CN113388697A - 一种kasp-snp分子探针及其检测方法与应用 - Google Patents

一种kasp-snp分子探针及其检测方法与应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种检测小麦条形柄锈菌对三唑类杀菌剂抗药性的KASP‑SNP分子探针，包括正向引物F1、正向引物F2和反向引物R；还提供了检测方法：提取小麦的条形柄锈菌的基因组DNA，得到待检测基因组DNA，用KASP‑SNP分子探针对所述待检测基因组DNA进行PCR扩增得到PCR扩增产物，PCR板冷却至室温后，用酶标仪进行检测，然后将数据导入Kluster Caller软件进行基因分型，敏感性条形柄锈菌的碱基类型为AA，荧光显示为蓝色；抗药性条形柄锈菌的碱基类型为AT或者TT，其中AT为杂合抗药类型，荧光显示为绿色，TT为纯合抗药类型，荧光显示为红色。还提供了应用，用于快速检测小麦条形柄锈菌对三唑类杀菌剂的抗药性。本发明的KASP‑SNP分子探针用于小麦条形柄锈菌对三唑类杀菌剂抗药性的快速检测。

Description

一种KASP-SNP分子探针及其检测方法与应用
技术领域
本发明属于三唑类杀菌剂抗药性检测技术领域，具体涉及一种检测小麦条形柄锈菌对三唑类杀菌剂抗药性的KASP-SNP分子探针及其检测方法与应用。
背景技术
由条形柄锈菌(Puccinia striiformis f.sp.tritici)引起的条锈病是小麦上最重要的真菌病害，常年威胁小麦安全生产，病害大流行年份造成严重减产甚至绝收。化学防治是小麦条锈病应急防控的重要手段，三唑类杀菌剂(主要是三唑酮)用于中国小麦条锈病防治已愈四十年。单一药剂的长期使用已引致条形柄锈菌对该类杀菌剂的抗药性，然而由于条形柄锈菌为严格活体专性寄生真菌，迄今未有有效方法检测小麦条形柄锈菌对三唑类杀菌剂的抗药性，导致田间过量用药并且达不到之前的防效，一方面增大防治成本，另一方面造成环境污染。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于针对上述现有技术的不足，提供一种检测小麦条形柄锈菌对三唑类杀菌剂抗药性的KASP-SNP分子探针及其检测方法与应用，该KASP-SNP分子探针用于小麦条形柄锈菌三唑类杀菌剂抗药性的快速检测。
为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：一种检测小麦条形柄锈菌对三唑类杀菌剂抗药性的KASP-SNP分子探针，所述KASP-SNP分子探针包括正向引物F1、正向引物F2和反向引物R；所述正向引物F1具有如SEQ ID No.1所示的核苷酸序列；所述正向引物F2具有如SEQ ID No.2所示的核苷酸序列；所述反向引物R具有如SEQ ID No.3所示的核苷酸序列。
本发明还提供了上述的KASP-SNP分子探针检测小麦条形柄锈菌对三唑类杀菌剂抗药性的方法，该方法为：
S1、提取小麦条形柄锈菌(Puccinia striiformis f.sp.tritici)夏孢子的基因组DNA，得到待检测基因组DNA；
S2、以S1中得到的待检测基因组DNA为模板，用KASP-SNP分子探针对所述待检测基因组DNA进行PCR扩增得到PCR扩增产物，PCR扩增的反应体系为：浓度为25ng/μL的待检测基因组DNA 1.0μL、2×Taq MasterMix 10μL、10μM的正向引物F10.5μL、10μM的正向引物F20.5μL、10μM的反向引物R1μL、ddH2O补足至20μL；
PCR扩增的反应程序为：94℃预变性3min；94℃变性30s，65℃退火30s，72℃延伸45s、每个循环延伸温度降低1℃，进行10次循环；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸45s，进行20次循环；72℃终延伸10min，反应终止；
S3、待PCR板冷却至室温后，将S2中得到的PCR扩增产物，用酶标仪进行检测，然后将数据导入Kluster Caller软件进行基因分型，敏感性条形柄锈菌的碱基类型为AA，荧光显示为蓝色；抗药性条形柄锈菌的碱基类型为AT或者TT，其中AT为杂合抗药类型，荧光显示为绿色，TT为纯合抗药类型，荧光显示为红色。
本发明还提供了上述的检测小麦条形柄锈菌对三唑类杀菌剂抗药性的KASP-SNP分子探针的应用，其特征在于，所述KASP-SNP分子探针用于快速检测小麦条形柄锈菌Puccinia striiformis f.sp.tritici对三唑类杀菌剂的抗药性。
优选地，所述三唑类杀菌剂为三唑酮。
本发明与现有技术相比具有以下优点：
本发明的KASP-SNP分子探针用于小麦条形柄锈菌对三唑类杀菌剂抗药性的快速检测，能迅速将抗药性与敏感性条形柄锈菌菌系进行区分，具有准确、高效、灵敏、高通量等优势，可用于田间菌系快速抗药性检测，为开展大规模的小麦条形柄锈菌三唑类杀菌剂抗药性监测工作奠定基础，为条形柄锈菌化学防治、杀菌剂的合理使用提供理论依据。
下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细说明。
附图说明
图1是本发明的KASP-SNP(单核苷酸多态性)基因分型示意图。
图2是本发明三唑酮不同浓度下条形柄锈菌敏感性菌株的表现图。
图3是本发明三唑酮不同浓度下条形柄锈菌抗药性菌株的表现图。
具体实施方式
实施例1
本实施例的检测小麦条形柄锈菌对三唑类杀菌剂抗药性的KASP-SNP分子探针，所述KASP-SNP分子探针包括正向引物F1、正向引物F2和反向引物R；所述正向引物F1具有如SEQ ID No.1所示的核苷酸序列；所述正向引物F2具有如SEQ ID No.2所示的核苷酸序列；所述反向引物R具有如SEQ ID No.3所示的核苷酸序列；所述三唑类杀菌剂为三唑酮；
本实施例还提供了上述的KASP-SNP分子探针检测小麦条形柄锈菌对三唑类杀菌剂抗药性的方法，该方法为：
S1、提取小麦条形柄锈菌(Puccinia striiformis f.sp.tritici)夏孢子的基因组DNA，得到待检测基因组DNA；
S2、以S1中得到的待检测基因组DNA为模板，用KASP-SNP分子探针对所述待检测基因组DNA进行PCR扩增得到PCR扩增产物，PCR扩增的反应体系为：浓度为25ng/μL的待检测基因组DNA 1.0μL、2×Taq MasterMix 10μL、10μM的正向引物F10.5μL、10μM的正向引物F20.5μL、10μM的反向引物R1μL、ddH2O补足至20μL；
PCR扩增的反应程序为：94℃预变性3min；94℃变性30s，65℃退火30s，72℃延伸45s、每个循环延伸温度降低1℃，进行10次循环；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸45s，进行20次循环；72℃终延伸10min，反应终止；
S3、待PCR板冷却至室温后，将S2中得到的PCR扩增产物，用LUOstar Omega多功能酶标仪进行检测，然后将数据导入Kluster Caller软件进行基因分型，敏感性条形柄锈菌的碱基类型为AA，荧光显示为蓝色；抗药性条形柄锈菌的碱基类型为AT或者TT，其中AT为杂合抗药类型，荧光显示为绿色，TT为纯合抗药类型，荧光显示为红色。
如图1所示，Kluster Caller软件测试的KASP-SNP(单核苷酸多态性)基因分型示意图，显示Ⅰ区域为红色，代表纯合突变，Ⅱ区域为绿色，代表杂合突变，Ⅲ区域为蓝色，代表野生型，Ⅳ区域为对照(黑色)。
本实施例还提供了上述的检测小麦条形柄锈菌对对三唑类杀菌剂抗药性的KASP-SNP分子探针的应用，所述KASP-SNP分子探针用于快速检测小麦条形柄锈菌对对三唑类杀菌剂的抗药性；所述三唑类杀菌剂为三唑酮。
本实施例根据中国小麦条形柄锈菌条中32号生理小种小种(CYR32)基因组序列设计引物用于扩增不同小麦条形柄锈菌菌系CYP51基因，PCR扩增产物进行重测序，测序结果用contig软件拼接，还原完整的小麦条形柄锈菌CYP51基因序列。
本实施例中的正向引物F1的前21个碱基为荧光接头，正向引物F2的前21个碱基为荧光接头，根据CYP51基因编码的蛋白序列中134位酪氨酸突变为苯丙氨酸，最终该病该基因编码的蛋白的构象变化，导致杀菌剂失效，本实施例中敏感性条形柄锈菌的碱基类型为AA(荧光显示为蓝色)，抗药性条形柄锈菌的碱基类型为AT(杂合抗药类型，荧光显示为绿色)或TT(纯合抗药类型，荧光显示为红色)。本实施例的KASP-SNP分子探针能迅速将抗药性与敏感性条形柄锈菌菌系进行区分，具有准确、高效、灵敏、高通量等优势，可用于田间菌系快速抗药性检测。
(一)室内活性与KASP-SNP分子探针检测的一致性：
表1不同活体小麦上的条形柄锈菌菌种对三唑酮抗性的的室内活性试验和对应的KASP-SNP分子探针检测小麦条形柄锈菌对三唑酮抗药性的碱基类型
Figure BDA0003197988480000051
Figure BDA0003197988480000061
注：抗性倍数＜5，敏感型小麦条形柄锈菌菌系；
10＞抗性倍数≥5，低抗小麦条形柄锈菌菌系；
40＞抗性倍数≥10，中抗小麦条形柄锈菌菌系；
抗性倍数≥40，高抗小麦条形柄锈菌菌系。
由表1可知，不同活体小麦上的条形柄锈菌菌种对三唑酮抗性的的室内活性试验得到的抗性情况与KASP-SNP分子探针检测小麦条形柄锈菌对三唑酮抗药性的碱基类型一致，说明本实施例的KASP-SNP分子探针的准确率高，可用于田间菌系快速抗药性检测。
(二)小麦条形柄锈菌对三唑酮抗药性生物学测定：
1、药剂配制：
1)称取0.12g 6-Benzylaminopurine(6BA)，用1mol/L的氢氧化钠溶液加热溶解，加蒸馏水稀释制成1000mg/L母液；
2)称取0.5128g的97.5％的三唑酮原药，加丙酮溶解，用蒸馏水稀释制成100μg/mL母液；
3)将不同量的100μg/mL药剂母液，10ml 1000mg/L的6BA分别加入到灭菌的水琼脂溶液中，最终配置成6-BA浓度为50μg/mL和三唑酮浓度分别为0μg/mL、0.03μg/mL、0.09μg/mL、0.27μg/mL、0.81μg/mL、2.43μg/mL、7.29μg/mL、21.87μg/mL的培养基。
2、定量接种：
待小麦叶片第一片叶片完全展开时，用记号笔在叶片中上部进行5cm叶段画线标记。称取新鲜的小麦条形柄锈菌(Puccinia striiformis f.sp.tritici)夏孢子，用3MNovec TM 7100将夏孢子配成孢子悬浮液(2g/L)，混合均匀后，用移液器吸取2.5μL孢子悬浮液接种至提前用记号笔标记的小麦一叶5cm叶段区间处，接种后，进行保湿处理和孢子小麦活体培养。
3、药剂处理：
待接种麦苗培养5-6d，花斑完全长出后，此时按照标记线将5cm叶段剪下，页面朝上平行摆放在带药培养皿中，每皿贴五片叶段，并用透明塑料胶片压住叶段两头，保证叶段与带药平板的充分接触。之后将培养皿置于16℃光照16h和13℃黑暗8h的培养箱中培养7d至对照组充分发病。
4、结果统计与分析
叶段离体培养7d后，对每组处理叶段进行拍照，用Photoshop CS6软件分别测定叶段和夏孢子的像素值以此计算发病面积的比例，之后用DPS 7.05软件计算毒力回归方程，得到待测菌株的EC50(致死中浓)值。EC50值在0～0.95μg/mL为对杀菌剂敏感菌株，0.95μg/mL～1.90μg/mL为低抗，1.90μg/mL～7.60μg/mL为中抗，7.60μg/mL以上为高抗。
图2为三唑酮不同浓度梯度下敏感性菌株(凤凰-13)的表现，小在三唑酮为0.27μg/L时小麦条锈菌受到抑制，随着三唑酮浓度的增加，对小麦条锈菌的抑制率增强。菌株抗性的与本实施例中用KASP-SNP分子探针检测小麦条形柄锈菌对三唑酮抗药性检测结果一致，KASP-SNP分子探针检测荧光显示为蓝色，碱基类型为AA。
图3为三唑酮不同浓度梯度下抗药性菌株(天水-7)的表现，小麦在喷施有效成分三唑酮为21.87μg/L时小麦条锈菌才受到抑制。菌株抗性的生物学测定结果与本实施例中用KASP-SNP分子探针检测小麦条形柄锈菌对三唑酮抗药性检测结果一致，KASP-SNP分子探针检测荧光显示为红色，碱基类型TT。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例，并非对本发明作任何限制。凡是根据发明技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、变更以及等效变化，均仍属于本发明技术方案的保护范围内。
序列表
<110> 西北农林科技大学
<120> 一种KASP-SNP分子探针及其检测方法与应用
<130> 2019.3.10
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工合成 (Artificial synthesis)
<400> 1
gaaggtgacc aagttcatgc tctgtattcg gtacggatgt agttta 46
<210> 2
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工合成 (Artificial synthesis)
<400> 2
gaaggtcgga gtcaacggat tctgtattcg gtacggatgt agtttt 46
<210> 3
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工合成 (Artificial synthesis)
<400> 3
aagattgcgt tcgggacat 19

Claims (4)

1.一种检测小麦条形柄锈菌对三唑类杀菌剂抗药性的KASP-SNP分子探针，其特征在于，所述KASP-SNP分子探针包括正向引物F1、正向引物F2和反向引物R；所述正向引物F1具有如SEQ ID No.1所示的核苷酸序列；所述正向引物F2具有如SEQ ID No.2所示的核苷酸序列；所述反向引物R具有如SEQ ID No.3所示的核苷酸序列。
2.一种如权利要求1所述的KASP-SNP分子探针检测小麦条形柄锈菌对三唑类杀菌剂抗药性的方法，其特征在于，该方法为：
S1、提取小麦条形柄锈菌Puccinia striiformis f.sp.tritici夏孢子的基因组DNA，得到待检测基因组DNA；
S2、以S1中得到的待检测基因组DNA为模板，用KASP-SNP分子探针对所述待检测基因组DNA进行PCR扩增得到PCR扩增产物，PCR扩增的反应体系为：浓度为25ng/μL的待检测基因组DNA 1.0μL、2×Taq MasterMix 10μL、10μM的正向引物F1 0.5μL、10μM的正向引物F2 0.5μL、10μM的反向引物R1μL、ddH2O补足至20μL；
PCR扩增的反应程序为：94℃预变性3min；94℃变性30s，65℃退火30s，72℃延伸45s、每个循环延伸温度降低1℃，进行10次循环；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸45s，进行20次循环；72℃终延伸10min，反应终止；
S3、待PCR板冷却至室温后，将S2中得到的PCR扩增产物，用酶标仪进行检测，然后将数据导入Kluster Caller软件进行基因分型，敏感性条形柄锈菌的碱基类型为AA，荧光显示为蓝色；抗药性条形柄锈菌的碱基类型为AT或者TT，其中AT为杂合抗药类型，荧光显示为绿色，TT为纯合抗药类型，荧光显示为红色。
3.一种如权利要求1所述的检测小麦条形柄锈菌对三唑类杀菌剂抗药性的KASP-SNP分子探针的应用，其特征在于，所述KASP-SNP分子探针用于快速检测小麦条形柄锈菌Puccinia striiformis f.sp.tritici对三唑类杀菌剂的抗药性。
4.根据权利要求3中所述的应用，其特征在于，所述三唑类杀菌剂为三唑酮。
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