CN104818339A - 一种油菜茎基溃疡病菌的检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种检测油菜茎基溃疡病菌的LAMP-LFD检测方法，设计了三对LAMP引物FIP、BIP、LF、LB、F3和B3，其中FIP为5’端生物素标记引物，LF为5’端异硫氰酸荧光素FITC标记探针，配制含三对引物和样品模板的LAMP反应体系步骤，对LAMP反应体系进行扩增，然后用LFD检测，并随后进行了特异性和灵敏度评价。结果显示，应用LAMP-LFD方法对L.maculans基因组DNA检测最低检测线为114fg/μL；特异性验证实验中，用5株相关植物病原菌，链格孢属、龙眼焦腐病菌、镰刀菌属、大豆北方茎基溃疡病菌，大豆南方茎基溃疡病菌和L.maculans作为特异性试验菌株，LAMP-LFD法检测只对L.maculans呈阳性反应。

Description

一种油菜茎基溃疡病菌的检测方法

技术领域

本发明属于微生物检测技术领域，具体涉及一种油菜茎基溃疡病菌Leptosphaeria maculans的检测方法。

背景技术

油菜茎基溃疡病(phom a stem canker)是油菜上最严重的真菌病害之一,其致病菌为小球腔菌属的油菜茎基溃疡病菌(Leptosphaeria maculans)。L.maculans致病力非常强,能引起油菜茎基部发生溃烂，导致油菜茎基溃疡病严重流行和油菜产量损失的主要原因。据估计,全世界因此病而造成油菜经济损失每年超过3亿欧元。该病原菌在欧洲、澳大利亚、加拿大、美国等地广泛分布,目前在我国还未见报道，但我国油菜产区气候与欧、美、澳三大洲相似。该病菌可以通过种子进行传播,随着国际贸易和种质资源交流日渐频繁，病菌传入风险加剧。2007年,我国已将油菜茎基溃疡病菌L.maculans列为检疫性有害生物。因此，提供一种便捷有效的方式检测L.maculans对于保护我国油菜生产安全具有重要意义。目前，对于L.maculans的检测主要为聚合酶链式反应(polymerase chainreaction，PCR)法，但PCR检测操作复杂且耗时长，同时需要PCR仪、凝胶电泳和成像系统等昂贵的实验仪器以及分子生物学专业的操作人员，在适用性局限较大。

发明内容

本发明的目的是提供一种快速检测油菜茎基溃疡病菌的方法，以实现对油菜茎基溃疡病菌进行快速、安全、特异、灵敏、简便的现场检测，从而弥补现有技术的不足。

本发明首先提供一种检测油菜茎基溃疡病菌的环介导等温扩增引物组，包含有如下的引物：

F3引物Lep-F3:5′-TCTCTTGGTTCTGGCATCGA-3′(SEQ ID NO:1)、

B3引物Lep-F3:5′-AAATGTGCTGCGCTCCA-3′(SEQ ID NO:2)、

FIP引物Lep-FIP:

5′-AAGGGGCGCAATGTGCGTT-ACGCAGCGAAATGCGATA-3′(SEQ ID NO:3)、BIP引物Lep-BIP:

5′-TACCCTCAAGCTCTGCTTGGTG-GCCAATTGTTTCAAGGCGAG-3′(SEQ IDNO:4)、

LF引物Lep-LF:5′-CACTGAATTCTGCAATTCACACTAC-3′(SEQ ID NO:5)、

LB引物Lep-LB:5′-TTGGGTGTTTGTTCCACTTGG-3′(SEQ ID NO:6)；

作为优选，Lep-FIP的序列如下:

5′-AAGGGGCGCAATCACCGTT-ACGCAGCGAAATGCGATA-3′(SEQ IDNO:7)、

Lep-BIP的序列如下:

5′-TACCCTCAAGCTCTGCTTGGTG-GCCAATTGTTTCATCGCGAG-3′(SEQ IDNO:8)。

其中Lep-FIP为5′端进行生物素标记，Lep-LF的5′端进行异硫氰酸荧光素FITC标记；

本发明还提供一种检测油菜茎基溃疡病菌的方法，包括如下的步骤

1)配制LAMP反应体系：各引物的终浓度为：内引物Lep-FIP和Lep-BIP各1.6μmol/L，外引物Lep-F3和Lep-B3各0.2μmol/L，环引物Lep-LF和Lep-LB各0.8μmol/L；缓冲液组成及浓度为：Tris-HCl(pH 8.8)20mmol/L、KCl 10mmol/L，MgSO4 8mmol/L，(NH4)2 SO4 10mmol/L，Tween20 0.1％，Betaine 0.8mol/L，dNTPs 1.4mmol/L；8U Bst DNA聚合酶和1ul样品模板，加双蒸水使反应体系总体积为25ul；

2)LAMP反应体系扩增：将上述反应体系进行扩增反应，扩增反应温度为61-65℃，扩增反应时间为15-90min。

3)LFD检测：取8ul扩增产物加入100ul Buffer中混匀，然后将LFD试纸条浸入取出的扩增产物中显色检测，判断横向流动试纸条检测LAMP的结果。不步骤3中所述的最适反应温度为63℃，最适反应时间为35min。

本发明所提供的油菜茎基溃疡病菌LAMP-LFD检测方法具有如下优点：

一、灵敏度高，对油菜茎基溃疡病菌的检测极限可低至114fg/ml，其检测灵敏度比常规PCR的检测高出10倍。

二、特异性强，所用的特异性引物根据油菜茎基溃疡病菌的IST基因中的六个不同区域设计，其中LF同时为DNA特异性探针，特异性比常规PCR强。

三、检测时间短，1h左右可获得检测结果，比常规PCR检测节省2-4h。

四、仪器设备要求低，不需要PCR仪、凝胶电泳和成像系统，只需一个水浴锅即可完成检测。

五、操作简单、结果明显，整个检测过程不涉及复杂仪器和设备，稍有分子生物学基础的人员即可完成操作；检测结果清晰明显，直接肉眼观察即可判断。

六、对人身和环境更安全，检测过程不使用EB等有毒试剂。

综上所述，本发明具有比现有技术用的PCR检测油菜茎基溃疡病菌的方法具有更高的特异性、灵敏度和便捷性，并且可以在实际生产中现场应用，有利于检测和控制油菜中茎基溃疡病的爆发。运用本发明的方法对油菜籽进行检测，能有效的判断进出口中的油菜籽是否含有油菜茎基溃疡病菌，这对保护我国油菜生产安全具有重要意义。

附图说明

图1：PCR-AGE检测油菜茎基溃疡病菌的灵敏度比较图、

图2：LAMP-AGE检测油菜茎基溃疡病菌的灵敏度比较图、

图3：LAMP-LFD检测油菜茎基溃疡病菌的灵敏度比较图、

图1-3中，1泳道M为DL2000DNA marker,2泳道为阴性对照，3泳道为100(菌浓度11.4ng/ul),4-9泳道依次为10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7倍稀释的基因组DNA。

图4：PCR-AGE检测油菜茎基溃疡病菌的特异性图、

图5：LAMP-AGE检测油菜茎基溃疡病菌的特异性图、

图6：LAMP-LFD检测油菜茎基溃疡病菌的特异性图；

图4-6中，1泳道M为DL2000DNA marker,2泳道为阴性对照，3-8泳道依次为链格孢属、龙眼焦腐病菌、油菜茎基溃疡病菌、镰刀菌属、大豆北方茎基溃疡病菌、大豆南方茎基溃疡病菌。

具体实施方式

环介导等温扩增技术(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)，其反应依赖于具有链置换活性的Bst DNA聚合酶，通过4个特异引物，在恒温条件下(65℃左右)高效(30min-1h)扩增目标DNA。LAMP产物的检测一般采用琼脂糖凝胶电泳、浊度观察、荧光染料目测观察等方法。

横向流动试纸条(lateral flow dipstick,LFD)是一种新的检测方法，反应中FITC标记的探针与生物素标记的LAMP扩增产物特异性杂交，避免了琼脂糖凝胶电泳或荧光染料染色肉眼观察由非特异性扩增造成的假阳性，进一步提高了反应的特异性和灵敏度。LFD检测不需要特性设备以及EB等有毒试剂，操作者只需将终产物和试纸条浸入缓冲液即可，操作简便，安全。LAMP-LFD结合技术的检测结果可以直接肉眼观察，LFD试纸条上有控制带和检测带，两条带均显色表示检测结果为阳性，只有控制带显色、检测带不显色表明检测结果为阴性。LAMP-LFD结合方法安全、快捷、高效、高灵敏度且无设备及技术限制，具有其他技术所无法替代的优势。

本发明解决上述技术问题所采用的技术方案包括三个部分：1、提供3对用于检测油菜茎基溃疡病菌的LAMP引物序列，即长度分别为20bp、17bp、37bp、42bp、25bp和21bp的寡核苷酸序列，依次命名为Lep-F3、Lep-B3、Lep-FIP、Lep-BIP、Lep-LF和Lep-LB；2、配制LAMP反应体系，通过LAMP反应程序对样品模板进行扩增，确定最佳的反应体系和反应条件；3、将Lep-LF设计为DNA探针，结合LFD技术对LAMP扩增结果进行分析。

以下结合附图实施例对本发明作进一步详细描述。

本发明所使用的油菜茎基溃疡病菌(Leptosphaeria maculans)、链格孢属(Alternaria sp)、龙眼焦腐病菌(Lasiodiplodia theobromae)、镰刀菌属(Fusariumsp)、大豆北方茎基溃疡病菌(Diaporthe phaseolorum caulivora)、大豆南方茎基溃疡病菌(Diaporthe phaseolorum Var meridionalis)均由宁波市舟山出入境检验检疫局提供。以上菌种均选用沙保氏液体培养基培养，放置于摇床黑暗培养7d，温度为20℃。沙保氏液体培养基的制备简述：4g葡萄糖、1g蛋白胨加入100mL的去离子水中混匀，121℃高压灭菌20min，贮存备用。

实施例1:LAMP-LFD技术检测油菜茎基溃疡病菌的方法建立

1.1材料与方法

1.1.1材料

Bst DNA聚合酶，dNTPs购自TaKaRa公司，LFD检测试纸条购自Milenia BiotecGmbH公司(Milenia GenLine HybriDetect MGHD1，Germany)。

1.1.2方法

1.1.2.1 LAMP引物的设计

根据油菜茎基溃疡病菌的IST基因设计和筛选出下面3对引物，引物序列如下所示：

Lep-F3:5′-TCTCTTGGTTCTGGCATCGA-3′

Lep-B3:5′-AAATGTGCTGCGCTCCA-3′

Lep-FIP:

5′-AAGGGGCGCAATGTGCGTT-ACGCAGCGAAATGCGATA-3′

Lep-BIP:

5′-TACCCTCAAGCTCTGCTTGGTG-GCCAATTGTTTCAAGGCGAG-3′

Lep-LF:5′-CACTGAATTCTGCAATTCACACTAC-3′

Lep-LB:5′-TTGGGTGTTTGTTCCACTTGG-3′

其中Lep-FIP为5′端生物素标记引物，Lep-LF为5′端异硫氰酸荧光素FITC标记探针；油菜茎基溃疡病菌的IST基因LAMP扩增引物序列位置如图1所示。按照上述引物序列有大连宝生物公司进行LAMP引物合成。

1.1.2.2 LAMP扩增条件优化

以L.maculans的基因组DNA作为模板进行扩增条件优化。LAMP法DNA反应试剂盒购自博奥生物科技有限公司。首先配制具有最佳扩增效率和检测特异性的反应体系，本发明中的LAMP反应体系为：各引物浓度为：FIP-bio和BIP各1.6μmol/L，F3和B3各0.2μmol/L，LF-fitc和LB各0.8μmol/L；缓冲液组成及浓度为：Tris-HCl(pH 8.8)20mmol/L、KCl 10mmol/L，MgSO4 8mmol/L，(NH4)2 SO4 10mmol/L，Tween20 0.1％，Betaine 0.8mol/L，dNTPs 1.4mmol/L；8U Bst DNA聚合酶；基因组DNA模板2ul。按照上述体系要求配制反应混合物，混匀后分装到无菌PCR管中，反应总体积为25ul。LAMP-LFD反应体系见表1。

表1：LAMP-LFD反应体系

在反应程序中，扩增温度过高或过低均不利于LAMP反应。应用本发明提供的引物和采用本发明确定的反应体系，分别对比不同温度(61、63、65℃)条件下对LAMP反应的影响，反应进行15min后每隔10min停止一个LAMP试验看是否出现扩增。阴性对照管在最后一个反应时间取出，看是否出现假阳性现象。最终选择63℃，35min作为后续LAMP扩增的最佳反应条件。

1.2.2.3 LFD检测

LAMP扩增结束后，取8ul杂交液加入100ul Buffer混匀，将LFD试纸条浸入其中，观察检测带是否显色。如果检测带显色表示该样品的油菜茎基溃疡病菌的检测结果为阳性，如果不显色表示该样品的茎基溃疡病菌的检测结果为阴性。

实施例2

用本发明的LAMP-LFD技术检测油菜茎基溃疡病菌的灵敏度测定

1、参照DNA提取试剂盒提取的油菜经济溃疡病菌基因组DNA，将所提取的油菜经济溃疡病菌基因组DNA模板原始浓度(11.4ng/ul)按10倍梯度稀释，分别做模板。

2、用LAMP-AGE、LAMP-LFD和PCR法进行油菜茎基溃疡病菌检测比较灵敏度。

2.1按照本发明提供的LAMP的三对引物结合LFD技术将上述梯度稀释后的基因组DNA用作LAMP反应的模板进行扩增，用本发明提供的LFD方法分析LAMP反应，结果见图3。

2.2将上述梯度稀释的基因组DNA用作LAMP-AGE的模板进行琼脂糖凝胶电泳试验，结果见图2。

2.3将上述梯度稀释的基因组DNA用作PCR反应模板，利用上述特异引物F3和B3进行扩增，反应体系为：10μmol/L F3和10μmol/L B3各1μL，PremixTaq酶(TaKaRa)25μL，L.maculans模板3μL，蒸馏水定容至50μL体系。优化后的PCR反应条件：预变性95℃5min；95℃40s，51℃40s，72℃90s，30个循环；72℃延伸10min。扩增产物用1％琼脂糖凝胶电泳检测结果(图1)。

油菜茎基溃疡病菌基因组DNA模板10倍梯度稀释实验证明，LAMP-LFD和LAMP-AGE检测的最低稀释浓度为10^-5，模板浓度为114fg/μL。PCR扩增最低浓度为1.14pg/μL。LAMP-LFD检测的灵敏度比和常规PCR方法高1个数量级，上述结果表明本发明的引物组能够保证检测时的灵敏性。

实施例3

用本发明的LAMP-LFD技术检测油菜茎基溃疡病菌的特异性检测

选取链格孢属(Alternaria sp)、龙眼焦腐病菌(Lasiodiplodia theobromae)、镰刀菌属(Fusarium sp)、大豆北方茎基溃疡病菌(Diaporthe phaseolorumcaulivora)、大豆南方茎基溃疡病菌(Diaporthe phaseolorum Var meridionalis)5株病原菌作为LAMP-LFD特异性试验菌株，其中双蒸水为阴性对照。提取病菌的DNA，扩增产物分别用LFD试纸条和1％琼脂糖凝胶电泳观察扩增结果。检测结果见图4-6，说明本发明提供的油菜茎基溃疡病菌LAMP-LFD检测方法能保证对油菜茎基溃疡病菌的特异性检测，不与其他相关细菌发生交叉反应。

实施例4

为进一步提高LAMP扩增的灵敏度，依据先前设计的引物1.1.2.1，针对Lep-FIP和Lep-BIP我们对其引物中的碱基进行了改造，改造后的引物序列如下：

Lep-FIP-1:

5′-AAGGGGCGCAATCACCGTT-ACGCAGCGAAATGCGATA-3′

Lep-BIP-1:

5′-TACCCTCAAGCTCTGCTTGGTG-GCCAATTGTTTCATCGCGAG-3′

利用改造后的引物进行LAMP扩增的特异性和灵敏度检测。扩增反应体系除将1.1.2.2中两条引物Lep-FIP和Lep-BIP分别更换为Lep-FIP-1和Lep-BIP-1外其他均不变，扩增和LFD检测过程也保持一致。与为进行引物改造前的LAMP-LFD相比，引物改造后的LAMP-LFD在特异性检测实验中与改造前的结果一致。但在灵敏度检测方面，与未改造的引物相关，灵敏度又提高了1个数量级，比常规的PCR方法灵敏度提高了2个数量级。上述结果表明经改造后的本发明的引物组能够在保证特异性检测不变的情况下，进一步提高检测时的灵敏性。

实施例5

LAMP-LFD试剂盒在油菜籽样品的检测应用

在2014年6月至2015年5月期间对从澳大利亚和加拿大进出口船只中的油菜籽样品进行抽样，将每份油菜籽样用1.5mm目筛进行筛选，取筛下物对每份样品进行编号，分别为1-361(澳大利亚)，1-965(澳大利亚)，1-2335(加拿大)，1-1401(加拿大)，1-1165(加拿大)，1-3149(加拿大)，1-2035(加拿大)。用1.1.2.2中的试剂盒法提取各样品的DNA模板。并用已设计好的LAMP-LFD方法检测这些油菜籽样品中是否存在油菜茎基溃疡病菌；同时用实施案例2中2.3所述PCR法进行检测。每个样品分别作5个平行，检测结果如表2所示。

表2：LAMP-LFD与PCR法对油菜籽样品中油菜茎基溃疡病菌检测结果

注：+.阳性；—.阴性

上述结果表明本发明的引物组及检测方法所获得的结果与PCR的结果一致，证明了本发明的可靠性。

Claims (8)

1.一种LAMP引物组，其特征在于，所述的引物组包含有：

F3，序列为TCTCTTGGTTCTGGCATCGA、

B3，序列为AAATGTGCTGCGCTCCA、

FIP，序列为AAGGGGCGCAATGTGCGTT-ACGCAGCGAAATGCGATA、

BIP，序列为TACCCTCAAGCTCTGCTTGGTG-GCCAATTGTTTCAAGGCGAG、

LF，序列为CACTGAATTCTGCAATTCACACTAC、

LB，序列为TTGGGTGTTTGTTCCACTTGG。

2.如权利要求1所述的引物组，其特征在于，所述的FIP的序列为-AAGGGGCGCAATCACCGTT-ACGCAGCGAAATGCGATA。

3.如权利要求1所述的引物组，其特征在于，所述的BIP的序列为TACCCTCAAGCTCTGCTTGGTG-GCCAATTGTTTCATCGCGAG-3。

4.如权利要求1或2所述的引物组，其特征在于，所述的FIP的5′端用生物素标记。

5.如权利要求1或3所述的引物组，其特征在于，所述的LF的3′端用FITC标记。

6.权利要求1所述的引物组在制备检测油菜茎基溃疡病菌制品中的应用。

7.如权利要求6所述的应用，其特征在于，所述的制品为检测试剂盒。

8.一种检测油菜茎基溃疡病菌的方法，其特征在于，所述的方法包括如下的步骤

1)配制LAMP反应体系：各引物的终浓度为：内引物Lep-FIP和Lep-BIP各1.6μmol/L，外引物Lep-F3和Lep-B3各0.2μmol/L，环引物Lep-LF和Lep-LB各0.8μmol/L；缓冲液组成及浓度为：Tris-HCl(pH 8.8)20mmol/L、KCl 10mmol/L，MgSO4 8mmol/L，(NH4)2 SO4 10mmol/L，Tween20 0.1％，Betaine 0.8mol/L，dNTPs 1.4mmol/L；8U Bst DNA聚合酶和1ul样品模板，加双蒸水使反应体系总体积为25ul；

2)LAMP反应体系扩增：将上述反应体系进行扩增反应，扩增反应温度为61-65℃，扩增反应时间为15-90min。

3)LFD检测：取8ul扩增产物加入100ul Buffer中混匀，然后将LFD试纸条浸入取出的扩增产物中显色检测，判断横向流动试纸条检测LAMP的结果。不步骤3中所述的最适反应温度为63℃，最适反应时间为35min。