CN111334601A

CN111334601A - 一种谷子大斑病早期诊断的方法

Info

Publication number: CN111334601A
Application number: CN202010171644.2A
Authority: CN
Inventors: 李志勇; 白辉; 王永芳; 申浩冉; 董志平; 马继芳; 全建章; 刘磊
Original assignee: Grain Research Institute of Hebei Academy of Agriculture and Forestry Sciences
Current assignee: Grain Research Institute of Hebei Academy of Agriculture and Forestry Sciences
Priority date: 2020-03-12
Filing date: 2020-03-12
Publication date: 2020-06-26
Anticipated expiration: 2040-03-12
Also published as: CN111334601B

Abstract

本发明公开了一种谷子大斑病早期诊断的方法，属于植物病原真菌分子生物学检测技术领域。该方法根据谷子大斑病菌核糖体ITS基因序列设计出一对特异性引物，利用实时荧光定量PCR对大斑病菌进行定量检测，分析谷子接种后叶片中不同时间点的样本中的大斑病菌的DNA含量动态变化。本发明建立的谷子大斑病菌荧光定量PCR检测方法具有非常好的特异性和灵敏性，可以检测到谷子叶片中微量谷子大斑病菌，为谷子大斑病菌的准确鉴定和早期诊断等奠定了基础。

Description

一种谷子大斑病早期诊断的方法

技术领域

本发明属于植物病原真菌分子生物学检测技术领域，尤其涉及一种谷子大斑病早期诊断的方法。

背景技术

谷子(Setaria italica)属禾本科、黍族、狗尾草属一年生粮食作物，是我国干旱地区主要栽培作物之一。谷子耐旱、耐脊薄、抗逆性强、适应性广，是很好的抗旱作物。在近几年的谷子病害调查中，在河北的谷子产区发现了一种新的叶斑类病害，该病害可以导致谷子叶片提早衰亡，严重影响后期的谷子灌浆，导致谷子的产量和品质有明显下降，并且在部分地区爆发成灾，对谷子的安全生产造成了很大的威胁。

谷子大斑病由狗尾草平脐蠕孢菌(Bipolaris setaria)引起的一种谷子叶部病害。该病害在谷子的整个生育周期内均可发生，通常在谷子的中后期发生较重，尤其是谷子拔节抽穗后症状表现的更为明显。该病主要危害植株叶片部位，一般从植株的底部叶片开始发病，然后逐渐向上蔓延发展。发病初期，谷子大斑病主要症状表现为叶片上有椭圆形、黄色或青灰色的水浸状斑点。在合适的条件下，植株感病后，斑点沿着叶脉迅速增大，形成大小不一的长梭形病斑，呈黄褐色，发病严重时多个病斑会连接起来形成更大的病斑，造成叶片提早死亡。田间湿度过大时，病斑表面会长出明显的灰黑色霉层，该灰黑色霉层为病菌的分生孢子梗和分生孢子。

由于该病害早期症状不太明显，很难根据症状进行病害诊断，而后期发病后病菌产生大量分生孢子引起再侵染，很难进行防控，因此早期诊断对该病害的防控有非常重要作用。另外该病害在某些谷子品种上症状与谷瘟病类似，非专业人士很难区分，容易造成混淆，耽误了该病害的正确用药。随着分子生物学技术的迅猛发展和普及，PCR扩增技术在植物病原真菌检测中应用越来越多。实时荧光定量PCR是近年来迅速发展并广泛应用的一项新技术，是在普通PCR方法的基础上加入荧光标记探针或荧光染料，根据扩增反应后荧光信号的不断积累，可以对PCR整个过程进行实时监控，使检测的准确度、灵敏度和速度有了极大的提高。廖晓兰等利用实时荧光定量PCR技术建立对水稻白叶枯病(Xanthomonas oryzaepv.oryzae)和水稻细菌性条斑病(Xanthomonas oryzae pv.oryzicola)检测的方法。王道泽等建立了十字花科细菌性黑斑病菌的荧光定量检测体系，较常规PCR检测灵敏度提高了100倍。但是目前对于谷子大斑病的早期检测仍然没有十分有效的方法。

发明内容

为了解决上述技术问题，本发明提供一种谷子大斑病早期诊断的方法，通过该方法可快速分析判断出谷子植株中是否存在大斑病菌，并可进一步对大斑病菌的具体含量进行测定。这种方法使检测周期大大缩短，为病害的的早期预警和防治提供技术保障。

为达上述目的，本发明采用如下的技术方案：

本发明提供了一种谷子大斑病早期诊断的方法，其步骤如下：

1、制备谷子大斑病菌基因组DNA，通过ITS通用引物ITS1和ITS4扩增大斑病菌基因组DNA，上游引物ITS1和下游引物ITS4碱基序列分别为序列表中SEQ ID No.15’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’和SEQ ID No.2 5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’。PCR扩增所得591bp的特异性片段进行切胶回收，目的片段纯化后连接到PMD19-T载体，热激法把连接产物转入大肠杆菌感受态细胞，对阳性克隆进行PCR检测，将阳性克隆被送往北京中科希林公司进行测序，该特异片段核苷酸碱基序列信息为序列表中SEQ ID No.3。从测定序列的阳性克隆活化后抽提质粒，利用NanoDrop 1000进行质粒浓度测定，调整到合适浓度后进行10倍系列稀释。

2、实时荧光定量PCR引物的设计

根据谷子大斑病菌rDNA-ITS序列信息，利用BioXM2.6软件设计了一对特异性引物序列SEQ ID No.4和SEQ ID No.5：

SEQ ID No.4DB-1：5’-TCTCTTGGTTCTGGCATCGA-3’；

SEQ ID No.5DB-2：5’-CCCAGCAAGAGGGAGACAA-3’。

3、收集谷子上常见8种植物病原真菌，并提取其基因组DNA；

4、引物特异性检测分析

使用引物DB-1与DB-2对谷子大斑病(Bipolaris setaria)、谷瘟病菌(Magnaporthe oryzae)、谷子白发病菌(Sclerospora graminicola)、谷子纹枯病菌(Rhizoctonia solani)、粟黑穗病菌(Ustilago crameri)、谷锈病(Uromyces setariae-italicae)、粟弯孢霉病菌(Curvularia lunata)和禾谷镰刀菌(Fusarium graminearum)提取的基因组DNA分别进行普通PCR和Real-Time Q PCR扩增，进行引物的特异性检测分析。

5、实时荧光定量PCR标准曲线绘制

把上面步骤提取的阳性质粒做为荧光定量分析的标准品，用灭菌蒸馏水把该标准品10倍系列稀释(10ng/μL～10fg/μL)，系列稀释后的各个样品用于荧光定量标准曲线绘制，以20.0μL反应体系进行荧光定量扩增，该反应体系中Mix 10.0μL，上下游引物各0.8μL，ROX 0.4μL，模板2.0μL，dH₂O(灭菌蒸馏水)6.0μL；反应程序为：50℃孵育2min，预变性95℃10min；95℃变性15s，60℃退火1min，共进行40个循环；然后95℃15s，60℃1min，再从60℃每秒上升0.3℃至95℃15s，收集荧光信号并绘制熔解曲线；

6、在本发明中所述的标准曲线为Y＝-3.523X+27.818，R²＝0.999，其中Y为实时荧光定量PCR反应的Ct值，X为谷子大斑病菌DNA的标准质粒含量对数值；

7、在谷子接种大斑病菌0d，1d，2d，3d，4d，5d，6d后收集不同时间段叶片样本；

8、分别对各时间点叶片样本进行基因组DNA的提取；

9、根据标准曲线分析待测谷子叶片中的大斑病菌含量。

本发明提供的特异性引物SEQ ID No.4和SEQ ID No.5同样可以应用到普通PCR中对大斑病菌进行定性分析，确定样本是否侵染了该病菌。

本发明利用荧光定量PCR技术研究谷子植株内病原菌，建立一种用时少准确性高的的鉴定方法，在谷子大斑病菌侵染谷子1d后就能够检测到病原菌。该方法不仅可以对谷子大斑病菌进行鉴定，还可以对其进行定量分析，可以监测到谷子大斑病菌侵染谷子后不同时间病原菌含量的动态变化，可以对其进行精准监测，可以为病害防治提前做出预警，把病害控制在初始阶段，可以减少农药的使用量，降低对环境的污染。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

(1)灵敏度高：对不同稀释的样品检测分析，发现该检测体系可以检测到样品浓度最低下限为10fg/μL。

(2)特异性强：荧光定量溶解曲线和常规PCR检测分析结果显示，该引物具有很好的特异性，利用该引物扩增只能检测到谷子大斑病菌。

(3)重复性好：本发明建立的标准曲线为Y＝-3.523X+27.818，R2＝0.999，该数值非常接近于1，这表明PCR模板浓度与Ct值之间的关系为较为典型的线性函数关系，定量检测数据的准确性和重复性都非常高。

附图说明

图1为实施例1中利用通用引物对大斑病菌的ITS序列扩增电泳图。

图2为实施例2中普通PCR电泳图。

图3为实施例2中Real-time Q PCR引物熔解曲线特异性分析图。

图4为实施例3中大斑病菌系列稀释标准品Real-time Q PCR扩增曲线图。

图5为实施例3中大斑病菌系列稀释标准品Real-time Q PCR标准曲线图。

图6为实施例4中接种后不同时间点谷子叶片中大斑病菌含量的动态变化图。

具体实施方式

实施例1

1.大斑病菌ITS序列的扩增

(1)采用CTAB法提取大斑病菌DNA

a)将200mg谷子大斑病菌菌丝体用液氮研磨至粉状后转移到1.5mL离心管中，加入650μL CTAB提取缓冲液，充分颠倒混匀。

b)样品65℃水浴40min，期间对样品进行颠倒混匀3-4次。

c)待样品冷却到室温后，加入等体积的苯酚:氯仿:异戊醇(体积比25:24:1)，轻轻混匀，4℃12000rpm离心10min。

d)收集上清后转移至新的1.5mL离心管中，加入等体积的氯仿:异戊醇(体积比24:1)，轻轻混匀，4℃12000rpm离心10min。

e)收集上清后转移至新的1.5mL离心管中，加入等体积的异丙醇，-20℃冷冻放置60min。

f)4℃12,000rpm，离心10min。

g)弃上清，用75％乙醇洗涤DNA沉淀1-2次，风干DNA。

h)用100μL TE缓冲液溶解DNA，37℃水浴2h加速样品DNA的溶解，DNA溶解完全后-20℃冰冻保存。

2.以真菌ITS通用引物对ITS1(即SEQ ID No.1)和ITS4(即SEQ ID No.2)对谷子大斑病菌基因组DNA进行扩增

(1)引物对序列如下：SEQ ID No.1ITS1：5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’，SEQ IDNo.2ITS4：5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’。采用25.0μL的PCR反应的体系，其中2×Es TaqMaster Mix 12.5μL，ITS通用引物(10μM)各1.0μL，模板DNA 1.0μL，ddH₂O 9.5μL。PCR反应程序为：94℃预变性5min；94℃30s，55℃30s，72℃1min，35个循环；72℃延伸10min。PCR扩增产物经1.2％的琼脂糖凝胶电泳后用EB对凝胶染色，利用BioRad凝胶成像系统对染色后的凝胶进行拍摄分析，结果如图1所示。从图1可以看出，利用该引物扩增出单一的条带，该条带与预期的591bp相符。

(2)用刀片把特异性片段从琼脂糖凝胶上切去下来，利用PCR产物胶回收试剂盒对PCR产物进行回收纯化，纯化后的PCR产物与pMD-19T载体连接过夜，把连接产物通过热激法转入到JM109感受态细胞中，摇培复苏后涂布在添加了氨苄抗性的LB平板上37℃培养过夜，通过菌落PCR检测法挑选阳性克隆，把阳性克隆送到北京中科希林公司进行测序分析，测得的序列信息为SEQ ID No.3，在NCBI对该序列进行在线核苷酸Blast比对，比对结果表明该序列与已知的B.setariae序列相似性最高为99％，以此对克隆的片段的正确性进行了验证。利用质粒小提试剂盒对阳性克隆质粒进行了提取，把该质粒作为荧光定量阳性质粒的标准品，利用NanoDrop 1000对质粒浓度进行了测定。

实施例2

谷子大斑病菌引物的获得及其特异性检测

选择谷子大斑病菌及其它常见的7种谷子病原菌，谷子大斑病(Bipolarissetaria)、谷瘟病菌(Magnaporthe oryzae)、谷子白发病菌(Sclerospora graminicola)、谷子纹枯病菌(Rhizoctonia solani)、粟黑穗病菌(Ustilago crameri)、谷锈病(Uromycessetariae-italicae)、粟弯孢霉病菌(Curvularia lunata)和禾谷镰刀菌(Fusariumgraminearum)进行引物特异性的检测，具体步骤为：

(1)采用与提取谷子大斑病菌DNA相同的方法提取上述8种谷子病原菌的基因组，以这8种谷子病原菌的基因组DNA为PCR扩增模板进行扩增。

(2)利用BioXM2.6软件对大斑病菌核糖体ITS序列进行分析，设计了一对异性引物DB-1和DB-2用来进行荧光定量PCR检测：

SEQ ID No.4DB-1：5’-TCTCTTGGTTCTGGCATCGA-3’；

SEQ ID No.5DB-2：5’-CCCAGCAAGAGGGAGACAA-3’。

(3)利用引物DB-1和DB-2进行普通PCR和荧光定量PCR(Real-Time Q PCR)扩增，普通PCR反应体系以及反应参数设置与实施例1是相同的，Real-Time Q PCR反应体系以及反应参数设置与实施例3是相同的，普通PCR结果如图2所示，其中1为谷子大斑病菌(Bipolaris setaria)，2-8分别为谷瘟病菌(Magnaporthe oryzae)、谷子白发病菌(Sclerospora graminicola)、谷子纹枯病菌(Rhizoctonia solani)、粟黑穗病菌(Ustilago crameri)、谷锈病(Uromyces setariae-italicae)、粟弯孢霉病菌(Curvularialunata)和禾谷镰刀菌(Fusarium graminearum)，9为清水对照；Real-Time Q PCR扩增结果如图3所示。从图2中可以看出，只有大斑病菌DNA样品检测到了194bp的目的条带，以其它7种谷子病原菌DNA样品以及清水对照均未扩增出目标条带，表明该引物特异性非常好，不受谷子上其它病原菌干扰，可以用来对谷子大斑疾病菌特异性检测。从图3中可以看出，实时荧光定量PCR的结果也验证了该引物的特异性，在大斑病菌样品中出现了单一产物吸收峰，未在其它7种病原菌和清水对照发现此产物吸收峰，表明该引物有非常好的特异性。

实施例3

实时荧光定量PCR体系的建立和检测分析

本实施例所使用的特异性引物对与实施例2相同，具体检测步骤如下：

(1)制作标准曲线所需模板的制备

把阳性质粒DNA标准品稀释为7个浓度梯度：10ng/μL、1ng/μL、100pg/μL、10pg/μL、1pg/μL、100fg/μL、10fg/μL。

(2)实时荧光定量PCR

以稀释后的质粒DNA样品为模板进行荧光定量PCR分析，同时设置无菌水为模板作为阴性对照。反应体系为20μL：10μL 2×SYBR Premix，0.4μL ROX Reference Dye，引物(10μM)各0.8μL，2μL DNA模板，6μL不含核酸酶的水。阴性对照反应体系相似，用2μL的无菌水代替模板DNA。每个样品设置3个重复，反应条件：50℃2min，95℃10min，95℃15s，60℃1min，运行40个循环；然后95℃15s，60℃1min，再从60℃每秒上升0.3℃至95℃15s，收集荧光，用于绘制熔解曲线。反应在Applied Biosystems StepOneTM荧光PCR仪上进行，反应结束后用STEP ONE软件对仪器生成的扩增曲线、标准曲线和熔解曲线进行分析。

利用STEP ONE软件绘制出反应的扩增曲线，结果如图4所示。从左到右的7条曲线分别为反应模板浓度为10ng/μL、1ng/μL、100pg/μL、10pg/μL、1pg/μL、100fg/μL、10fg/μL 7个样品的的扩增曲线，从图4中可以看出7个DNA标准品扩增曲线比较平滑，为典型性的S型扩增曲线，并且各循环阈值(Ct值)相对均匀的间隔分布。

根据提供的系列稀释的标准品浓度和荧光定量反应的循环阈值(Ct值)，利用STEPONE软件绘制出反应的标准曲线，如图5所示，并提供了样品浓度和荧光定量反应的循环阈值(Ct值)之间的计算公式：Y＝-3.523X+27.818，R²＝0.999，相关系数R²＝0.999非常接近1，表明该标准曲线循环阈值与模板浓度具有良好的线性关系。另外斜率为-3.523，扩增效率E＝97.58％，根据该标准曲线可根据循环阈值(Ct值)对模板含量进行定量分析。

实施例4

谷子大斑病菌侵染谷子后不同时间点叶片中病菌含量测定

利用ABI公司的Applied Biosystems StepOneTM荧光PCR仪进行荧光定量PCR扩增，其步骤如下：

(1)不同接种时间点叶片样品的采集

在花盆中放置灭菌营养土进行谷子种植，每盆种植5株谷子，一共种植20盆，设置3个实验重复。在培养箱中进行幼苗培养，培养条件为28℃下以光照14小时、25℃黑暗10小时。在PDA平板上活化谷子大斑病菌，收集分生孢子，将谷子大斑病菌配成5×10⁶个孢子/mL的孢子悬浮液，均匀的喷接到6-7叶期的谷子叶片上，黑暗条件下28℃保湿24h后置于培养箱中继续正常培养。在谷子接种大斑病菌0d，1d，2d，3d，4d，5d，6d后分别采集谷子叶片样本，每个时间点采集5片叶子，混合后放到液氮中冷冻，然后保存到-80℃，备用。

(2)对接种后的各时间点的混合叶片每个叶片剪取部分组织后混合，利用天根公司的植物DNA小量提取试剂盒对样品总DNA进行提取。

a)新鲜混合叶片200mg，加入液氮后充分碾磨成粉末。加入400μL缓冲液FP1和6μL的RNase A(10mg/mL)，旋涡振荡1min，室温放置10min。

b)将粉末转移到1.5mL离心管中，加入130μL缓冲液FP2，充分混匀，涡旋振荡1min。

c)12,000rpm离心5min，将上清转移至新的离心管中。

d)向上清液中加入0.7倍体积的冰冻异丙醇进行DNA沉淀，充分混匀，此时会出现絮状基因组DNA，12,000rpm离心5min，弃上清，保留沉淀。

e)加入600μL 70％乙醇洗涤沉淀2次。

f)彻底晾干残余的乙醇。

g)加入适量洗脱缓冲液TE，65℃水浴60min溶解DNA，利用NanoDrop 1000对接种后不同时间点叶片总DNA浓度进行测定，-20℃冷冻备用。

(3)使用实施例2提供的特异性引物组，采用实施例3的扩增体系进行扩增，根据标准曲线分析，可以对各个接种时间点谷子叶片中大斑病菌含量进行定量分析，结果如图6所示。从图6中可以看出，接种1d后就能够检测到大斑病菌在叶片中的存在，此时病菌在叶片中的含量仅为0.08ng/g叶片并且从图中可以看出，谷子叶片中大斑病菌含量也在随着接种时间的增加而逐渐增加。

以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。

序列表

<110> 河北省农林科学院谷子研究所

<120> 一种谷子大斑病早期诊断的方法

<130> 2020.2.12

<141> 2020-02-27

<160> 5

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 1

tccgtaggtg aacctgcgg 19

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 2

tcctccgctt attgatatgc 20

<210> 3

<211> 591

<212> DNA

<213> 谷子大斑病菌(Bipolaris setaria)

<400> 3

tccgtaggtg aacctgcgga gggatcatta cacaacgaaa atatgaaggc tttggcttcg 60

cggccggctg aaatattttt ttcacccatg tcttttgcgc acttgttgtt tcctgggcgg 120

gttcgcccgc caccaggacc aaaccataaa cctttttttt aatgcagtcg caatcagcgt 180

cagtaaaaaa taatgtaatt attacaactt tcaacaacgg atctcttggt tctggcatcg 240

atgaagaacg cagcgaaatg ggatacgtag tgtgaattgc agaattcagt gaatcatcga 300

atctttgaac gcacattgcg ccctttggta ttccaaaggg catgcctgtt cgagcgtcat 360

ttgtaccttc aagctttgct tggtgttggg cgttttttgt ctccctcttg ctgggagact 420

cgccttaaaa cgattggcag ccggcctact ggtttcggag cgcagcacat attttgcact 480

ctgtgtcagg agaaaaggac ggtaatccat caagactcta caaattttaa cttttgacct 540

cggatcaggt agggataccc gctgaactta agcatatcaa taagcggagg a 591

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 4

tctcttggtt ctggcatcga 20

<210> 5

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 5

cccagcaaga gggagacaa 19

Claims

1.一种谷子大斑病早期诊断的方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)提取样本DNA；

(2)以步骤(1)中提取的DNA为模板，SEQ ID No.4和SEQ ID No.5所示的核苷酸序列为引物组进行PCR；

(3)对PCR扩增产物进行检测；

所述SEQ ID No.4和SEQ ID No.5所示的核苷酸序列如下：

SEQ ID No.4：5’-TCTCTTGGTTCTGGCATCGA-3’；

SEQ ID No.5：5’-CCCAGCAAGAGGGAGACAA-3’。

2.根据权利要求1所述的谷子大斑病早期诊断的方法，其特征在于，所述步骤(2)中采用25.0μL的PCR反应体系，其中2×Es Taq Master Mix 12.5μL，引物浓度都为10μM，加入量各1.0μL，模板DNA 1.0μL，ddH₂O 9.5μL。

3.根据权利要求2所述的谷子大斑病早期诊断的方法，其特征在于，所述步骤(2)中PCR扩增程序为：94℃预变性5min；94℃30s，55℃30s，72℃1min，35个循环；72℃延伸10min。

4.根据权利要求1-3任一项所述的谷子大斑病早期诊断的方法，其特征在于，所述步骤(3)中PCR能扩增出194bp的特异性条带则说明样本已被谷子大斑病菌侵染。

5.根据权利要求1所述的谷子大斑病早期诊断的方法，其特征在于，所述步骤(2)中进行实时荧光定量PCR。

6.根据权利要求5所述的谷子大斑病早期诊断的方法，其特征在于，所述步骤(2)中实时荧光定量PCR的反应体系为20μL：10μL2×SYBR Premix，0.4μL ROX Reference Dye，引物各0.8μL，2μL DNA模板，6μL不含核酸酶的水。

7.根据权利要求6所述的谷子大斑病早期诊断的方法，其特征在于，所述步骤(2)中实时荧光定量PCR的反应条件为：50℃2min，95℃10min，95℃15s，60℃1min，运行40个循环；然后95℃15s，60℃1min，再从60℃每秒上升0.3℃至95℃15s，收集荧光，用于绘制熔解曲线。

8.根据权利要求7所述的谷子大斑病早期诊断的方法，其特征在于，所述步骤(3)中以不同浓度的阳性质粒DNA样品为模板进行荧光定量PCR，绘制出反应的标准曲线，根据检测样品循环阈值对其模板含量进行定量分析。

9.根据权利要求8所述的谷子大斑病早期诊断的方法，其特征在于，绘制的标准曲线为Y＝-3.523X+27.818，R²＝0.999。