“XX”转化为“10”，“XY”转化为“11”，“YY”转化为“01”；
本发明的一种优选的具体实施方案，步骤（5）中根据所获取的KASP-SNP 分型数据对小麦条锈菌遗传多样性进行分析的方法选自以下（a）-(e)中的任何一种或多种：
(a) 计算小麦条锈菌遗传多样性水平的参数：通过Excel中的 GenAlEx 6.5 插件完成等位基因数、杂合度以及香农信息指数的计算；
(b) 分析小麦条锈菌的遗传结构：通过 STRUCTURE 2.3 软件实现，参数 K 的范围为 2~10，经过 15 次重复运算后由 STRUCTURE HARVESTER 在线显示其最佳数值，运用Clumpp1.1.2实现重复抽样检验，最终成像则通过 Distruct 1.1完成；
(c) 构建小麦条锈菌的遗传聚类图：聚类运算基于 UPGMA方法，利用POWERMARKER 3.25 软件完成并通过 MEGE软件进行图形化，ITOL在线软件进行图形美化；
(d)构建二维主坐标分析图并用于完成对小麦条锈菌群体内部及相互之间遗传变异起评估作用的分子方差分析：采用Excel中的GenAlEx 6.5 插件计算群体内部及相互之间遗传变异起评估作用的分子方差分析（Analysis of Molecular genetic variance，AMOVA）；
(e) 计算小麦条锈菌不同地区群体之间的成对遗传分化以及计算小麦条锈菌群体间基因流：采用Excel中的GenAlEx 6.5 插件计算小麦条锈菌不同地区群体之间的成对遗传分化（Fst），进一步依据公式Nm= 0.25（1 - Fst）/Fst 计算小麦条锈菌群体间基因流。
本发明的再一方面是提供了一种检测小麦条锈菌的KASP检测试剂盒，包括KASPmix和KASP检测引物组；其中，所述的KASP检测引物组由上述的KASP引物组合1- KASP引物组合12组成。
本发明基于KASP基于开发小麦条锈菌SNP分子标记，获得了不同于现有技术的具有高多态性、分型效果好、重复性好的SNP分子标记，能够应用于快速有效的分析小麦条锈菌群体遗传结构。
本发明涉及缩略语和关键术语定义
SNP：单核苷酸多态性。
KASP：竞争性等位基因特异性PCR。
附图说明
图1为小麦条锈菌SNP1位点的KASP引物组进行KASP基因分型图；
图2为小麦条锈菌SNP2位点的KASP引物组进行KASP基因分型图；
图3为小麦条锈菌SNP3位点的KASP引物组进行KASP基因分型图；
图4为小麦条锈菌SNP4位点的KASP引物组进行KASP基因分型图；
图5为小麦条锈菌SNP5位点的KASP引物组进行KASP基因分型图；
图6为小麦条锈菌SNP6位点的KASP引物组进行KASP基因分型图；
图7为小麦条锈菌SNP7位点的KASP引物组进行KASP基因分型图；
图8为小麦条锈菌SNP8位点的KASP引物组进行KASP基因分型图；
图9为小麦条锈菌SNP9位点的KASP引物组进行KASP基因分型图；
图10为小麦条锈菌SNP10位点的KASP引物组进行KASP基因分型图；
图11为小麦条锈菌SNP11位点的KASP引物进行行KASP基因分型图；
图12为小麦条锈菌SNP12位点的KASP引物组进行KASP基因分型图；
图13为基于Nei’s遗传距离的小麦条锈菌分子UPGMA聚类图；
图14为基于STRUCTURE分析的小麦条锈菌群体遗传结构图。
具体实施方式
下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但是应理解所述实施例仅是范例性的，不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改或替换均落入本发明的保护范围。
实施例1小麦条锈菌SNP位点获得和KASP标记的开发
本发明对SNP位点进行筛选，选取最小等位基于频率>0.4、检测率为100%、染色体上均匀分布的SNP位点，共筛选出24个SNP位点，以PST-78生理小种为参考基于组，截取24个SNP位点的前后各60 bp的序列设计KASP引物，最终有12个SNP位点成功转化成KASP标记，位点编号为SNP1~12。
具体地，SNP位点1~12在基因组上的位置信息及用于扩增所述位点的引物序列信息如表1所示。
表1 SNP位点1~12在基因组上的位置信息及对应引物序列信息(以PST-78为参考基因组)
图1-图12分别是小麦条锈菌SNP1位点至小麦条锈菌SNP12位点对应的各自的KASP引物组进行小麦条锈菌检测的KASP基因分型图。
实施例2基于KASP技术开发的小麦条锈菌SNP分子标记在小麦条锈菌遗传结构中的应用
步骤1：小麦条锈菌标样的采集、分离和纯化
本实例以采集新疆伊犁州地区的巩留、尼勒克、察县、新源、特克斯和昭苏小麦条锈菌为样品。将所采集的样品保湿处理12 h，用针挑取小麦条锈菌孢子接种到感病小麦品种MX169的叶片正面上，保湿处理24 h，发病后收集孢子。
步骤2：小麦条锈菌基因组DNA提取
（1）在2 mL离心管中加入20 mg左右的条锈菌夏孢子，再加入五颗颗直径2 mm经过高温灭菌的钢珠，在组织研磨仪中进行3 min的研磨，频次为40次/秒，使夏孢子充分研磨。
（2）对CTAB 裂解液（0.4 M NaCl; 10 mM Tris-HCl, pH = 8; 2 mM EDTA, pH =8）进行预热处理（65℃）后，向研磨后夏孢子粉末的离心管中加入650 µL，混匀后进行1 h水浴（65℃），其间每隔15min上下晃动几次，使充分混匀，完全裂解。
（3）加入750 µL体积比例为25:24:1 的氯仿与异戊醇混合溶液混匀,上下混匀晃动一分钟，在4℃离心机中进行10 min离心处理，转速为 12000 rpm，将上清液吸取到1.5ml离心管中。
（4）加入600 µL氯仿，以相同方式混匀离心，再次收集上清液到1.5 mL离心管。
（5）加入750 µL经过预冷处理（-20℃）的异丙醇并充分混匀，将混合溶液放置在-20℃冰箱中30 min，使DNA沉淀析出。
（6）取出离心管，在4℃离心机中以12000 rpm的转速离心10 min，倒出上清液，保留底部DNA沉淀。
（7）用750 µL 70%体积浓度的乙醇洗涤，4℃离心机中12000 rpm离心10min。
（8）取出离心管，倒出上清，用500 µL无水乙醇洗涤，4℃离心机中12000rpm离心10min，取出离心管，倒出上清，在室温条件下通风晾至酒精完全挥发，DNA呈白色干燥固体状态。
（9）以50 µL的1×TE 缓冲液（10 mM Tris-HCl，pH = 8；1 mM EDTA，pH = 8）对DNA进行溶解，用1%琼脂糖凝胶检测DNA的完整性，再用分光光度计测其溶液浓度，并统一稀释成100 ng /µL，存入-20℃冰箱留待使用。
步骤3：KASP基因分型检测
（1）12组KASP引物组合的PCR反应体系分别为：2×KASP mix 170µL，上游引物F10.51µL，上游引物F2 0.51µL，下游引物1.36µL；各PCR反应体系的混合试剂量（即总反应体系）为172.38µL(96个样品量)。每组KASP 引物组合设置96个平行对照，即：将该混合试剂量172.38 μL均匀填加到96个反应孔中后，再向每个反应孔中加入DNA(100ng/ul)1μL；由瀚辰光翼的Matrix Arrayer反应板制备仪进行PCR板加样。
（2）PCR反应程序：95℃预变性10min；95℃变性20 s，61℃(-0.6℃/循环)退火45s，10个循环；95℃变性20 s，55℃退火45 s，35个循环。由瀚辰光翼的Matrix Cycler高通量水浴热循环仪进行PCR反应。
（3）荧光信号读取：由瀚辰光翼的Matrix Scanner高速荧光扫描仪进行荧光信号读取，根据荧光信号进行基因分析。
步骤4：遗传多样性分析
（1）小麦条锈菌遗传多样性水平
通过Excel中的GenAlEx 6.5 插件完成等位基因数、杂合度以及香农信息指数等各项反映遗传多样性水平的参数的计算。采集新疆伊犁州8个群体的条锈菌样本为整体进行遗传多样性分析，发现具有12个多态性位点，所占百分比（P）为100%，香农信息指数（I）为0.436，表明所选取的位点都具有多态性，伊犁州整体小麦遗传多样性较为丰富（表2）。8个群体的香农信息指数在0.214~0.532之间，遗传多样性水平存在较大差异，发现昭苏春麦群体的香农信息指数最高为0.532，遗传多样性最为丰富，特克斯、尼勒克的香农信息指数较低分别为0.214、0.374，遗传多样性水平较低。
表2 小麦条锈菌遗传多样性参数
2）小麦条锈菌遗传距离和基因交流分析
根据 Fst 值计算各地区小麦条锈菌群体之间的 Nm 值，判断基因流动和遗传分化情况。群体之间Nm都大于1，表明伊犁地区小麦条锈菌群体不存在较大的遗传分化，其中特克斯与巩留、尼罗克、察布查尔、新源县之间的Nm大于1小于4，表明这些地区之间的条锈菌群体之间存在一定基因交流；察县冬麦群体与新源春麦群体之间的Nm为98.2545大于4，表明两地之间存在广泛的基因交流。伊犁地区8个小麦条锈菌群体的Nei’s遗传距离介于0.032~0.398之间，其中，察县冬麦群体与新源春麦群体之间的遗传距离最小为0.032，两个群体之间的相似性最高；新源冬麦群体与察县的冬麦群体之间的遗传距离最大为0.398，两个群体间的相似性最低。
表 3小麦条锈菌群体间遗传距离（对角线以上）和基因交流（对角线以下）
（3）小麦条锈菌遗传聚类分析
分子聚类结果显示（图 13），伊犁州小麦条锈菌被分为5个分子类群（MolecularGroup，MG），其中MG1包含74个菌株，其中特克斯春麦的菌株最多（61），其次是新源春麦（1）和察县冬麦（1）；MG2分子类群包含64个菌株，巩留冬麦最多（22），其次为巩留春麦（15），新源春麦（10）和察县冬（7）；在MG3中，尼勒克春麦最多（29），其次为巩留春麦（10），特克斯出麦（12）和巩留冬麦（7）；MG4的菌株数最少（20），其中有巩留冬麦（6），巩留春麦（5），昭苏春麦（4）和察县冬麦（2）；MG5的菌株的菌株数最多，含有81个菌株，其中有新源冬麦（45），巩留冬麦（12），察县冬麦（8），其次为少量春麦群体。昭苏春麦和特克斯春麦主要分布于MG1中，其它群体在MG1中较少，与其它群体分布存在较大差异。新源冬麦群体几乎全部分布在MG5中，仅在MG3中存在1个菌株。这些结果与STRUCTUR，DAPC结果一致。
（4）小麦条锈菌遗传结构分析
使用Structure2.3软件的贝叶斯聚类法进行群体遗传结构分析，参数 K 的范围为 2~10，经过 15 次重复运算后由 STRUCTURE HARVESTER 在线显示其最佳数值，运用Clumpp1.1.2实现重复抽样检验，最终成像则通过 Distruct 1完成（图 14）。不同群体内个体间基因混杂明显，其中新源冬麦群体和特克斯春麦群体、昭苏春麦群体明显不同，察县冬麦群体与新源春麦群体较为相似，这些结果与UPGMA聚类结果一致。
（5）小麦条锈菌分子方差分析
利用 GenAlEx 6.502 软件计算小麦条锈菌群体间、样本间及样本内不同层次所占变异百分比（表 4）。
表 4 小麦条锈菌群体分子方差分析
AMOVA分析表明，群体内和群体间存在变异差异（P<0.001），群体间变异占比29%，群体内变异占比71%。说明小麦条锈菌遗传变异主要分布于群体内。

Claims (8)

1.用于检测小麦条锈菌SNP分子标记的KASP引物组，其特征在于，所述KASP引物组由以下（1）-（12）所述的12个KASP引物组合组成，其中，每个KASP引物组合由两条3'末端碱基不同的正向引物F1和F2及一条反向引物R构成：
（1）KASP引物组合1：该KASP引物组合1用于扩增SNP位点1，由核苷酸序列为SEQ IDNO.1所示的正向引物F1、核苷酸序列为SEQ ID NO.2所示的正向引物F2以及核苷酸序列为SEQ ID NO.3所示的反向引物R组成；所述SNP位点1的等位变异碱基为C/T，其位于小麦条锈菌参考基因组PST-78序列Supercont.3的第442202位；
（2）KASP引物组合2：该KASP引物组合2用于扩增SNP位点2，由核苷酸序列为SEQ IDNO.4所示的正向引物F1、核苷酸序列为SEQ ID NO.5所示的正向引物F2以及核苷酸序列为SEQ ID NO.6所示的反向引物R组成；所述SNP位点2的等位变异碱基为C/T，其位于小麦条锈菌参考基因组PST-78序列Supercont.1的第298417位；
（3）KASP引物组合3：该KASP引物组合3用于扩增SNP位点3，由核苷酸序列为SEQ IDNO.7所示的正向引物F1、核苷酸序列为SEQ ID NO.8所示的正向引物F2以及核苷酸序列为SEQ ID NO.9所示的反向引物R组成；所述SNP位点3的等位变异碱基为C/T，其位于小麦条锈菌参考基因组PST-78序列Supercont.16的第108630位；
（4）KASP引物组合4：该KASP引物组合4用于扩增SNP位点4，由核苷酸序列为SEQ IDNO.10所示的正向引物F1、核苷酸序列为SEQ ID NO.11所示的正向引物F2以及核苷酸序列为SEQ ID NO.12所示的反向引物R组成；所述SNP位点4的等位变异碱基为C/T，其位于小麦条锈菌参考基因组PST-78序列Supercont.23的第73782位；
（5）KASP引物组合5：该KASP引物组合5用于扩增SNP位点5，由核苷酸序列为SEQ IDNO.13所示的正向引物F1、核苷酸序列为SEQ ID NO.14所示的正向引物F2以及核苷酸序列为SEQ ID NO.15所示的反向引物R组成；所述SNP位点5的等位变异碱基为C/G，其位于小麦条锈菌参考基因组PST-78序列Supercont.109的第152246位；
（6）KASP引物组合6：该KASP引物组合6用于扩增SNP位点6，由核苷酸序列为SEQ IDNO.16所示的正向引物F1、核苷酸序列为SEQ ID NO.17所示的正向引物F2以及核苷酸序列为SEQ ID NO.18所示的反向引物R组成；所述SNP位点6的等位变异碱基为C/T，其位于小麦条锈菌参考基因组PST-78序列Supercont.116的第239091位；
（7）KASP引物组合7：该KASP引物组合7用于扩增SNP位点7，由核苷酸序列为SEQ IDNO.19所示的正向引物F1、核苷酸序列为SEQ ID NO.20所示的正向引物F2以及核苷酸序列为SEQ ID NO.21所示的反向引物R组成；所述SNP位点7标记的等位变异碱基为A/G，其位于小麦条锈菌参考基因组PST-78序列Supercont.117的第206340位；
（8）KASP引物组合8：该KASP引物组合8用于扩增SNP位点8，由核苷酸序列为SEQ IDNO.22所示的正向引物F1、核苷酸序列为SEQ ID NO.23所示的正向引物F2以及核苷酸序列为SEQ ID NO.24所示的反向引物R组成；所述SNP位点8的等位变异碱基为C/T，其位于小麦条锈菌参考基因组PST-78序列Supercont.113的第62255位；
（9）KASP引物组合9：该KASP引物组合9用于扩增SNP位点9，由核苷酸序列为SEQ IDNO.25所示的正向引物F1、核苷酸序列为SEQ ID NO.26所示的正向引物F2以及核苷酸序列为SEQ ID NO.27所示的反向引物R组成；所述SNP位点9的等位变异碱基为C/T，其位于小麦条锈菌参考基因组PST-78序列Supercont.120的第53959位；
（10）KASP引物组合10：该KASP引物组合10用于扩增SNP位点10，由核苷酸序列为SEQ IDNO.28所示的正向引物F1、核苷酸序列为SEQ ID NO.29所示的正向引物F2以及核苷酸序列为SEQ ID NO.30所示的反向引物R组成；所述SNP位点10的等位变异碱基为C/T，其位于小麦条锈菌参考基因组PST-78序列Supercont.136的第207251位；
（11）KASP引物组合11：该KASP引物组合11用于扩增SNP位点11，由核苷酸序列为SEQ IDNO.31所示的正向引物F1、核苷酸序列为SEQ ID NO.32所示的正向引物F2以及核苷酸序列为SEQ ID NO.33所示的反向引物R组成；所述SNP位点11的等位变异碱基为A/G，其位于小麦条锈菌参考基因组PST-78序列Supercont.24的第180282位；
（12）KASP引物组合12：该KASP引物组合12用于扩增SNP位点12，由核苷酸序列为SEQ IDNO.34所示的正向引物F1、核苷酸序列为SEQ ID NO.35所示的正向引物F2以及核苷酸序列为SEQ ID NO.36所示的反向引物R组成；所述SNP位点12的等位变异碱基为A/T，其位于小麦条锈菌参考基因组PST-78序列Supercont.15的第804248位。
2.根据权利要求1所述的KASP引物组，其特征在于，每条正向引物F1的5'-端连接着FAM-tail通用荧光标签序列，每条正向引物F2的5'-端连接着HEX-tail通用荧光标签序列。
3.权利要求1所述的用于检测小麦条锈菌SNP分子标记的KASP引物组在小麦条锈菌遗传多样性分析中的应用。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，包括：
（1）对小麦条锈菌进行采集、分离、鉴定；
（2）提取小麦条锈菌基因组DNA；
（3）对步骤（2）得到的基因组DNA为模板、并分别以检测小麦条锈菌SNP分子标记的12个KASP引物组合为检测引物建立PCR反应体系进行PCR扩增得到PCR扩增产物；
（4）将步骤（3）得到的PCR扩增产物进行荧光信号值的读取获取KASP-SNP 分型数据；
（5）根据所获取的KASP-SNP 分型数据对小麦条锈菌遗传多样性进行分析。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，步骤（3）中所述的基因组DNA的添加量为1μL，所述的12个KASP引物组合的PCR反应体系分别包括：2×KASP mix 170 μL，正向引物F10.51μL，正向引物F2 0.51μL，反向引物1.36μL，总反应体系为172.38μL；所述的PCR扩增的程序为：95℃预变性10 min；95℃变性20 s，61℃退火45 s，10个循环且每循环递减 0.6℃；95℃变性20 s，55℃退火45 s，35个循环。
6.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，步骤（5）中根据所获取的KASP-SNP 分型数据进行转化生成二元基因型数据矩阵后对小麦条锈菌遗传多样性进行分析，其中，根据所获取的KASP-SNP 分型数据进行转化的方法包括：将“XX”转化为“10”，“XY”转化为“11”，“YY”转化为“01”。
7.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，步骤（5）中根据所获取的KASP-SNP 分型数据对小麦条锈菌遗传多样性进行分析的方法选自以下（a）-(e)中的任何一种或多种：
(a) 计算小麦条锈菌遗传多样性水平的参数；
(b) 分析小麦条锈菌的遗传结构；
(c) 构建小麦条锈菌的遗传聚类图；
(d) 构建二维主坐标分析图并用于完成对小麦条锈菌群体内部及相互之间遗传变异起评估作用的分子方差分析；
(e) 计算小麦条锈菌不同地区群体之间的成对遗传分化以及计算小麦条锈菌群体间基因流。
8.一种用于检测小麦条锈菌SNP分子的KASP检测试剂盒，包括KASP mix和KASP检测引物组；其特征在于，所述KASP检测引物组为权利要求1所述的KASP引物组。
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