DE4127862A1 - Oligonukleotid-sequenzen als primer zur differenzierung aggressiver und nicht-aggressiver pathotypen von phoma lingam und ein verfahren zur differenzierung - Google Patents
Oligonukleotid-sequenzen als primer zur differenzierung aggressiver und nicht-aggressiver pathotypen von phoma lingam und ein verfahren zur differenzierungInfo
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Description
Die Erfindung betrifft synthetische Oligonukleotid-Sequenzen als Primer zur
eindeutigen Differenzierung aggressiver und nicht-aggressiver Pathotypen
von Phoma lingam (leptosphaeria maculans) sowie ein Verfahren zur Differenzierung.
Phoma lingam, dessen sexuelle Form zu den Ascomyceten gehört und als Leptospharia
maculans bezeichnet wird, ist ein phatogener Pilz, der viele
Kreuzblütler befällt und besonders beim Raps (Brassica napus var. oleifera)
große Schäden verursacht. Phoma lingam kann viele Organe der Pflanze während
mehrerer Monate der Anbauperiode infizieren. Frühe Symptome bei Winterraps
sind Blattflecken im Herbst und Frühjahr. Diese Flecken geben Anlaß
zu systemischen Infektionen, die sich im Sproß- und Hypocotylbereich dramatisch
auswirken und zum Tod der Pflanze führen (Schwarzbeinigkeit, Umfallkrankheit).
Es sind bereits Verfahren zur Unterscheidung aggressiver und nicht-aggressiver
Isolate von Phoma lingam bekannt, die in der Bonitur der Symptome auf
diversen Rapssorten besteht. Dabei können generell zwei Pathotyp-Gruppen
unterschieden werden, die als virulent und avirulent (Gabrielson, R. L.,
1983, Seed Sci & Technol. 11, 749-780.) bzw. aggressiv und nicht-aggressiv
(Badaway et al., 1989, J. Phytopathology 127, 146-157) bezeichnet werden.
Im Gegensatz zu den aggressiven infizierten nicht-aggressive Pathotypen
nur die Blätter und werden nicht systemisch. Zusätzlich können die aggressiven
Isolate mit Hilfe differentialdiagnostischer Ansätze auf verschiedenen
Raps-Genotypen in vier verschiedene Pathotypen eingeteilt werden (Badawy
et al. 1991. J. Phytopathology 131, 109-119.).
Diese Verfahren sind sicher, erfordern aber wegen der schlecht quantifizierbaren
Bonitur-Kriterien erheblich Erfahrung des ausführenden Personals
und sind im übrigen außerordentlich aufwendig und langsam, da für das vorliegende
Problem das Auftreten systemischer Infektionen abgewartet werden
muß. Hierfür müssen im allgemeinen 1-2 Monate veranschlagt werden. Außerdem
beeinflussen klimatische Bedingungen das Untersuchungsergebnis. Schon
frühzeitig wurde daher nach Alternativen gesucht. Es gibt eine gewisse aber
nicht sehr sichere Korrelation zwischen der Aggressivität und der Bildung
des Toxins Sirodesmin PL (Koch et al. 1989. J. Phytopathology 124, 52-62).
Außerdem ist die Bildung von Sirodesmin stark von den Wachstumsbedingungen
abhängig und erst nach mehrwöchiger Kultur meßbar. Es ist ferner bekannt,
daß die Unterscheidung von Phoma lingam auch auf molekularer Basis möglich
ist. Prinzipiell ist es möglich, aggressive und nicht-aggressive Isolate
anhand ihrer Karyotyps zu unterscheiden. Dazu werden die Pilze protoplastiert,
in ein Agarosegel eingebettet, lysiert und die freiwerdenden Chromosomen
in Pulsfeldgelen elektrophoretisch getrennt (Taylor et al. 1991,
Curr. Genet. 19, 273-277). In der Praxis ist dieses Verfahren weitgehend
unbrauchbar, da es bei der Protoplastierung erheblichen Entwicklungsaufwand
für jedes neue Isolat erfordert und es außerdem einen Zeitaufwand von etwa
drei Wochen bedarf. Ein weiter bekanntes Verfahren basiert auf der Unterscheidung
der Isolate durch die RFLP-Analyse (RestriktionsFragmentLängenPolymorphismus)
(Hassan et al. 1991, J. Phytopathology 131, 120-136;
Johnson et al. 1991, Physiological and Molecular Pathology 37, 417-424).
Dieses Verfahren ist zuverlässig, aber ebenfalls mit 10 Tagen für die
Durchführung zu aufwendig. Außerdem erfordert dieses Verfahren das Arbeiten
mit radioaktiven Proben, was im Hinblick auf die Entsorgung wenig zweckmäßig
ist.
Es sind Primer mit Kettenlängen zwischen 20 und 30 Nukleotiden bekannt
(Saiki (1989), in PCR Technology, H. A. Ehrlich, pp. 7-16, Stockton Press,
N. Y.). Solche Primer sind für schnelle, voraussetzungsfreie Differenzierungsverfahren
prinzipiell ungeeignet.
Für den effizienten Pflanzenschutz im Rapsanbau ist es von eminenter Bedeutung,
den Befall mit aggressiven Stämmen möglichst frühzeitig von der wesentlichen
harmloseren Infektion mit nicht-aggressiven Pilzen zu unterscheiden.
Kriterien für ein brauchbares Verfahren müssen dabei insbesondere kleiner
experimenteller Aufwand, geringer Zeitbedarf und hohe Sicherheit der Analyse
sein.
Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, Oligonukleotidsequenzen als Primer
für ein Verfahren zur eindeutigen Differenzierung aggressiver und nicht
aggressiver Pathotypen von Phoma lingam bereitzustellen sowie ein Verfahren
bereitzustellen, das ebenso sicher wie die RFLP-Analyse arbeitet, aber
schneller, mit weniger Aufwand und ohne radioaktive Isotopen zum Ziel
führt.
Es wurde nun gefunden, daß auf Basis der Polymerase-Kettenreaktion mit synthetischen
Primern, die aus sehr kurzen synthetischen Oligonukleotiden mit
einer Kettenlänge zwischen 8 und 11 Nukleotiden, vorzugsweise 9 und 10 Nukleotiden
bestehen, eine Untersuchung aggressiver und nicht-aggressiver
Pathotypen von Phoma lingam bereits in sehr frühen Stadien des Befalls
möglich ist. Das Differenzierungsverfahren mit diesen Primern arbeitet
gleichermaßen sicher wie die RFLP-Analyse, führt aber schneller, mit weniger
Aufwand und ohne radioaktive Isotopen zum Ziel.
Eine Differenzierung mit dem erfindungsgemäßen Verfahren, unter Verwendung
der erfindungsgemäßen Primer, ist innerhalb von drei Tagen möglich.
Die eindeutige Differenzierung aggressiver und nicht-aggressiver Pathotypen
von Phoma lingam (leptosphaeria maculans) gelingt mit den folgenden Oligonukleotid-Sequenzen
als Primer:
- 1. 5′-ACGGTCTTGG-3′
- 2. 5′-GAAACAGCGG-3′
- 3. 5′-GGAGCCCAC-3′
Diese drei Primer ergeben jeweils typische Banden für die aggressive und
nicht-aggressive Pathotyp-Gruppe.
Die Polymerase-Kettenreaktion verläuft nach dem Prinzip, daß synthetische
Oligonukleotide als Primer an einzelsträngige DNA-Moleküle gebunden werden
und so die Startpunkte für die Vervollständigung der Ketten zu einem doppelsträngigen
DNA-Molekül bilden.
Durch die Verwendung von thermostabiler DNA-Polymerase kann die Reaktion
nahezu beliebig oft wiederholt werden, so daß die gewünschte DNA um ein
Vielfaches ampliziert werden kann.
Im ersten Schritt der Reaktion wird die chromosomale Pilz-DNA durch Erhitzen
denaturiert, anschließend werden bei niedriger Temperatur die Primer
gebunden. Schließlich werden mit Hilfe der thermostabilen DNA-Polymerase
Desoxynukleotide an die Primer synthetisiert, so daß eine Verdopplung der
Pilz-DNA stattfindet. Durch vielfache Wiederholung dieses Prozesses wird
spezifisch solche Pilz-DNA ampliziert, die von zwei gegenläufig gerichteten
Primern flankiert wird.
Während in der Regel mit Primern von Kettenlängen zwischen 20 und 30 Nukleotiden
gearbeitet wird (Saiki 1989), die exakt auf die Vorlagen-DNA passen
müssen und somit detaillierte Sequenzinformationen des zu amplizierenden
DNA-Abschnitts voraussetzen, werden bei der vorliegenden Erfindung kurze
Oligonukleotide mit einer Kettenlänge zwischen 8 und 11 Nukleotiden, vorzugsweise
neun oder zehn Nukleotiden eingesetzt, die eine primär zufallsmäßig
entworfene Sequenz besitzen. Diese Zufallsprimer ergeben in der Polymerase-Kettenreaktion
reproduzierbar eindeutig definierte Fragmente, ohne
daß es irgendwelcher Sequenzinformationen über Phoma lingam (Leptosphaeria
maculans) bedarf. Die Anwendung ist daher völlig voraussetzungsfrei möglich
und ist lediglich von der Verwendung der richtigen, für den Verwendungszweck
geeigneten Primer und von den ermittelten optimalen Reaktionsbedingungen
abhängig. Die konventionellen Primer mit Kettenlängen von 20-30
Nukleotiden
sind aus diesen Gründen für die voraussetzungsfreie und schnelle
Differenzierung von Pathotypen ungeeignet.
Im Durchschnitt ergeben solche kurzen Oligonukleotid-Primer fünf bis acht
verschiedene Fragmente mit Pilz-DNA als Vorlage. Bestimmte Primer erlauben
die eindeutige Differenzierung verschiedener Pilz-Pathotypen, da sich diese
durch ihre charakteristischen Bandenmuster in der Elektrophorese unterscheiden.
Die eindeutige Differenzierung aggressiver und nicht-aggressiver Pathotypen
von Phoma lingam kann mit einem Verfahren durchgeführt werden, bei dem man
aus Phoma lingam isolierte DNA mit Primern der Oligonukleotid-Sequenzen
5′-ACGGTCTTGG-3′,
5′-GAAACAGCGG-3′ oder
5′-GGAGCCCAC-3′,
5′-GAAACAGCGG-3′ oder
5′-GGAGCCCAC-3′,
unter den unten beschriebenen Bedingungen, bei einem Temperaturprofil von
20 Sekunden bei 93°C
60 Sekunden bei 32°C
20 Sekunden bei 72°C
60 Sekunden bei 32°C
20 Sekunden bei 72°C
reagieren läßt und das so erhaltene Reaktionsprodukt nach gängigen Elektrophoreseverfahren
auftrennt.
In Fig. 1, Fig. 2 und Fig. 3 bedeuten:
Spur 1-6 und 18 = aggressive Pathotypen von Phoma lingam
Spur 7-17 = nicht-aggressive Pathotypen von Phoma lingam
M 1, M 2 = Molekulargewichtsstandards
bp = Basenpaare
Spur 1-6 und 18 = aggressive Pathotypen von Phoma lingam
Spur 7-17 = nicht-aggressive Pathotypen von Phoma lingam
M 1, M 2 = Molekulargewichtsstandards
bp = Basenpaare
Zum besseren Verständnis der dieser Erfindung zugrundeliegenden Ausführungsbeispiele
wird vorab eine Aufstellung aller für diese Versuche notwendigen
und an sich bekannten Verfahren gegeben.
Die als Zufallsprimer verwendeten Oligonukleotide wurden mit einem Synthese-Automaten
mit Hilfe der üblichen Phsophoamidit-Derivate der benötigten
Nukleotide hergestellt (Beaucage und Caruthers, 1981, Tetrahedron Lett.,
22, 1959)
Phoma lingam Isolate wurden auf festem Medium angezogen, das 20% (V/V) Gemüsesaft,
3 g/l Calciumcarbonat und 12 g/l Agar enthielt. Die optimale
Wachstumstemperatur betrug 20°C. Für Flüssigkulturen wurde YMPG-Medium
verwendet, das pro Liter 3 g Hefeextrakt, 3 g Malzextrakt, 5 g Pepton und 10 g
Glucose enthielt. Alle Medien wurden durch Autoklavieren bei 121°C für 20
Minuten sterilisiert. Die Flüssigkulturen wurden in 100 ml Erlenmeyer-Kolben
mit 20 ml Medium mit Myzelstückchen beimpft und bei 20°C und 120
Schüttelbewegungen pro Minute angezogen.
Das Myzel wurde direkt für die verschiedenen DNA-Präparationen eingesetzt.
Nachfolgend werden drei mögliche Methoden zur DNA-Präparation aus Phoma
lingam beschrieben:
- a) Nach Filtration durch einen Büchner-Trichter wurde das Myzel zweimal mit eiskaltem 10 mM Tris/HCl (pH 8,0), 10 mM Natriumchlorid, 1 mM EDTA (Ethylendiamintetraessigsäure) gewaschen und mit Hilfe eines Ultraturrex-Mixers in flüssigem Stickstoff aufgeschlossen. Das entstehende Pulver wurde mehrere Stunden in 10 ml Puffer, enthaltend 0,15 M EDTA, 0,05 M Tris/HCl (pH 8,0), 0,02 M Natriumchlorid, 1% Natriumdodecylsulfat und 100 µg/ml Proteinase K, bei 37°C inkubiert. Die Lösung wurde anschließend mit festem Kochsalz auf eine Konzentration von 1 Mol/l eingestellt, für 30 Minuten auf Eis gehalten und für 10 Minuten bei 4°C und 5000 g abzentrifugiert. Der Überstand wurde mit Polyethylenglykol 6000 auf 10% eingestellt und erneut für eine Stunde auf Eis gehalten. Nach Abzentrifugieren bei 4°C und ca. 10 000 g befand sich die DNA im Niederschlag. Dieser wurde in 10 ml Tris-Puffer (1% iso-Octylphenoxypolyethoxyethanol 25 mM Tris/HCl (pH 8,0), 5 mM EDTA und 10 mM Natriumchlorid) aufgenommen, mit 9,5 g g Cäsiumchlorid und 1,5 mg Ethidiumbromid versetzt und für 20 Stunden in einem Vertikalrotor bei 20°C und 40 000 rpm zentrifugiert. Die DNA-Bande wurde unter Beleuchtung mit langwelligem UV-Licht mit einer Kanüle abgezogen, durch mehrmaliges Ausschütteln mit Natriumchlorid gesättigtem Isopropanol vom Ethidiumbromid befreit und schließlich dreimal gegen Tris-Puffer (10 mM Tris/HCl (pH 8,0), 0,1 mM EDTA) dialysiert.
- b) Das Myzel (ca. 100 mg) wurde im Mörser unter flüssigem Stickstoff homogenisiert und in einer Lösung, die 1% Natriumdodecylsulfat und 10 mM EDTA enthielt, zu einem Volumen von 1,2 ml aufgenommen. Nach Zugabe von 70 mg Natriumchlorid wurde die Lösung 30 Minuten auf Eis gehalten und 10 Minuten in einer Mikrozentrifuge abzentrifugiert. 1 ml vom Überstand wurde in ein Reaktionsgefäß überführt. Die DNA wurde nach Zugabe von 100 mg Polyethylenglykol 6000 und Inkubation für eine Stunde auf Eis gefällt. Die DNA wurde 10 Minuten in einer Mikrozentrifuge abzentrifugiert, der Überstand verworfen und der Niederschlag in 90 µl TE-Puffer (0,1 mM EDTA, 10 mM Tris/HCl, pH 0,8) aufgenommen, auf 0,4 M Lithiumchlorid eingestellt und mit 100 µl Isopropanol versetzt. Nach 30 Minuten auf Eis wurde die DNA für 10 Minuten abzentrifugiert, zweimal mit 1 ml eiskaltem 70%igem Ethanol gewaschen, im Wasserstrahlpumpenvakuum getrocknet und in 50 µl TE-Puffer aufgenommen.
- c) Das Myzel (ca. 100 mg) wurde im Mörser unter flüssigem Stickstoff homogenisiert und in 4 ml des auf 60°C vorgewärmten Puffers gegeben, der 2% Cetyltrimethylammoniumbromid (CTAB), 100 mM Tris/HCl (pH 8,0), 20 mM EDTA, 1,4 M Natriumchlorid und 0,2% β-Mercaptoethanol enthielt. Das Gemisch wurde für 30 Minuten unter gelegentlichem Schütteln bei 60°C gehalten, einmal mit einem Volumen Chloroform extrahiert und bei Raumtemperatur und ca. 5000 g zentrifugiert. Die obere wäßrige Phase wurde in ein neues Glasröhrchen überführt, mit 1/10 Volumen 3M Natriumacetat (pH 7,0) und einem Volumen vorgekühltem Isopropanol versetzt. Nach 20 Minuten im Eisbad wurde die DNA für 20 Minuten bei 10 000 g in der Kühlzentrifuge sedimentiert. Der Niederschlag wurde einmal mit 4 ml 70%igem Ethanol gewaschen, im Wasserstrahlpumpenvakuum getrocknet und zuletzt in 50 µl TE-Puffer gelöst.
Die folgenden Ausführungsbeispiele erläutern die Herstellung der erfindungsgemäßen
Oligonukleotid-Sequenzen, die als Primer zur eindeutigen Differenzierung
aggressiver und nicht-aggressiver Pathotypen von Phoma lingam
benötigt werden sowie die Durchführung der Polymerase-Kettenreaktion mit
diesen Primern und die anschließende Elektrophorese.
Die nach den oben beschriebenen Isolierungen erhaltene Phoma lingam DNA
wurde wie folgt inkubiert:
In Puffer (10 mM Tris/HCl, 1,5 mH Magnesiumchlorid, 50 mM Kaliumchlorid,
0,1 mg/ml Gelatine) wurden ca. 25 ng der Phoma lingam DNA mit
40 ng eines Primers
3 mG Magnesiumacetat
0,2 mM Desoxynukleotide (dATP, dCTP, dGTP, dTTP) und
2,5 Einheiten-Tag-DNA Polymerase
3 mG Magnesiumacetat
0,2 mM Desoxynukleotide (dATP, dCTP, dGTP, dTTP) und
2,5 Einheiten-Tag-DNA Polymerase
gegeben und gemischt. Der Reaktionsansatz wurde anschließend mit 50 µl
flüssigem Paraffin überschichtet und in einem Thermocycler (programmierbarer
Heizblock) bei folgendem optimalem Temperaturprofil inkubiert:
20 Sekunden bei 93°C
60 Sekunden bei 32°C
20 Sekunden bei 72°C
60 Sekunden bei 32°C
20 Sekunden bei 72°C
Damit die DNA um ein Vielfaches amplifiziert werden kann, wurde dieser
Vorgang insgesamt 35mal wiederholt.
Zum Nachweis der Wirksamkeit der erfindungsgemäßen Primer wurde anschließend
eine Elektrophorese durchgeführt. Hierzu wurden die bei der Inkubation
entstandenen amplifizierten DNA-Fragmente mit 7 µl einer Lösung, die 0,025%
Bromphenolblau, 0,025% Xylencyanol in 50% Glycerin und 10 mM EDTA enthielt,
versetzt und in Agarosegelen elektrophoretisch aufgetrennt. Die Agarosegele
enthielten 1,2% Agarose in 89 mM Tris/Borat-Puffer (pH 8,0), mit
2 mM EDTA. Die Gelgröße betrug 15 × 20 cm. Die Trennungen wurden bei einer
Spannung von 70 V durchgeführt. Die DNA-Fragmente wurden durch Anfärben in
0,5 µg/ml Ethidiumbromid sichtbar gemacht und auf einem UV-Tansilluminator
(254 nm) mit einer Polaroid-Kamera photographiert.
Die Elektrophorese-Gele zeigen die Moleküllängen bzw. die Bandenpositionen
der DNA-Fragmente aggressiver und nicht-aggressiver Pathotypen nach der
Trennung.
Das Elektrophorese-Muster, das bei der Verwendung der erfindungsgemäßen
Primer entsteht, ist wie folgt dargestellt:
Fig. 1 Primer: 5′-ACGGTCTTGG-3′
Fig. 2 Primer: 5′-GAAACAGCGG-3′
Fig. 3 Primer: 5′-GGAGCCCAC-3′
Fig. 2 Primer: 5′-GAAACAGCGG-3′
Fig. 3 Primer: 5′-GGAGCCCAC-3′
Auf den Elektrophoresegelen ist zu erkennen, daß die Primer der Sequenz
ACGGTCTTGG und GAAACAGCGG auch gemeinsame Banden bei aggressiven und
nicht-aggressiven Pathotypen erzeugen.
Der Primer der Sequenz GGAGCCCAC erzeugt ausschließlich differenzierende
Banden.
Die Ergebnisse der Elektrophorese sind in der Tabelle 1 dargestellt.
Claims (5)
1. Oligonukleotid-Sequenzen als Primer zur eindeutigen Differenzierung
aggressiver und nicht-aggressiver Pathotypen von Phoma lingam (Leptosphaeria
maculans), dadurch gekennzeichnet, daß die Primer eine sichere
Unterscheidung aggressiver und nicht-aggressiver Pathotypen von Phoma
lingam in sehr frühen Stadien des Befalls, in kurzer Zeit und mit wenig
Aufwand ermöglichen.
2. Primer gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß sie zwischen 8 und
11 Nukleotide enthalten.
3. Primer gemäß den Ansprüchen 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß es sich
um die Oligonukleotid-Sequenzen
5′-ACGGTCTTGG-3′,
5′-GAAACAGCGG-3′ und 5′-GGAGCCCAC-3′
handelt.
5′-GAAACAGCGG-3′ und 5′-GGAGCCCAC-3′
handelt.
4. Verfahren zur eindeutigen Differenzierung aggressiver und nicht-aggressiver
Pathotypen von Phoma lingam in sehr frühen Stadien des Befalls,
dadurch gekennzeichnet, daß man aus Phoma lingam isolierte DNA mit Primern
der Oligonukleotid-Sequenzen,
5′-ACGGTCTTGG-3′,
5′-GAAACAGCGG-3′ oder
5′-GGAGCCCAC-3′
bei einem Temperaturprofil von
20 Sekunden bei 93°C
60 Sekunden bei 32°C
20 Sekunden bei 72°C
reagieren läßt und das so erhaltene Reaktionsprodukt nach gängigen Elektrophoreseverfahren auftrennt.
5′-ACGGTCTTGG-3′,
5′-GAAACAGCGG-3′ oder
5′-GGAGCCCAC-3′
bei einem Temperaturprofil von
20 Sekunden bei 93°C
60 Sekunden bei 32°C
20 Sekunden bei 72°C
reagieren läßt und das so erhaltene Reaktionsprodukt nach gängigen Elektrophoreseverfahren auftrennt.
5. Verwendung von Oligonukleotid-Sequenzen gemäß den Ansprüchen 1-3, als
Primer zur voraussetzungsfreien und schnellen Differenzierung aggressiver
und nicht-aggressiver Pathotypen von Phoma lingam (Leptosphaeria
maculans).
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE4127862A DE4127862A1 (de) | 1991-08-21 | 1991-08-21 | Oligonukleotid-sequenzen als primer zur differenzierung aggressiver und nicht-aggressiver pathotypen von phoma lingam und ein verfahren zur differenzierung |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE4127862A DE4127862A1 (de) | 1991-08-21 | 1991-08-21 | Oligonukleotid-sequenzen als primer zur differenzierung aggressiver und nicht-aggressiver pathotypen von phoma lingam und ein verfahren zur differenzierung |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| DE4127862A1 true DE4127862A1 (de) | 1993-02-25 |
Family
ID=6438888
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| DE4127862A Withdrawn DE4127862A1 (de) | 1991-08-21 | 1991-08-21 | Oligonukleotid-sequenzen als primer zur differenzierung aggressiver und nicht-aggressiver pathotypen von phoma lingam und ein verfahren zur differenzierung |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| DE (1) | DE4127862A1 (de) |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1994021788A2 (en) * | 1993-03-22 | 1994-09-29 | National Research Council Of Canada | Testing for infestation of rapeseed and other cruciferae by the fungus leptosphaeria maculans (blackleg infestation) |
| EP0647718A1 (de) * | 1992-03-20 | 1995-04-12 | Minister For Agriculture Fisheries And Food In Her Britannic Majesty's Gov. Of The U.K. Of Great Britain And Northern Ireland | Genetischer Fingerabdruck von Hefen |
| CN103131778A (zh) * | 2013-02-05 | 2013-06-05 | 内蒙古农牧业科学院 | 一种油菜种子携带油菜黑胫病病原菌的分子检测方法 |
| CN103255207A (zh) * | 2013-01-15 | 2013-08-21 | 内蒙古农牧业科学院 | 一种油菜种子携带油菜黑胫病病原菌的分子检测方法 |
-
1991
- 1991-08-21 DE DE4127862A patent/DE4127862A1/de not_active Withdrawn
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| WO1994021788A3 (en) * | 1993-03-22 | 1994-12-22 | Ca Nat Research Council | Testing for infestation of rapeseed and other cruciferae by the fungus leptosphaeria maculans (blackleg infestation) |
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