CN103255207A

CN103255207A - 一种油菜种子携带油菜黑胫病病原菌的分子检测方法

Info

Publication number: CN103255207A
Application number: CN2013100290508A
Authority: CN
Inventors: 李子钦; 宋培玲; 皇甫海燕; 郝丽芬; 赵存虎
Original assignee: Inner Mongolia Academy of Agricultural and Animal Husbandry Sciences
Current assignee: Inner Mongolia Academy of Agricultural and Animal Husbandry Sciences
Priority date: 2013-01-15
Filing date: 2013-01-15
Publication date: 2013-08-21

Abstract

本发明公开了一种油菜种子携带油菜黑胫病病原菌的分子检测方法，其特征在于，包括以下步骤：1)带菌种子的制备；2)取相同数量的带菌种子提取DNA，用RAPD检测经不同处理所得带菌种子的DNA质量；3)从不同带菌率的油菜种子中提取目的病原菌DNA；4)DNA的微量提取；5)模板浓度梯度检测；6)不同带菌率带菌种子DNA的提取；7)PCR扩增不同带菌率带菌种子的DNA。该方法的精确度达到2‰准确率。

Description

一种油菜种子携带油菜黑胫病病原菌的分子检测方法

技术领域

本发明属于农业技术领域，涉及一种可有效检测油菜籽携带油菜黑胫病病原菌的DNA提取及检测方法。

背景技术

油菜黑胫病是一种世界性的油菜病害，可通过病残体和种子传播，预计整个世界范围内每个生长季因黑胫病而造成的产量损失超过90亿美元。其致病病原菌有两种：A型(Leptosphaeria maculans)和B型(L.biglobosa)。L.maculans为强毒株系，感染后引起油菜茎基腐，继而整株倒伏影响产量；L.biglobosa为弱毒株系，感染叶片后形成病斑，但并不足以导致产量损失。L.maculans最早于1975年在加拿大东北部的Saskatchewan省油菜的秸杆底部被发现，随后依靠带菌种子的引种调运快速扩展蔓延，目前在加拿大已成为优势种并与L.biglobosa共生。近年来，L.maculans逐渐向周边国家扩散，比如北美洲原来只有L.biglobosa存在，黑胫病危害也不重，之后L.maculans随带病种子传入，并严重危害。在九十年代中以前，波兰只有L.biglobosa流行，现在L.maculans成了波兰西部的优势种，这些都是L.maculans向东扩展传播的有力证据。L.maculans向东扩展与全球气侯变暖、栽培变化有关。温度的升高有利于L.maculans发生，全球气候变暖会导致暴发更大规模的油菜黑胫病，进一步扩大油菜黑胫病的危害程度和流行范围。因此，L.maculans跨过北美和西欧的传播，使人们更加担心它将会很快传入中国。目前黑胫病不是中国油菜的主要病害，中国目前只有L.biglobosa存在，尚未发现L.maculans，但是在中国有适宜L.maculans流行和爆发的环境条件，而且经落桑研究所测定，中国的主要栽培油菜品种接种L.maculans后均表现高度感病。因此，中国面临L.maculans侵入的巨大潜在危险。

随着经济快速发展、全球气候变暖、病原菌群体变迁和对生物菜油的大量需求，当今世界处于对食物和食用油供不应求的新时代。全球范围内，许多植物病原菌是粮食生产的重要的限制因素。目前全球变暖加速了一些病害对作物生产的威胁和部分毁灭性病害的传播速度和发生区域。黑胫病(Leptosphaeria maculans)是世界范围的毁灭性的油菜病害，全球一个生产季的平均损失达5亿英镑以上。过去的30年里，L.maculans已经入侵到了世界许多新的国家和地区，目前已经严重威胁着中国的油菜生产，因为L.maculans的一个弱毒性的近缘种L.biglobosa已经在我国长江流域和内蒙古的海拉尔出现。欧洲的室内外研究表明：中国目前的主要油菜品种非常容易感染L.maculans，同时中国的气候与农艺条件利于L.maculans.的发生与流行蔓延，因此中国的油菜正面临着L.maculans很快入侵的威胁，研究防治L.maculans策略，阻止L.maculans入侵中国是当今我们保护中国油菜以及十字花科作物的迫切工作。中国是世界上最大的油菜和十字花科蔬菜生产国，年种植油菜800万公顷、十字花科蔬菜170万公顷。L.maculans一旦传入中国，并在国内爆发流行，将会严重影响我国的油菜产量和质量，直接造成油菜的产量损失和农民的经济损失，增加农民负担。所以，应该及早进行国内油菜黑胫病病原菌的普查，并依靠L.maculans在加拿大的流行预测模型定量分析L.maculans传入中国的风险预测预评估，提出防止强毒型L.maculans传入中国的预警预案。

我国的油菜生产与西方油菜的现代化生产大农场、机械化与持续的杀菌剂投入比较，中国大多数油菜生产都处在粗放水平，小田块种植、机械化程度低、有害生物的化学防治水平差，如果一旦L.maculans入侵中国，将给中国油菜带来巨大的经济损失。随着国际贸易的日益频繁，通过油菜种子和菜籽进口带入黑胫病病原菌L.maculans的风险也日趋加大。为了保护L.maculans入侵中国和对油菜等芸薹属作物造成的巨大损失，目前中国迫切需要快速有效地从进口油菜种子中检测L.maculans的分子检测方法、风险预测与评估模型和筛选抗L.maculans油菜新品种。

研究表明：L.maculans的传播是横跨加拿大；从美国进入墨西哥；由西欧到东欧的波兰，这些地区都是先有弱毒性的L.biglobosa出现，然后开始强毒性的近缘种L.maculans传播蔓延，造成严重危害。研究显示L.maculans的跨洲性远距离的传播主要是通过十字花科作物种子的国际贸易，而中国自1998年以来，每年进口约125万吨油菜籽，且多数来自加拿大，而加拿大2％的油菜籽携带L.maculans，所以L.maculans入侵中国的可能性非常大。Bruce Fitt教授和申请人对L.maculans入侵中国的初步风险评估研究表明：如果在较差的检疫方法下将会造成50.9亿美元损失，一般的检疫下将造成46.2亿美元损失，较好的检疫方法时损失只有19.2亿美元；如果L.maculans很快入侵中国，预计损失将达79亿美元；如果建立一个可有效检测种子中L.maculans的方法，可以推迟L.maculans入侵我国11-29年，挽回数十亿美元损失。

中国是甘蓝型和芥菜型油菜的起源地，具有丰富的野生芸薹属多样性资源材料。中国目前缺乏从进口油菜种子中检测L.maculans的分子技术、L.maculans入侵中国的风险预测与评估方法、缺乏抗L.maculans的抗病材料、以及L.maculans和L.biglobosa的生物学规律研究。基于上述原因立项开展下列研究：创建基于PCR的分子诊断方法来检测进口油菜种子中的L.maculans，阻止L.maculans通过种子调运入侵中国。

发明内容

本发明的目的在于弥补现有技术中的空白，提供一种检测油菜种子携带黑胫病病原菌的DNA提取及检测方法。

其具体技术方案为：

一种可有效检测油菜种子携带黑胫病病原菌的分子方法，包括以下步骤：

1)带菌种子的制备：用高压灭菌、经1％NaCLO表面消毒及未经任何处理的种子制备不同带菌率的带菌种子。

2)取相同数量的带菌种子提取DNA，用RAPD检测经不同处理所得带菌种子所得DNA的质量。

3)DNA大量提取：从不同带菌率的油菜种子中用CTAB法提取目的病原菌DNA。

4)DNA微量提取：取100ul经CTAB法大量提取后所得DNA再用QIAGEN试剂盒进行微量提取。

5)模板浓度梯度检测：50ul的扩增体系中加10ul的模板较为理想。

6)扩增反应体系：如表1所示：

表1

7)不同带菌率带菌种子DNA的提取：先用步骤3)的提取方法然后再用步骤4)的提取方法。

8)PCR检测不同带菌率带菌种子DNA。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

本发明技术方案在优化了分子反应体系的基础上，创建了先大量提取再微量提取的DNA提取方法，可在带菌率低为2‰的油菜籽中检出目的病原菌-黑胫病菌，为口岸检疫、阻止检疫性黑胫病入侵我国提供了高效快速的检测方法。应用创建的分子检测方法对澳大利亚实验地的带菌种子进行了实践性检测，检出该种子携带有油菜黑胫病强毒型病原菌，使得创建的检测方法的准确性与灵敏度得到了验证。

附图说明

图1是经1％的NaCLO消毒的种子；

图2是在长满病原菌的平板上培养经高温高压灭菌的种子；

图3是在长满病原菌的平板上培养经未经任何处理的油菜种子；

图4是用RAPD检测经不同处理所得带菌种子的DNA质量图；

图5是直接提取不同数量种子DNA过程中的液相浑浊度对比图；

图6是完成大量提取步骤后加0.5×TE溶解的差异图；

图7是RAPD检测不同DNA提取方法的提取结果图；

图8是50ul的扩增体系中模板梯度扩增结果；

图9是不同带菌率的带菌种子DNA提取结果；

图10是PCR扩增检测不同带菌率的带菌种子的DNA；

图11是用所建DNA提取法对澳大利亚实验地的带菌种子的实践性检测结果图。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明的技术方案作进一步详细地说明。

1带菌种子的制备

由于直接用从大田收集或实验室保存的油菜种子做油菜黑胫病带菌检测实验，我们不确定所用材料是否带有目的病原菌以及带菌率为多少。因此，在研究过程中人为地制造带菌种子，先进行模拟带菌率检测以确保所创建的检测方法准确可行。应用模拟带菌率检测所探索的实验试剂及方法对来自澳大利亚实验地的带菌种子进行实践性检测。

1.1用高压灭菌后的种子制备不同带菌率的种子

取一部分油菜种子置于三角瓶中，高温高压下灭菌20min，待种子冷却后，在无菌条件下，取少量种子分别置于已培养了10d左右的A型(Leptosphaeria maculans)和B型(Leptosphaeria biglobosa)的PDA平板中，25℃下继续培养，待种子表面长满菌丝后，将表面长满目的菌丝的种子转移至1.5ml离心管中，-20℃保存，备用。

1.2用表面消毒后的种子制备不同带菌率的种子

在无菌条件下，取一部分油菜种子置于烧杯中，先用75％的酒精漂洗30s，再用1％的NaCLO消毒15min，无菌水漂洗三次。待种子晾干后，取少量种子分别置于已培养了10d左右的A型(Leptosphaeria maculans)和B型(Leptosphaeria biglobosa)的PDA平板中，25℃下继续培养，待种子表面长满菌丝后，将表面长满目的菌丝的种子转移至1.5ml离心管中，-20℃保存，备用。

1.3用未经任何处理的原始种子制备不同带菌率的种子

在无菌条件下，取一部分未经任何处理的油菜种子置于已培养了10d左右的A型(Leptosphaeria maculans)和B型(Leptosphaeria biglobosa)的PDA平板中，25℃下继续培养，待种子表面长满菌丝后，将表面长满目的菌丝的种子转移至1.5ml离心管中，-20℃保存，备用。

2取相同数量的带菌种子提取DNA，用RAPD检测经不同处理所得带菌种子的DNA质量

图4中，1为100粒未经任何处理的种子的DNA，2为100粒经表面消毒的种子的DNA，3为100粒经高压灭菌后种子的DNA(其中10×，100×表示将各DNA分别稀释10×，100×)。由图4可见，用常规CTAB法大量提取的DNA纯度低，且其内有PCR反应抑制物存在，原液及稀释10×后均无扩增产物，只有稀释100×后才有扩增产物出现。因在口岸抽检每一批进口种子时，从种子里直接提取目的病原菌的DNA，若种子带菌率较低时，该病原菌的DNA含量则非常低，若再稀释后，很可能因模板浓度太低而无扩增产物出现。故需采用先大量提取，再微量提取的DNA提取法来获得较好的模板。同时，由图可知，高压灭菌对种子的DNA有影响，可造成部分条带缺失。因此，实验过程中应选用经表面消毒后的种子或未经任何处理的原始种子制备带菌种子。

3从不同带菌率的油菜种子中提取目的病原菌DNA

3.1加裂解液裂解第一次高速离心后的差异

在不同带菌率带菌种子的大量提取过程中，加1ml裂解液65℃水浴10min，4℃，13200rpm下离心5min后，如图5：随着提取中所用种子总数由100粒到1000粒的增加，中间液相的浑浊度增加。

3.2完成大量提取步骤加0.5×TE溶解后的差异

如图6，以目的菌丝为原材料完成DNA提取加0.5×TE溶解后，所得DNA清澈透明，内无不溶物，以种子为原材料，所得DNA呈黄色，内有大量粘稠状不溶物，且不溶物的量与提取中所用种子的总数量成正比。

4RAPD检测不同方法所提DNA结果

如图7所示，1-4为直接用试剂盒提取，5-6为用常规CTAB法提取，7-10为常规法提取后再用试剂盒提取。

注：样3为样1加100ulAE溶解后，再加100ulAE溶解所得DNA，样4与样2，样9与样7，样10与样8类似；10*代表将所得DNA稀释了10倍；s代表表面消毒后的种子，r代表未经任何处理的原始种子。

由图7可知，先大量提取再微量提取的思路可行，且所得DNA纯度较好，扩增条带清晰，稳定。

5模板浓度梯度检测

因当带菌量较低时，提取DNA时所用种子数量较大，使得DNA里所含PCR反应抑制物的量增多，导致扩增不稳定，故扩增时有必要加大反应体系(由10ul改为50ul)，适当增加模板浓度，对模板浓度梯度进行检测后，50ul的扩增体系中加10ul模板较理想，如图8所示。

6.不同带菌率带菌种子DNA的提取

如图9所示，不同带菌率带菌种子DNA的提取结果，M43为Leptosphaeria maculans；B36Leptosphaeria biglobosa，CK为不带菌种子。

7.PCR扩增不同带菌率带菌种子的DNA

如图10所示，泳道1为阴性对照(不带菌种子的DNA)，2-8分别为L.maculans侵染率0.1％、0.2％、0.5％、1％、10％、20％和30％，9为阳性对照(病原菌L.maculans)。

8.对来自澳大利亚实验地的带菌种子的实践性检测

如图11所示，A为Leptosphaeria maculans，B为Leptosphaeria biglobosa；Ao500为500粒澳大利亚种子所携带的Leptosphaeria maculans，Ao1000为1000粒澳大利亚种子所携带的Leptosphaeriabiglobosa。

以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，本发明的保护范围不限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明披露的技术范围内，可显而易见地得到的技术方案的简单变化或等效替换均落入本发明的保护范围内。

Claims

1.一种油菜种子携带油菜黑胫病病原菌的分子检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)带菌种子的制备：用高压灭菌、经1％NaCLO表面消毒及未经任何处理的种子制备不同带菌率的带菌种子；

2)取相同数量的带菌种子提取DNA，用RAPD检测经不同处理所得带菌种子的DNA质量；

3)DNA大量提取：从不同带菌率的油菜种子中用CTAB法提取目的病原菌DNA；

4)DNA微量提取：取100ul经CTAB法大量提取后所得DNA再用QIAGEN试剂盒进行微量提取；

5)模板浓度梯度检测：50ul的扩增体系中加10ul模板较理想；

6)扩增反应体系：采用ITS引物对病菌rDNA的ITS片段进行扩增，引物序列为：ITS1(5′-CTTGCCCACCAATTGGATCCCCTA-3′)和ITS2(5′-GCAAAATGTGCTGCGCTCCAGG-3′)，50uL PCR反应体系为，5uL10×PCR buffer，0.2mM dNTP，ITS1和ITS2引物各1μM，0.1UTaq酶，10uL模板DNA，17.5uL ddH₂O，PCR反应程序为：94℃，2min94℃，30s；58℃，30s；72℃，1min；44个循环；72℃，5min；8℃5min；

7)不同带菌率带菌种子DNA的提取：先用步骤3)的提取方法然后再用步骤4)的提取方法；

8)PCR检测不同带菌率带菌种子DNA。