DE19530332C2

DE19530332C2 - Extraktion von Pilzzellen-DNA sowie Verfahren zum Nachweisen von Pilzzellen in klinischem Material

Info

Publication number: DE19530332C2
Application number: DE19530332A
Authority: DE
Inventors: Hermann Dr Einsele
Original assignee: Eberhard Karls Universitaet Tuebingen
Current assignee: Myconostica Ltd
Priority date: 1995-08-17
Filing date: 1995-08-17
Publication date: 1998-07-02
Anticipated expiration: 2015-08-18
Also published as: DE19530332A1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zum Extrahieren von Pilz-DNA aus Vollblut, mit den Schritten:

a) Isolation überwiegend intakter Pilzzellen aus dem Vollblut,
b) Extrahieren von DNA aus den isolierten Pilzzellen durch
b1) Aufschließen der isolierten Pilzzellen, und
b2) Isolation der Pilz-DNA.

Ein derartiges Verfahren ist in der WO 93/23568 beschrieben.

Die vorliegende Erfindung steht allgemein im Zusammenhang mit einem Verfahren zum Nachweisen von Pilzzellen in klinischem Material.

Derartige Verfahren sind außerdem aus der Praxis bekannt, sie beruhen standardmäßig auf einer Anzüchtung von Pilzspezies aus klinischem Material auf entsprechenden Nährmedien.

Durch diese Anzüchtung z. B. in Petrischalen und den Nachweis anhand der gewachsenen oder auch nicht gewachsenen Kolonien sind die Nachweisgeschwindigkeit sowie -empfindlichkeit insbe sondere wegen des langsamen Wachstumes der Pilzspezies stark beeinträchtigt. Die Diagnose der invasiven Pilzinfektion wird daher häufig erst durch eine äußerst komplikationsträchtige Biopsie eines Organes oder sogar erst nach dem Tod des Patienten gestellt.

Das Interesse an Verfahren zum Nachweisen von Pilzzellen ist vor dem Hintergrund zu sehen, daß insbesondere in den letzten Jahren Pilzspezies als bedeutende nosokomiale Pathogene eine erhebliche Bedeutung für immunsupprimierte Patienten erlangt haben. Vor allem nach Knochenmarkstransplantationen (KMT) aber auch nach Leber-, Nieren-, Pankreas-, Herz- und Herz-Lungen-Trans plantationen haben invasive Pilzinfektionen erheblich zugenommen. So ist es z. B. im Jahr 1994 vor allem in französi schen KMT-Zentren zu einer solchen Häufung vor allem von Aspergillusinfektionen gekommen, daß diese Zentren mehrere Monate geschlossen werden mußten.

Neben den organtransplantierten Patienten sind aber auch Patienten mit Krebserkrankung, vor allem nach Chemotherapie oder chirurgischen Eingriffen, Verbrennungspatienten sowie Patienten auf chirurgischen und neonatalen Intensivstationen zunehmend von invasiven Pilzinfektionen betroffen. Sobald es bei diesen Patientenkollektiven zu einer Beteiligung eines Organsystemes oder gar mehrerer Organsysteme kommt, beträgt die Sterblichkeit an dieser infektiösen Komplikation zwischen 80 und 100%.

Nur durch eine frühzeitige Diagnose kann hier der Behandlungs erfolg verbessert werden. Wegen der mit den eingangs erwähnten Standardnachweisverfahren verbundenen Nachteile werden intensive Bemühungen unternommen, eine frühzeitige Sicherung der Diagnose einer systemischen Pilzinfektion zu ermöglichen.

Neue, auf molekularbiologischen Verfahren beruhende Techniken haben zwar bei einer Reihe von anderen Erregern bereits eine sensitivere Diagnostik und damit teilweise auch ein früh zeitigeres Erkennen und Behandeln der Infektionserkrankungen ermöglicht, bei Pilzinfektionen war dies bisher jedoch noch nicht möglich.

Aus der Veröffentlichung "Detection of various fungal pathogenes in blood samples" in: EBMT 1995, Vol. 15, Suppl. 2, März 1995, Abstract Book, Abstract 432, S. 103, ist es jedoch bereits bekannt, ein DNA-Segment eines Pilz-Genes mittels des PCR-Ver fahrens zu amplifizieren, um eine Vielzahl von Pilz-Pathogenen im Blut zu identifizieren. Durch zusätzliche Hybridisierung mit speziesspezifischen Oligonukleotiden konnten ferner verschiedene Pilzspezies voneinander unterschieden werden.

Die wesentlichen Probleme des Nachweises von Pilzinfektionen mit Hilfe molekularbiologischer Techniken sind dabei auf die sehr komplexe Zusammensetzung der Pilzzellenwand zurückzuführen, die bisher zeitaufwendige aber auch teure Extraktionsverfahren erforderlich machen.

Ein weiteres Problem besteht darin, daß eine zunehmende Zahl von Pilzspezies bei den immunsupprimierten Patienten bedrohliche Infektionen auslösen kann, woraus die Notwendigkeit resultiert, eine Fülle von verschiedenen Pilzgattungen und -stämmen bei diesen Patienten erfassen und bestimmen zu müssen. Da sich die Therapie der Infektionen bei verschiedenen Pilzspezies nämlich unterscheidet, ist es folglich erforderlich, nicht nur alle Pilzspezies erfassen, sondern diese auch differenzieren und identifizieren zu können.

In der Veröffentlichung von Niesters et al. (1993) "Rapid, polymerase chain reaction-based identification assays for Candida species", Journal of Clinical Microbiology, Seiten 904-910 wird ein molekularbiologisches Verfahren beschrieben, das auf Analyse Pilz-spezifischer DNA beruht. In diesem Verfahren wird zunächst ein Pilz-spezifisches Gen, das Gen für die 18ssu rRNA, in einer Polymerase-Kettenreaktion amplifiziert. Aus diesem Gen werden danach spezifische Bereiche in einer zweiten Polymerase-Ketten reaktion reamplifiziert. Die Reamplifikate werden mit Hilfe verschiedener molekularbiologischer Techniken analysiert. Dieses Verfahren erlaubt es, Pilzinfektionen mit vier verschiedenen Candida-Spezies zu diagnostizieren.

Dieses Verfahren hat den Nachteil, daß zwei Polymerase-Ketten reaktion-Reaktionen nacheinander durchgeführt werden müssen, wodurch das Verfahren zeit- und kostenintensiv wird. Darüber hinaus ist es mit dem in dieser Veröffentlichung beschriebenen Verfahren nicht möglich, Candida-Spezies von den klinisch immer wichtiger werdenden Aspergillus-Spezies zu unterscheiden.

Ein weiteres Verfahren zum Nachweis und zur Differenzierung pathogener Pilzspezies in klinischem Material ist aus der eingangs genannten WO 93/23568 bekannt. In diesem Verfahren werden Pilzzellen aus Patientenblut isoliert, wobei die Pilz zellen zuerst von dem übrigen Blutmaterial abgetrennt werden. Danach wird die Pilzzellwand aufgebrochen und die Pilz-DNA isoliert. Daraus wird dann ein Segment aus dem 5S rRNA-Gen in einer Polymerase-Kettenreaktion amplifiziert und mit verschie denen Methoden nachgewiesen. Anhand der isolierten DNA können außerdem verschiedene Pilzspezies voneinander unterschieden werden.

Bei diesem Verfahren werden nur die frei im Blut befindlichen Pilzzellen erfaßt. Pilzzellen werden jedoch auch von speziali sierten Blutzellen, den Phagozyten oder Makrophagen, aufgenommen.

Dieser Schritt ist charakteristisch für Frühstadien einer Pilzinfektion, noch bevor sich die Pilzzellen massenhaft in dem Blut vermehren konnten.

In dem in der WO 93/23568 beschriebenen Verfahren können außerdem ausschließlich Infektionen mit Hefespezies nachgewiesen werden. Weitere pathogene Pilzspezies sind hier nicht nachweisbar, weil die Schritte zur Zellwandlyse nur dazu geeignet sind, Hefe zellwände aufzubrechen.

Vor diesem Hintergrund ist es Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren zur Extraktion von Pilz-DNA aus klinischem Material dahingehend weiterzubilden, daß eine frühzeitige Diagnose einer Pilzinfektion möglich wird.

Das Verfahren der Extraktion von Pilz-DNA soll dabei insbesondere für die Diagnostik auch bei sehr geringen Mengen von Pilzen in dem vorliegenden Vollblut noch zuverlässig Pilz-DNA extra hieren können. Ferner soll dieser Verfahrensschnitt schnell und so einfach durchgeführt werden, daß er auch im Klinikalltag und ggf. von angelerntem Personal angewendet werden kann.

Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß durch ein Verfahren zum Extrahieren von Pilz-DNA aus Vollblut der eingangs genannten Art gelöst, das die Schritte umfaßt:

a1) Aufschließen der im Vollblut befindlichen Blut zellen, und
a2) Isolation überwiegend intakter Pilzzellen von zellulärer DNA.

Dieses Verfahren ist vorzugsweise im Zusammenhang mit einem Verfahren durchzuführen, in dem die extrahierte Pilz-DNA nachgewiesen und die Pilzspezies aus der extrahierten DNA bestimmt wird.

Die der Erfindung zugrundeliegende Aufgabe wird auf diese Weise vollkommen gelöst. Durch den effizienten Zugriff auf die Pilz-DNA selbst wird nämlich ein Verfahren geschaffen, das bei hoher Sensitivität über den Nachweis von pilzspezifischer DNA den sehr frühen Nachweis von Pilzinfektionen ermöglicht. Dabei ist darauf zu achten, daß die Freisetzung und Reinigung der Pilz-DNA nicht nur rasch, sondern auch nahezu vollständig und relativ rein erfolgen muß, um eine hohe Sensitivität zu gewährleisten und eine schnelle Diagnose zu ermöglichen.

Bei den einzelnen Schritten des neuen Verfahrens waren viele Probleme zu überwinden, die sich vor allem aus der Zusammen setzung der Pilzzellenwand und aus der Tatsache ergaben, daß ein Großteil der Pilzzellen sich nicht im Vollblut frei in Lösung sondern nach Phagozytose in verschiedenen Blutzellpopulationen befindet, vor allem in Granulozyten und Makrophagen.

Das Verfahren zur Extraktion von Pilz-DNA aus Vollblut wird zwar vorteilhaft in der Diagnostik eingesetzt, um eine Pilz infektion bei einem Patienten nachweisen zu können, es findet aber auch dort Anwendung, wo Pilz-DNA für anderweitige Weiter verarbeitung benötigt wird.

Mit dem neuen Verfahren kann dafür z. B. Pilz-DNA aus dem Blut von Tieren gewonnen werden, die speziell mit den interessierenden Pilzspezies infiziert wurden. Aus der so gewonnenen Pilz-DNA können z. B. DNA-Sonden herausgeschnitten werden, die für Nachweisreaktionen verwendet oder in Plasmide eingebaut werden können. Es sind dabei Anwendungen im ganzen Bereich der Grund lagenforschung, Diagnostik, Therapeutik, industriellen Gentech nologie etc. denkbar.

Das neue Verfahren besteht aus zwei Stufen, wobei in der ersten Stufe Pilzzellen aus dem Vollblut isoliert werden und dann in der zweiten Stufe die DNA aus diesen isolierten Pilzzellen extrahiert wird, um mit Hilfe dieser extrahierten DNA dann Pilzinfektionen nachweisen und ggf. spezifizieren zu können. Dieses zweistufige Verfahren erhöht vor allem die Spezifität, da ggf. störende, anderweitige DNA in dem zweiten Verfahrens schritt nur noch in geringem Maße vorhanden ist.

Durch das Aufschließen der im Vollblut befindlichen Blutzellen, die Isolation überwiegend intakter Pilzzellen von zellulärer DNA, das Aufschließen der isolierten Pilzzellen und die Isolation der Pilz-DNA wird eine sehr schnelle und sichere Trennung der Pilz-DNA von zellulärer DNA erreicht. Durch den Aufschluß der im Vollblut befindlichen Blutzellen wird nämlich in dieser Ausgangslösung die zelluläre DNA freigesetzt, woraufhin dann die durch das bisherige Aufschlußverfahren noch nicht oder zumindest noch nicht vollständig aufgeschlossenen Pilzzellen durch schnelle und einfache Verfahren, wie z. B. eine Zentri fugation von der freien zellulären DNA getrennt werden können. Bei dem daraufhin folgenden Aufschließen der so isolierten Pilzzellen kann mit großer Sicherheit davon ausgegangen werden, daß sich keine oder nur noch unerhebliche Mengen an zellulärer DNA in der Lösung befindet. Das im Schritt a1) durchzuführende Aufschließen der Blutzellen muß folglich so erfolgen, daß die Pilzzellen noch nicht lysiert werden. Da die Pilzzellwand deutlich komplexer ist als die Zellwand von Blutzellen, kann dies durch geeignete vorsichtige Aufschlußverfahren sicherge stellt werden.

Der Verfahrensschritt a1) hat jedoch noch einen weiteren Vorteil, durch ihn werden nämlich ggf. phagozytierte Pilzzellen wieder freigesetzt, so daß insbesondere für die Diagnostik auch noch sehr geringe Mengen von Pilzen in dem vorliegenden Vollblut extrahiert werden können. Bei dem neuen Verfahren ist es nämlich nicht mehr erforderlich, daß zumindest einige Pilzzellen in dem Vollblut frei in Lösung sind, es reicht völlig aus, wenn einige wenige Pilzzellen nach Phagozytose z. B. in Granulozyten oder Makrophagen vorliegen.

Dabei ist es insbesondere bevorzugt, wenn im Schritt a) folgende Schritte durchgeführt werden:

a1.1) Lysis der roten Blutkörperchen durch osmotische Hämolyse;
a1.2) enzymatisches Aufschließen der weißen Blutkörperchen; und
a2.1) Zentrifugation des so behandelten Vollblutes und Verwendung des Pellet in den nächsten Verfahrens schritten.

Hier ist von Vorteil, daß in den Schritten a1.1) und a1.2) zwar zuverlässig die Blutzellen aufgeschlossen werden, die Pilzzellen selbst jedoch noch nicht beschädigt sind. Durch die folgende Zentrifugation ist dann eine sehr sichere Trennung zwischen der inzwischen freigesetzten zellulären DNA der Blutzellen und Zellbruchstücken der Blutzellen einerseits sowie noch überwiegend intakten Pilzzellen andererseits möglich. Auf diese Weise wird außerdem sichergestellt, daß keine Pilz-DNA verlorengeht, da diese noch in den im Pellet zu findenden Pilzzellen vorhanden ist. Zusammengefaßt liegen die Vorteile der obigen Schritte also darin, daß zum einen auch geringste Konzentrationen von Pilzzellen erfaßt werden und daß zum anderen die isolierte Pilz-DNA allenfalls gering mit zellulärer DNA verunreinigt ist, so daß eine hohe Sensitivität und Spezifität bei den nachfolgenden diagnostischen Schritten möglich ist, da das Verhältnis von Pilz- zu zellulärer DNA zugunsten der Pilz-DNA deutlich ver bessert wurde.

Weiterhin ist es bevorzugt, wenn im Schritt a1.1) die Lysis der roten Blutkörperchen mit Hilfe einer hypotonen Lösung erfolgt, vorzugsweise mit einer Endkonzentration von ca. 10 mM Tris pH 7,6, 5 mM MgCl₂ und 10 mM NaCl, und wenn im Schritt a1.2) das enzymatische Aufschließen der weißen Blutkörperchen in einer Lösung mit einer Endkonzentration von 200 µg/ml Proteinase K, 10 mM Tris pH 7,6, 10 mM EDTA pH 8,0, 50 mM Nacl und 0,2% SDS erfolgt.

In einer Weiterbildung wird die Lösung aus Schritt a1.2) für 100-140 min, vorzugsweise 120 min bei 60-70°C, vorzugsweise bei 65°C inkubiert.

Es wurde gefunden, daß auf diese Weise die Blutzellen zuverlässig und vollständig aufgeschlossen werden können, wobei eine Beschädigung der Pilzzellen vermieden wird, so daß nach diesen Verfahrensschritten sowohl die in dem Ausgangsblut frei in Lösung befindlichen als auch die phagozytierten Pilzzellen relativ unbeschädigt vorliegen und abzentrifugiert werden können, ohne ihre DNA dabei zu verlieren.

In einer Weiterbildung ist es dann bevorzugt, wenn der Schritt b1) folgenden Schritt umfaßt:

b1.1) alkalisches Lysieren und enzymatische Behandlung der Pilzzellen.

Es hat sich herausgestellt, daß durch diese einfachen Verfahrens schritte ein sicheres Aufschließen der Pilzzellen möglich ist, die aus dem Pellet des Verfahrensschrittes a2.1) wieder aufgenom men wurden.

Ferner ist es bevorzugt, wenn der Schritt b1.1) die folgenden Schritte umfaßt:

- Inkubieren der im Pellet aus Schritt a2.1) befindlichen Pilzzellen bei 90-95°C, vorzugsweise 95°C für 5-15 min, vorzugsweise 10 min, in einer Lösung mit 50 mM NaOH,
- Neutralisation mit 1 M Tris-HCl pH 7,0.

Vorteilhafterweise erfolgt dann eine enzymatische Behandlung mit Zymolyase für 50-70 min, vorzugsweise 60 min bei 30-40°C, vorzugsweise 37°C sowie eine Proteindenaturierung durch Inku bation mit Tris/EDTA bei 60-70°C, vorzugsweise 65°C, für 10-30 min, vorzugsweise 20 min.

Es wurde gefunden, daß durch diese Verfahrensschritte ein sicheres Aufschließen der Pilzzellen mit daraufhin erfolgender vollständiger Freigabe der Pilz-DNA möglich ist, so daß die Pilz-DNA nunmehr frei in Lösung ist und von den Zellbruchstücken der Pilzzellen isoliert werden kann.

Dabei ist es bevorzugt, wenn in diesem Zusammenhang der Schritt b2) folgende Schritte umfaßt:

- Proteinpräzipitation mit 5 N Kaliumazetat, und
- DNA-Präzipitation des Überstandes in eiskaltem Isopropanol.

Diese Verfahrensschritte sind sehr einfach durchzuführen, zunächst wird durch Zugabe von Kaliumazetat das Protein heraus gefällt, dann der Überstand abgenommen und mit eiskaltem Isopropanol versetzt, so daß die DNA ausfällt. Diese ausgefallene DNA kann dann für die weiteren Verfahrensschritte herangezogen werden, also zum Nachweis und zur Identifizierung einer Pilz infektion dienen.

Bei dem insoweit beschriebenen Verfahren ist also zusammengefaßt als erstes von Vorteil, daß die Pilzspezies sozusagen an Hand ihrer DNA allgemein nachgewiesen und dann speziell identifiziert werden. Die Pilz-DNA wird dabei nicht direkt aus dem Vollblut extrahiert, sondern zunächst erfolgt eine Trennung der Pilzzellen von zellulärer DNA, um die Sensitivität und Spezifität des Nachweises zu erhöhen. Mit anderen Worten, wenn nur sehr wenige Pilzzellen in dem Vollblut vorhanden sind, so könnte die daraus extrahierte sehr geringe Pilz-DNA-Menge ggf. vor dem Hintergrund der in sehr hoher Konzentration vorliegenden zellulären DNA nicht nachgewiesen werden, so daß die erwähnte Trennung hier große Vorteile bezüglich der Sensitivität bringt.

Ein weiterer Vorteil bei dem neuen Verfahren liegt darin, daß auch phagozytierte Pilzzellen für den Nachweis zur Verfügung stehen, da zunächst die Blutzellen des Vollblutes aufgeschlossen werden, ohne daß dabei die Pilzzellen, seien sie frei in Lösung oder in phagozytiertem Zustand, beschädigt werden. Erst nach Abtrennung der Pilzzellen von der zellulären DNA und den verbleibenden Zelltrümmern der Blutzellen werden dann die Pilzzellen aufgeschlossen. Das hierzu verwendete Verfahren ist in der Lage, trotz der sehr komplexen Pilzzellwände für einen vollständigen Aufschluß zu sorgen, ohne daß dabei die Pilz-DNA zerstört wird.

Gegenstand der vorliegenden Anmeldung ist ebenfalls ein Kit zur Durchführung des oben beschriebenen Verfahrens. Ein der artiges Kit kann eine Zusammenstellung sämtlicher Stammlösungen enthalten, wie sie für die genannten Verfahrensschritte im einzelnen benötigt werden.

Die Ausgestaltung und Weiterbildung des zweiten Verfahrens schrittes, nämlich des Nachweisens der extrahierten Pilz-DNA, ist Gegenstand der zeitgleich eingereichten, parallelen deutschen Patentanmeldung DE 195 30 333.4 mit dem Titel "Amplifikation von Pilzzellen-DNA".

Gemäß dieser Anmeldung sind dabei folgende Schritte bevorzugt:
Amplifikation zumindest eines Segmentes der isolierten Pilz-DNA; und
Nachweis der Amplifikationsprodukte.

Die Amplifikation kann dabei mittels PCR, Klonierung, DNA-abhängigen DNA-Polymerasen etc. erfolgen, wobei der Nachweis über Gelelektrophorese, optische Dichte, Anfärben mit spezifisch an Nukleinsäure bindenden Markern etc. erfolgen kann.

In einer Weiterbildung erfolgt die Amplifikation dann mittels PCR unter Verwendung von zwei Primern, die für eine Vielzahl von verschiedenen Pilz-DNA verwendbar sind. Die Primer sind als SEQ ID-No: 1 und SEQ ID-No: 2 im Sequenzprotokoll angegeben. Auf diese Weise ergibt sich ein identisches Nachweisverfahren für alle vorkommende Pilz-DNA, da gefunden wurde, daß die beiden Primersequenzen in dem PCR-Schritt für alle interessierenden Pilzspezies Verstärkungsprodukte mit einer Länge von ca. 500 Basen erzeugen, die auf einem Agarosegel durch Anfärben mit Ethidiumbromid nachgewiesen werden können.

Hierdurch wird auf einfache Weise DNA in ausreichender Menge erzeugt, die dann auch verwendet werden kann, um die betreffenden Pilzspezies zu identifizieren.

Die Ausgestaltung und Weiterbildung des dritten Verfahrens schrittes, nämlich des Bestimmens der Pilzspezies aus der nachgewiesenen Pilz-DNA, ist Gegenstand der zeitgleich eingereichten, parallelen deutschen Patentanmeldung DE 195 30 336.9 mit dem Titel "Sequentielle Hybridisierung von Pilzzellen-DNA".

Bezüglich der Bestimmung der spezifischen Pilzspezies aus der nachgewiesenen Pilz-DNA ist es gemäß dieser Anmeldung bevorzugt, wenn für die jeweilige Pilzspezies kennzeichnende Sequenz abschnitte bestimmt werden. Dies kann entweder durch zumindest teilweises Sequenzieren der Amplifikationsprodukte, durch Untersuchung des Schmelzverhaltens der erzeugten Doppelstränge oder auf andere Weise erfolgen.

Besonders bevorzugt ist es jedoch, wenn die Bestimmung der Sequenzabschnitte durch sequentielles Hybridisieren des Amplicons mit für die jeweiligen Pilzspezies spezifischen DNA-Sonden erfolgt, wobei der Nachweis der erfolgten Hybridisierung dann zur Identifizierung der Pilzspezies führt. Die DNA-Sonden sind für verschiedene Pilzstämme und -spezies im Sequenzprotokoll als SEQ ID-No: 3 bis SEQ ID-No: 8 angegeben.

Weitere Vorteile ergeben sich aus der nachstehenden Beschreibung.

Es versteht sich, daß die vorstehend genannten und die nach stehend noch zu erläuternden Merkmale nicht nur in den jeweils angegebenen Kombinationen, sondern auch in anderen Kombinationen oder in Alleinstellung verwendbar sind, ohne den Rahmen der vorliegenden Erfindung zu verlassen.

Beispiele für die Durchführung der einzelnen Verfahrensschritte sowie die Anwendung des Verfahrens im Rahmen eines klinischen Untersuchungsprogrammes sind in der folgenden Beschreibung angegeben.

Ein besonderer Vorteil des neuen Verfahrens liegt darin, daß es mit Vollblut durchgeführt wird, daß also z. B. keine Biopsie erforderlich ist oder noch herzustellendes Serum verwendet wird. Mit dem Vollblut wird zunächst eine Trennung der Pilzzellen von zellulärer DNA vorgenommen. Dies ist erforderlich, damit die ggf. nur in geringer Menge vorliegende Pilz-DNA nicht vor dem Hintergrund der in sehr viel höherer Konzentration vorhan denen zellulären DNA nachgewiesen werden muß. Dadurch wird also die Spezifität des Nachweisverfahrens erhöht. Zu diesem Zweck werden als erstes die roten Blutkörperchen durch osmotische Hämolyse lysiert und dann die weisen Blutkörperchen enzymatisch aufgeschlossen. Diese beiden Verfahrensschritte sind so aus gewählt, daß durch sie die Pilzzellen selbst noch nicht beschädigt werden und daß ggf. phagozytierte Pilzzellen unbeschädigt wieder freigesetzt werden, so daß auch sie für den weiteren Nachweis zur Verfügung stehen.

Beispiel 1: Lysis roter Blutkörperchen durch osmotische Hämolyse

Die Lyse der roten Blutkörperchen erfolgt mit Hilfe einer hypotonen Lösung. Dazu wird folgender Puffer mit folgenden Endkonzentrationen verwendet:

Tris pH 7,6	10 mM
MgCl₂	5 mM
NaCl	10 mM

Die Lösung wird für 10 min bei Raumtemperatur inkubiert, und danach zentrifugiert.

Für diesen ersten Schritt ist eine Menge von 3 ml Vollblut ausreichend.

Beispiel 2: Enzymatisches Aufschließen weißer Blutkörperchen

Die weißen Blutkörperchen, die ggf. Pilzzellen enthalten, werden vorsichtig aufgebrochen, indem die Zellen mit Proteinase K (200 µg/ml) der Firma Böhringer, Mannheim in folgendem Puffer mit den angegebenen Endkonzentrationen enzymatisch angedaut werden, in dem das Pellet aus Beispiel 1 aufgenommen wird:

Tris pH 7,6	10 mM
EDTA pH 8,0	10 mM
NaCl	50 mM
SDS	0,2%
Proteinase K	200 µg/ml

Dieser Puffer wird für zwei Stunden bei 65°C inkubiert.

Beispiel 3: Trennung überwiegend intakter Pilzzellen vor allem von zellulärer DNA

Nachdem wie in den Beispielen 1 und 2 angegeben die Blutzellen aufgeschlossen wurden, so daß die zelluläre DNA freigegeben wurde, erfolgt ein Zentrifugationsschritt bei 5000 Um drehungen/min, der zu einem erheblichen Verlust an zellulärer DNA führt, die bei dieser Zentrifugationsgeschwindigkeit nicht sedimentiert.

Im Sediment befinden sich jetzt vollständig die freien oder freigesetzten Pilzzellen, die für die weitere Verarbeitung in einem Puffer (Aqua bidest) aufgenommen werden.

Beispiel 4: Aufschließen der Pilzzellen

Als nächstes werden die Pilzzellen alkalisch lysiert und enzymatisch behandelt, um die Pilz-DNA freizusetzen.

Dazu erfolgt zunächst eine Alkalilyse mit 200 ml 50 mM NaOH für 10 min bei 95°C.

Daraufhin erfolgt ein Neutralisationsschritt mit 1 M Tris-HCl pH 7,0.

Als nächstes werden 500 µl Zymolyase von Sigma (300 µg/ml) zugegeben und die Lösung für 60 min bei 37°C inkubiert, um die Pilzzellen enzymatisch aufzuschließen.

Daraufhin werden 500 µl Tris/EDTA und 50 µl 10%iger SDS zugegeben und die Lösung bei 65°C für 20 min inkubiert, um das Protein zu denaturieren.

Beispiel 5: Isolation der Pilz-DNA

In der nunmehr vorliegenden Lösung befinden sich Trümmer der Pilzzellen sowie freie Pilz-DNA, die nun isoliert werden muß.

Hierzu erfolgt zunächst eine Proteinpräzipitation mit 5 M Kaliumazetat, woraufhin der Überstand abgenommen und die DNA dann durch Zugabe von eiskaltem Isopropanol ausgefällt wird. Dieses Fällungsprodukt wird dann für die weiteren Verfahrens schritte verwendet.

Durch die in den Beispielen 1-5 angegebenen Verfahrensschritte ist es also möglich, aus Vollblut hoch-selektiv Pilz-DNA zu extrahieren, die nun als Präzipitat vorliegt und nur gering mit zellulärer DNA verunreinigt ist, wodurch der jetzt erfolgende Nachweis sehr sensitiv und hochspezifisch erfolgen kann.

Beispiel 6: Amplifikation eines pilzspezifischen DNA-Segmentes

In diesem Verfahrensschritt soll zunächst nachgewiesen werden, ob in dem Präzipitat aus dem Verfahrensschritt in Beispiel 5 überhaupt Pilz-DNA vorhanden ist. Dabei wird ausgenutzt, daß die im Sequenzprotokoll unter SEQ ID-No: 1 und SEQ ID-No: 2 angegebenen DNA-Sequenzen spezifisch an Bindungsstellen auf dem Pilz-Gen für die 18ssu-rRNA vieler Pilzstämme und -spezies binden.

Der Erfinder der vorliegenden Anmeldung hat nämlich erkannt, daß dieses Pilz-Gen bei den verschiedenen Pilz-Stämmen und -Gattungen ein derartiges Sequenzsegment aufweist, das einerseits von zwei Bindungsregionen für Primer flankiert wird, die für alle Pilz-Stämme und -Gattungen identisch sind, daß aber andererseits die Sequenz dieses Segmentes für die verschiedenen Pilz-Stämme und -Gattungen so verschieden ist, daß sie zum Nachweis der einzelnen Pilzspezies und -Gattungen verwenden werden kann.

Die DNA-Sequenz SEQ ID-No: 1 bindet dabei an den sense-Strang, während die DNA-Sequenz SEQ ID-No: 2 an den anti-sense-Strang bindet, wobei der Abstand zwischen den beiden Bindungsstellen ca. 500 Basenpaare beträgt. Diese beiden DNA-Sequenzen SEQ ID-No: 1 und SEQ ID-No: 2 eignen sich damit als Primer für eine Polymerase-Kettenreaktion (PCR), in der folglich Verstärkungs produkte (Amplicon) mit einer Länge von ca. 500 Basenpaaren erzeugt werden.

In der nachfolgenden Tabelle 1 ist die Lage der Primer und die Länge des jeweiligen Amplicons angegeben.

Tabelle 1: Von Pilz-Pathogenen erhaltene Amplicons

Durch diese beiden Primer SEQ ID-No: 1 und SEQ ID-No: 2 lassen sich also für alle relevanten Pilzspezies der Gattungen Candida und Aspergillus durch das PCR-Verfahren Amplicons von ca. 500 Basenpaaren in ausreichender Menge herstellen.

Die PCR-Bedingungen sind dabei die folgenden:

Puffer (50 µl):
10 mM Tris pH 9,6
50 mM NaCl
10 mM MgCl₂
0,2 mg/ml BSA
Polymerase
je 0,5 mM Nukleotide
je 100 pM Primer
Anfängliche Denaturierung: 3 min bei 94°C
Zyklus-Denaturierung: 0,5 min bei 94°C
Annealing: 1 min bei 62°C
Extension: 2 min bei 72°C
Terminale Extension: 5 min bei 72°C
Zykluszahl: 34.

Die hohe Magnesiumkonzentration im Puffer sorgt für eine hohe Spezifität der Polymerase, die mit 72°C im Extensions-Schritt bei ihrem Temperaturoptimum arbeiten kann.

Mit diesen Primern konnte insgesamt 40 Stämme von Candida albicans, 10 Stämme von Candida tropicalis, 6 Stämme von Candida parapsilosis, 11 Stämme von Candida glabrata, 8 Stämme von Candida krusei, 8 Stämme von Aspergillus fumigatus, 6 Stämme von Aspergillus flavus, 5 Stämme von Aspergillus terreus, 7 Stämme von Aspergillus niger, 5 Stämme von Aspergillus nidulans und 3 Stämme von Aspergillus versiculor erfolgreich amplifiziert werden.

Beispiel 7: Nachweis der Amplifikationsprodukte aus Beispiel 6

Im nächsten Schritt soll jetzt nachgewiesen werden, ob bei der PCR-Reaktion aus Beispiel 6 auch tatsächlich DNA-Segmente mit einer Länge von ca. 500 Basenpaaren hochverstärkt wurden. Diese Detektion der pilzspezifischen DNA-Segmente erfolgt durch Ethidiumbromid-Färbung der spezifischen Bande in einem 2%igen Agarose-Gel.

Ist hier die spezifische Bande zu erkennen, so kann von einer Pilzinfektion ausgegangen werden, da die Primer SEQ ID-No: 1 und SEQ ID-No: 2 an alle oben erwähnten Pilzstämme binden. Sollte also durch die Verfahrensschritte aus den Beispielen 1-5 Pilz-DNA extrahiert worden sein, so wird sie durch den PCR-Schritt des Beispiels 6 so weit hochverstärkt, daß sie hier durch Ethidiumbromid-Färbung nachgewiesen werden kann.

Beispiel 8: Zuordnung der Amplifikationsprodukte aus Beispiel 6 zu einzelnen Pilzspezies

Für eine spezifische Therapie ist es jetzt noch erforderlich, die im Schritt 7 bereits nachgewiesene Pilzinfektion genauer zu spezifizieren. Hier zeigt sich jetzt ein weiterer Vorteil des PCR-Schrittes aus Beispiel 6. Dort wurde nämlich so viel pilzspezifisches DNA-Segment erzeugt, daß jetzt weitere Nachweis verfahren zur Bestimmung der Pilzspezies möglich sind.

Hierzu werden die im Sequenzprotokoll angegebenen Nucleotid sequenzen SEQ ID-No: 3 bis SEQ ID-No: 8 herangezogen, die als Spezies-spezifische Sonden dienen, die mit einem Sequenzabschnitt des in Beispiel 6 erzeugten DNA-Segmentes spezifisch hybridi sieren.

Es wurde gefunden, daß die Sonde SEQ ID-No: 3 mit Candida albicans, SEQ ID-No: 4 mit Candida glabrata, SEQ ID-No: 5 mit Candida krusei, SEQ ID-No: 6 mit Candida tropicalis, SEQ ID-No: 7 mit Candida parapsilosis und SEQ ID-No: 8 mit Aspergillus fumigatus, A. flavus, A. versiculor, A. niger, A. nidulans und A. terreus hybridisieren. Die Nucleotidsequenz SEQ ID-No: 8 ist also eine allgemeine Aspergillus-Sonde, während die Nucleotidsequenzen SEQ ID-No: 3 - SEQ ID-No: 5 Pilzspezies der Gattung Candida voneinander unterscheiden können.

Um die erfolgte Hybridisierung nachweisen zu können, werden die Sonden mit dem Transferase-Kit der Firma Böhringer, Mannheim mit Digoxigenin markiert, wobei der Nachweis nach dem Southern Blot-Verfahren mit der üblichen Farbreaktion erfolgt.

Mit Hilfe dieser Sonden erfolgt eine sequentielle Hybridisierung, die nach der Häufigkeit der einzelnen Pilzspezies gestaffelt ist, so daß zunächst mit SEQ ID-No: 3 (C. albicans), dann mit SEQ ID-No: 8 (Aspergillus), SEQ ID-No: 6 (C. tropicalis), SEQ ID-No: 7 (C. parapsilosis), SEQ ID-No: 4 (C. glabrata) und schließlich mit SEQ ID-No: 5 (C. krusei) hybridisiert wird.

Auf diese Weise ist es also möglich, an Hand der im Schritt beispiel 6 erzeugten Amplifikationsprodukte durch sequentielles Hybridisieren die Pilzspezies zu identifizieren und anschließend eine gezielte Therapie einzuleiten.

Beispiel 9: Nachweis ausgesäter Pilzzellen in Blut

Mit Hilfe der spezifischen Amplifikation und sequentiellen Hybridisierung gelang es, Pilzspezies mit einer Sensitivität von 1-3 Pilzzellen reproduzierbar nachzuweisen. Durch Aussaat von Pilzspezies in Blutproben konnte nachgewiesen werden, daß das obige Verfahren eine Sensitivität von einer sog. CFU (colony forming unit)/ml-Blut erreicht. Diese Nachweisgrenze liegt weit unterhalb derjenigen, die bei einer klinisch relevanten Pilzaus saat in Blut erwartet werden kann.

Beispiel 10: Klinisches Untersuchungsprogramm

In einem groß angelegten klinischen Untersuchungsprogramm konnte eine hohe Spezifität des neuen Verfahrens bei der Analyse von 165 Blutproben von 65 gesunden Probanden gezeigt werden. Alle 165 Blutproben sind negativ geblieben.

94 immunsupprimierte Patienten mit unklarem Fieber wurden daraufhin auf die Präsenz einer Pilzinfektion untersucht. Von 69 Patienten, bei denen keine invasive Pilzinfektion vorlag, waren weit über 200 Blutproben (bis auf eine Ausnahme) ebenfalls negativ.

Dagegen konnten alle 25 Patienten mit invasiver Pilzinfektion bereits innerhalb der ersten Woche als positiv identifiziert werden. Bei allen Patienten gelang darüber hinaus die Zuordnung zu dem verursachenden Pilzerreger.

SEQUENZPROTOKOLL

Claims

1. Verfahren zum Extrahieren von Pilz-DNA aus Vollblut, mit den Schritten:

a) Isolation überwiegend intakter Pilzzellen aus dem Vollblut,
b) Extrahieren von DNA aus den isolierten Pilzzellen durch
- b1) Aufschließen der isolierten Pilzzellen, und
- b2) Isolation der Pilz-DNA,

dadurch gekennzeichnet, daß der Schritt a) die weiteren Schritte umfaßt:

a1) Aufschließen der im Vollblut befindlichen Blut zellen;
a2) Isolation überwiegend intakter Pilzzellen von zellulärer DNA.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Schritt a) die weiteren Schritte umfaßt:

a1.1) Lysis der roten Blutkörperchen durch osmotische Hämolyse;
a1.2) enzymatisches Aufschließen der weißen Blutkörper chen; und
a2.1) Zentrifugation des so behandelten Vollblutes und Verwendung des Pellet in den nächsten Verfah rensschritten.

3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß im Schritt a1.1) die Lysis der roten Blutkörperchen mit Hilfe einer hypotonen Lösung und einem Detergenz erfolgt, vorzugsweise mit einer Endkonzentration von 10 mM Tris pH 7,6, 5 mM Mgcl₂ und 10 mM NaCl.

4. Verfahren nach Anspruch 2 oder 3, dadurch gekennzeichnet, daß im Schritt a1.2) das enzymatische Aufschließen der weißen Blutkörperchen in einer Lösung mit einer Endkonzen tration von 200 µg/ml Proteinase K, 10 mM Tris pH 7,6, 10 mM EDTA pH 8,0, 50 mM NaCl und 0,2% SDS erfolgt.

5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Lösung für 100-140 min, vorzugsweise 120 min bei 60-70°C, vorzugsweise bei 65°C inkubiert wird.

6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-5, dadurch gekenn zeichnet, daß der Schritt b1) den weiteren Schritt umfaßt:

b1.1) Alkalisches Lysieren und enzymatische Behandlung der Pilzzellen.

7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß der Schritt b1.1) folgende Schritte umfaßt:

- Inkubieren der im Pellet aus Schritt a2.1) befind lichen Pilzzellen bei 90-95°C, vorzugsweise 95°C für 5-15 min, vorzugsweise 10 min, in einer Lösung mit 50 mM NaOH, und
- Neutralisation mit 1 M Tris-HCl pH 7,0.

8. Verfahren nach Anspruch 6 oder 7, dadurch gekennzeichnet, daß der Schritt b2) folgende Schritte umfaßt:

- Proteinpräzipitation mit 5 M Kaliumazetat, und
- DNA-Präzipitation des Überstandes in eiskaltem Isopropanol.

9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, gekennzeichnet durch die Schritte:

- Nachweisen der extrahierten Pilz-DNA, und
- Bestimmen der Pilz-Spezies aus der extrahierten DNA, wodurch Pilzzellen in klinischem Material nachgewiesen werden.

10. Kit zur Durchführung des Verfahrens nach einem der Ansprüche 1-8.