KR20160142618A - 조직내 교잡법을 이용한 낭충봉아 부패병 바이러스 진단용 조성물 및 이를 이용한 진단방법 - Google Patents

조직내 교잡법을 이용한 낭충봉아 부패병 바이러스 진단용 조성물 및 이를 이용한 진단방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 조직내 교잡법(in situ hybridization)을 이용한 낭충봉아 부패병 바이러스(sacbrood virus, SBV) 진단용 조성물 및 이를 이용한 진단방법에 관한 것으로, 본 발명의 조직내 교잡법(in situ hybridization)을 이용한 낭충봉아 부패병 바이러스(sacbrood virus, SBV) 진단용 조성물 및 이를 이용한 진단방법은 기존의 낭충봉아 부패병 바이러스 검출 방법에 비해 정확하고 간편하게 병원체의 감염여부와 분포상태를 진단할 수 있으므로, 낭충봉아 부패병 바이러스의 검출 및 감염 진단에 유용하게 사용할 수 있다.

Description

조직내 교잡법을 이용한 낭충봉아 부패병 바이러스 진단용 조성물 및 이를 이용한 진단방법{Composition for diagnosing sacbrood virus using in situ hybridization and method for diagnosing the same}
본 발명은 조직내 교잡법(in situ hybridization)을 이용한 낭충봉아 부패병 바이러스(sacbrood virus, SBV) 진단용 조성물 및 이를 이용한 진단방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 꿀벌의 낭충봉아 부패병 바이러스에 특이적인 조직내 교잡법(in situ hybridization)용 프로브를 포함하는 낭충봉아 부패병 바이러스 진단 조성물, 이를 이용한 진단방법 및 진단키트에 관한 것이다.
바이러스로 인한 꿀벌의 질병은 18종 이상이 알려져 있으나(Allen, M., and B. V. Ball, Bee World, 77:141, 1996), 현재까지도 바이러스 질병에 대한 적절한 치료법은 제시된 바 없으며, 강군양성 및 유지만이 자연치료를 이끌 수 있는 유일한 예방책으로 알려져 있다. 특히 이들 꿀벌 바이러스들은 봉군을 지속적으로 약화시켜 다른 병인체와 혼합감염을 일으키며, 이러한 혼합감염은 봉군의 붕괴 등 봉군 전체에 치명적 손상을 일으키기에 최근 그 문제점이 심각하게 대두되고 있다.
특히, 낭충봉아부패병(sacbrood)은 꿀벌 유충에 발생하는 바이러스성 전염병으로서, 이 병에 걸린 유충은 번데기가 되지 못하고 말라 죽게 되는 병으로, 충주머니병(낭충병)이라고도 불리며, 국내에서는 토종벌 괴질이라고도 한다. 꿀벌 유충(애벌레)에 발생하는 전염성 질병으로, 낭충봉아 부패병 바이러스(Sacbrood Virus, SBV)에 의해 감염되며 부화기부터 유충이 번식하는 봄에서 여름 사이에 주로 발생한다.
감염된 유충들은 초기에 회색빛(머리 부분은 거무스름한 빛)을 띠었다가 점차 노란색에서 갈색으로 변하고, 후기엔 거의 검게 변하며 부패한다. 또한, 초기에 몸 속에 물집처럼 액이 가득 차면서 전체적으로 약간 부풀어오르다가 점차 쪼그라들며 외피가 단단하게 굳어져 결국 번데기가 되지 못하고 말라 죽게 된다. 낭충봉아 부패병은 오염된 화분(꽃가루)과 화밀(꽃꿀) 등을 통해 감염되는 것으로 여겨진다. 일벌들은 병든 유충들이 들어 있는 벌방을 청소하고 말라 죽은 유충들을 제거하게 되는데 이 과정에서 일벌들도 감염되며, 양봉기구와 벌의 교환 등을 통해 벌통에서 벌통으로 전염이 확산될 수 있다.
낭충봉아 부패병은 유밀(꽃에서 꿀이 분비되는 현상)이 왕성해지고, 벌의 한 무리를 형성하는 봉군의 세력이 강하여 양질의 화분과 화밀 등을 공급할 수 있게 되거나 산란력이 좋은 여왕벌을 유입하면 병세가 누그러진다는 보고가 있다. 하지만 질병의 확산이 심해지면 감염된 봉군을 소각하여 감염원을 제거하고, 꿀벌에 영양을 충분히 공급하는 조치를 취해야 한다. 현재 낭충봉아 부패병의 치료약과 예방약은 개발되어 있지 않은 상태이다.
국내에는 유럽형 낭충봉아 부패병 바이러스 및 극동아시아형 낭충봉아 부패병 바이러스 두 종류가 있는 것으로 알려져 있으며, 유럽형 낭충봉아 부패병 바이러스의 경우 서양종 꿀벌에만 문제를 일으키며 유밀기에 비교적 잘 치료가 되는 것이 특징이다. 그러나 토종벌(동양종 꿀벌) 및 서양종 꿀벌 모두에 문제를 일으킬 수 있는 극동아시아형 낭충봉아 부패병 바이러스는 토종벌에 감염시 치료가 어려워 문제점으로 지적되고 있다.
농식품부의 국내 피해조사결과에 따르면, 2010년 전체 사육군수 7,959군 중 52.6%의 사육군에서 완전폐사, 22.3%의 사육군에서 부분폐사가 진행 중이었으며, 전체적인 피해는 74.9%로 보고되었다. 또한, 2011년에는 낭충봉아 부패병 발생 주의보가 발령되었으며, 토종벌에 대한 피해가 특히 심각하였다 (한국공개특허 제2014-0081368호 및 한국공개특허 제2014-0005458호).
현재까지 꿀벌의 병원성 바이러스 진단은 일반적인 PCR 및 실시간 PCR법(Real-time PCR) 등이 진단의 도구로서 유용하게 이용되고 있으며(강민희 et al ., 한국양봉학회지, 23:29, 2008), 병원성 바이러스의 존재 및 그 영향을 탐구하는데 가장 유용한 도구가 되어왔다. 그러나 PCR에 기반을 둔 진단법들은 열순환기(thermocycler) 등의 실험기기를 사용하는 실험실적 검사법이라는 한계를 가지고 있어서 양봉 현장에서 질병 시료에 대한 즉석 검사를 시행하기에는 많은 제약이 따랐다. 그에 따라 최근에는 PCR 기반의 진단방법보다 진일보한 LAMP(Loop-mediated isothermal amplification)법이 개발되었으며(Notomi T, Nippon Rinsho ., 65:957, 2007), 등온에서 증폭이 이루어지므로 주로 등온 PCR(isothermal PCR)이라고 불리어져 왔다.
그러나, 토종벌에 치명적인 피해를 입히는 낭충봉아 부패병 바이러스를 특이적으로 진단할 수 있는 방법에 대해서는 거의 알려진 바 없으며, 이에 대한 연구도 전무한 상태이다. 따라서, 낭충봉아 부패병 바이러스를 구별하여 특이적으로 감염 여부를 진단할 수 있는 새로운 낭충봉아 부패병 바이러스 감염 진단방법의 개발이 필요하다.
이에, 본 발명의 발명자들은 상기와 같은 문제점을 해결하기 위하여 예의 노력한 결과, 낭충봉아 부패병 바이러스에 특이적인 DNA 프로브(probe)를 포르말린 고정 후, 파리핀 포매(paraffin embedding)된 꿀벌 조직절편상에 적용시켜 조직내 교잡반응을 유도한 후, 염색과정을 통해 교잡여부를 육안으로 확인함으로써, 조직내의 원인 병원체를 분리배양하지 않은 채 신속 및 용이하게 그 감염여부와 조직내의 분포상태를 관찰할 수 있는 것을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 꿀벌의 낭충봉아 부패병 바이러스에 특이적인 조직내 교잡법(in situ hybridization)용 프로브를 포함하는 낭충봉아 부패병 바이러스 진단 조성물, 이를 이용한 진단방법 및 진단키트를 제공하는데 있다.
상기 목적을 달성하기 위해서, 본 발명은 낭충봉아 부패병 바이러스(Sacbrood Virus)에 특이적인 서열번호 1의 염기서열로 표시되는 조직내 교잡법(in situ hybridization)용 프로브를 포함하는 낭충봉아 부패병 바이러스 감염 진단용 조성물을 제공한다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 서열번호 1의 염기서열로 표시되는 조직내 교잡법(in situ hybridization)용 프로브는 서열번호 2 및 서열번호 3의 염기서열로 이루어진 프라이머 세트를 이용하여 낭충봉아 부패병 바이러스 유전자를 증폭시켜 제조한 것일 수 있다.
본 발명의 바람직한 다른 일실시예에 따르면, 상기 프로브는 디곡시제닌(digoxigenin)으로 표지될 수 있다.
본 발명은 또한, 상기 낭충봉아 부패병 바이러스 감염이 의심되는 꿀벌의 조직절편상에 상기 낭충봉아 부패병 바이러스 감염 진단용 조성물을 적용시켜 조직내 교잡(in situ hybridization) 공정을 수행하는 단계를 포함하는 낭충봉아 부패병 바이러스 감염 진단 방법을 제공한다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 조직내 교잡공정은 (a) 낭충봉아 부패병 바이러스 감염이 의심되는 꿀벌의 애벌레 또는 성충 개체를 파라핀 포매(paraffin embedding)시켜 조직절편을 제조한 다음, 상기 조직절편에 표적핵산을 노출시키는 단계; (b) 상기 표적핵산이 노출된 조직절편에 서열번호 1의 염기서열로 표시되는 조직내 교잡법(in situ hybridization)용 프로브를 포함하는 조성물을 처리하여 표적핵산과 프로브의 교잡을 유도하는 단계; 및 (c) 상기 교잡되지 않은 프로브를 제거한 다음, 조직절편내 낭충봉아 부패병 바이러스의 존재유무를 관찰하는 단계;를 포함할 수 있다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 (a) 단계에서 조직절편은 낭충봉아 부패병 바이러스 감염이 의심되는 꿀벌의 애벌레 또는 성충 개체에 중성 포르말린을 주입하여 24 내지 48시간 고정시켜 파라핀 포매시킨 후, 3 내지 5㎛ 두께로 분절하여 제조할 수 있다.
본 발명의 바람직한 다른 일실시예에 따르면, 상기 (a) 단계의 표적핵산 노출은 ⅰ) 조직절편에 염산(HCl)을 처리하는 단백질 제거단계; ⅱ) 프로티아제 K를 처리 후 파라포름알데하이드로 처리하는 고정단계; ⅲ) 아세틱 안하이드라이드를 처리하는 아세틸화 단계;를 포함할 수 있다.
본 발명의 바람직한 또 다른 일실시예에 따르면, 상기 (b) 단계는 500 ng/㎖의 농도의 서열번호 1의 염기서열로 표시되는 조직내 교잡법(in situ hybridization)용 프로브를 포함하는 조성물을 처리하여 94 내지 96℃에서 10분간 가열한 다음, 45℃에서 15 내지 20시간 반응시킬 수 있다.
본 발명의 바람직한 또 다른 일실시예에 따르면, 상기 (c) 단계의 조직절편내 낭충봉아 부패병 바이러스의 존재유무 관찰은, ⅰ) 블로킹버퍼에 0.1 내지 10%로 희석된 알카라인 포스파테이즈 결합 항디곡시제닌을 조직절편상에 반응시키는 단계; ⅱ) 상기 반응 후 조직절편을 말레익산 버퍼, 블로킹버퍼 및 검출버퍼로 처리하는 단계; ⅲ) 검출버퍼에 희석시킨 니트로블루 테트라졸리움(NBT)과 5-브로모-4-클로로-3-인돌일포스파테이트(BCIP)를 조직절편상에 3 내지 4시간 반응시키는 발색단계; 및 ⅳ) 메틸그린으로 대조염색한 후 암갈색의 양성반응을 확인하는 단계;를 포함할 수 있다.
본 발명은 또한, 상기 낭충봉아 부패병 바이러스 감염 진단용 조성물을 포함하는 낭충봉아 부패병 바이러스 감염 진단 키트를 제공한다.
본 발명의 조직내 교잡법(in situ hybridization)을 이용한 낭충봉아 부패병 바이러스(sacbrood virus, SBV) 진단용 조성물 및 이를 이용한 진단방법은 기존의 낭충봉아 부패병 바이러스 검출 방법에 비해 정확하고 간편하게 병원체의 감염여부와 분포상태를 진단할 수 있으므로, 낭충봉아 부패병 바이러스의 검출 및 감염 진단에 유용하게 사용할 수 있다.
도 1은 낭충봉아 부패병 바이러스에 특이적인 서열번호 1의 염기서열로 표시되는 조직내 교잡법(in situ hybridization)용 프로브의 전기영동 사진을 나타낸 것이다.
도 2는 본 발명의 서열번호 1의 염기서열로 표시되는 조직내 교잡법(in situ hybridization)용 프로브의 서열을 나타낸 것이다.
도 3은 본 발명의 조직내 교잡법을 이용하여 꿀벌의 애벌레(larval) 조직에서 낭충봉아 부패병 바이러스 감염 여부를 확인한 것으로, (a)는 제3기 애벌레 단계에서 (b)는 전용기(prepupal period) 단계에서 낭충봉아 부패병 바이러스 감염 여부 및 바이러스 분포상태를 확인한 데이터이다.
도 4는 본 발명이 조직내 교잡법을 이용하여 낭충봉아 부패병 바이러스에 감염된 꿀벌의 애벌레 조직(a) 및 바이러스에 감염되지 않은 꿀벌의 애벌레 조직(b)을 비교한 데이터이다.
이하, 본 발명을 보다 상세히 설명한다.
상술한 바와 같이, 낭충봉아 부패병의 치료 및 예방약은 개발되지 않은 상태로, 현재까지 꿀벌의 병원성 바이러스 진단은 일반적인 PCR 및 실시간 PCR법(Real-time PCR) 등이 진단의 도구로서 유용하게 이용되고 있으나, 양봉 현장에서 질병 시료에 대한 즉석 검사를 시행하기에는 많은 제약 있으므로, 낭충봉아 부패병 바이러스를 구별하여 특이적으로 감염 여부를 진단할 수 있는 낭충봉아 부패병 바이러스 감염 진단방법의 개발이 요구되고 있다.
본 발명은 조직내 교잡법(in situ hybridization)을 이용한 낭충봉아 부패병 바이러스(sacbrood virus, SBV) 진단용 조성물 및 이를 이용한 진단방법을 제공함으로써 상술한 문제의 해결을 모색하였다. 이를 통해 기존의 낭충봉아 부패병 바이러스 검출 방법에 비해 정확하고 간편하게 병원체의 감염여부와 분포상태를 진단할 수 있으므로, 낭충봉아 부패병 바이러스의 검출 및 감염 진단에 유용하게 사용할 수 있다.
따라서, 본 발명은 낭충봉아 부패병 바이러스(Sacbrood Virus)에 특이적인 서열번호 1의 염기서열로 표시되는 조직내 교잡법(in situ hybridization)용 프로브를 포함하는 낭충봉아 부패병 바이러스 감염 진단용 조성물에 관한 것이다.
상기 "조직내 교잡법(in situ hybridization)"은 "가시적 분자결합화" 또는 "현장 혼성화"라고도 불리며, 세포나 조직의 표본에 표지된 DNA 또는 RNA 탐침(probe)을 넣고 핵산의 접종 형성을 유도해서 원하는 탐침의 발현 위치나 존재 여부를 확인하는 실험방법이다. 이 방법은 시료 중의 핵산을 추출하지 않고도 목적하는 DNA 또는 RNA의 국부적인 존재를 확인할 수 있는 장점이 있다. in situ는 '제자리에'라는 뜻이고, 실험목적에 따라 조직내 교잡법은 3종류로 나뉜다. 첫째, 파지나 플라스미드 라이브러리의 선별이 목적으로, 한천배지 위의 파지용균반 혹은 대장균 콜로니의 DNA를 필터에 흡착시켜 이루어지는 잡종형성이다. 둘째, 염색체 내에서의 유전자 위치결정이 목적으로, 염색체 DNA와의 잡종형성이다. 셋째, 조직절편과 배양세포 등에서 목적유전자가 발현하는 세포 동정이 목적으로, 주로 mRNA와의 잡종형성을 말한다. 본 발명에서는 낭충봉아 부패병 바이러스의 감염의 의심되는 꿀벌의 조직절편을 이용하여 낭충봉아 부패병 바이러스 감염 여부를 진단하고자 하였다.
본 발명의 "핵산"이라는 용어들은 단일- 또는 이중-가닥 형태인 데옥시리보뉴클레오타이드들 또는 리보뉴클레오타이드들 또는 이들의 폴리머들을 일컫는다.
본 발명의 "프로브(probe)"는 "탐침자"라고도 불리우며 본 명세서에서는 두 용어를 혼용하여 사용하였다. 프로브는 특정 뉴클레오타이드 서열에 혼성화될 수 있는 디옥시리보뉴클레오타이드 및 리보뉴클레오타이드를 포함하는 자연 또는 변형되는 모노머 또는 결합을 갖는 선형의 올리고머를 의미한다. 바람직하게는, 프로브는 혼성화에서의 최대 효율을 위하여 단일가닥이다.
본 발명에 있어서, 상기 서열번호 1의 염기서열로 표시되는 조직내 교잡법(in situ hybridization)용 프로브는 서열번호 2 및 서열번호 3의 염기서열로 이루어진 프라이머 세트를 이용하여 낭충봉아 부패병 바이러스 유전자를 증폭시켜 제조한 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명의 일실시예에서는 낭충봉아 부패병 바이러스에 특이적인 DNA 프로브를 제작하기 위해 낭충봉아 부패병 바이러스에 감염된 꿀벌의 애벌레 및 성충에서 낭충봉아 부패병 바이러스를 분리한 다음, 서열번호 2 및 서열번호 3의 염기서열로 표시되는 프라이머 세트 및 PCR 방법을 이용하여 DNA 프로브를 증폭시켰으며, 도 1에 나타난 바와 같이 DNA 프로브 258bp 크기를 가지며, 서열번호 1의 염기서열로 표시되는 것으로 확인하였다.
본 발명의 "증폭" 또는 "증폭된"이라는 용어는 하나 또는 소수의 복제물들로부터의 다량의 DNA 복제물들의 생산을 일컫는다.
본 발명의 "PCR(중합효소 연쇄 반응; polymerase chain reaction)"은 일반적으로 열에 안정한 폴리머라아제 및 하나는 증폭될 서열의 한 말단에서 (+)-가닥과 상보적이며 다른 하나는 다른 말단에서 (-)-가닥과 상보적인 두 개의 올리고뉴클레오타이드 프라이머를 이용하여 DNA 또는 RNA 염기서열을 증폭하는 방법이다. 새롭게 합성된 DNA 또는 cDNA 가닥들은 이어서 동일한 프라이머 서열들의 추가적인 주형들로 제공되기 때문에 연이은 프라이머 부착, 가닥 연장, 및 해리의 단계가 원하는 서열의 신속하고 매우 특이적인 증폭을 이루어낸다.
본 발명의 "프라이머"라는 용어는 일반적으로 50 이하, 바람직하게는 18-25bp 뉴클레오타이들(DNA가 통상 이중가닥이기 때문에 그 길이는 염기쌍들로 측정된다; 단일가닥 DNA는 염기들 또는 뉴클레오타이드들로 측정된다)이며, 프라이머는 주형의 서열과 정확하게 상보적일 필요는 없지만 주형과 혼성복합체(hybrid complex)를 형성할 수 있을 정도로 상보적인 짧은 인조 올리고뉴클레오타이드 가닥들을 일컫는다. 프라이머들은 DNA 폴리머라아제가 부착되어 새로운 DNA 가닥의 합성이 시작되는 DNA 주형의 시작점 및 종점에 단련(부착)된다. 전방향 서열분석 프라이머는 역방향 프라이머에 비해 5'에 부착되며, 역방향 서열분석 프라이머는 전방향 프라이머에 비해 3'에 부착된다. 프라이머들 및 기준 서열 사이의 관계는 사용되는 좌표계에 의존한다. 전방향 프라이머는 좌표계 내에서 역방향 프라이머의 이론상 우측에 있어야 하기 때문에 전방향 프라이머의 부착 위치는 역방향 프라이머들의 부착위치보다 일반적으로 적다.
본 발명에 있어서, 상기 프로브는 낭충봉아 부패병 바이러스 감염여부를 눈으로 쉽게 판별하기 위해 디곡시제닌(digoxigenin)으로 표지하여 사용하였다.
상기 프로브는 임의 표지(random labeling)할 수 있으며, 표지로는 플루오로포어(fluorophores)(예컨대, 플루오레세인(fluorescein)), 피코에리트린(phycoerythrin), 로다민(rhodamine), 리사민(lissamine), Cy3 및 Cy5 (Pharmacia), 크로모포어(chromophores), 케미루미네서(chemiluminescers), 자성입자(magnetic particles), 방사성 동위원소(radioisotopes)(예컨대, P32 및 S35), 질량 라벨(mass labels), 전자 치밀 입자(electron dense particles), 효소들(예컨대, 알칼리 포스파타아제(alkaline phosphatase) 및 양고추냉이 페록시다아제(horseradish peroxidase)), 보조인자(cofactors), 효소에 대한 기질(substrates for enzymes), 중금속(예컨대, 금) 및 대응물(partners)에 특이적 결합을 갖는 부착소(haptens) 예컨대, 항체, 스트렙토아비딘, 바이오틴, 다이곡시제닌(digoxigenin) 및 킬레이트기(chelating group)를 적용할 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다. 상기 표지는 형광(fluorescence), 방사능(radioactivity), 발색 측정(measurement of color development), 질량 측정(mass measurement), X-ray 회절 또는 흡수, 자기장, 효소적 활성, 질량 분석, 결합 친화도(binding affinity), 고주파 혼성화(high frequency hybridization) 또는 나노크리스탈(nanocrystal)에 의해 검출 가능한 신호를 발생할 수 있다.
다만, 방사성 동위원소로 표지된 프로브의 경우 조직에 남아있는 수명이 짧기 때문에 지속적인 신호의 검출이 제한적이고, 발생되는 신호의 해상도가 낮으며, 암실에서 수행되어야 하는 제약이 있다. 이와 같은 문제를 해결하기 위하여 프로브를 디곡시제닌 또는 바이오틴과 같은 비방사성 동위원소로 표지할 수 있다. 그러나 바이오틴의 경우 방사성 동위원소 및 디곡시제닌으로 표지한 경우보다 민감도가 떨어지며, 무엇보다 조직 내 내인성 바이오틴의 존재 때문에 바이오틴을 표지한 프로브는 비특이 반응 가능성이 높을 수 있다. 따라서 방사성 동위원소의 제약을 극복할 수 있고, 높은 민감도, 재현성뿐만 아니라, 비특이 반응 가능성이 낮은 디곡시제닌(digoxigenin)으로 임의 표지하는 것이 가장 바람직하다.
또한, 본 발명은 상기 낭충봉아 부패병 바이러스 감염이 의심되는 꿀벌의 조직절편상에 상기 낭충봉아 부패병 바이러스 감염 진단용 조성물을 적용시켜 조직내 교잡(in situ hybridization) 공정을 수행하는 단계를 포함하는 낭충봉아 부패병 바이러스 감염 진단 방법에 관한 것이다.
상기 조직내 교잡공정은
(a) 낭충봉아 부패병 바이러스 감염이 의심되는 꿀벌의 애벌레 또는 성충 개체를 파라핀 포매(paraffin embedding)시켜 조직절편을 제조한 다음, 상기 조직절편에 표적핵산을 노출시키는 단계;
(b) 상기 표적핵산이 노출된 조직절편에 서열번호 1의 염기서열로 표시되는 조직내 교잡법(in situ hybridization)용 프로브를 처리하여 표적핵산과 프로브의 교잡을 유도하는 단계; 및
(c) 상기 교잡되지 않은 프로브를 제거한 다음, 조직절편내 낭충봉아 부패병 바이러스의 존재 유무를 관찰하는 단계;
를 포함할 수 있다.
상기 방법을 좀 더 구체적으로 설명하면, 먼저 (a) 단계는 낭충봉아 부패병 바이러스 감염이 의심되는 꿀벌의 애벌레 또는 성충 개체를 파라핀 포매(paraffin embedding)시켜 조직절편을 제조한 다음, 상기 조직절편에 표적핵산을 노출시키는 단계이다.
상기 (a) 단계에서 조직절편은 낭충봉아 부패병 바이러스 감염이 의심되는 꿀벌의 애벌레 또는 성충 개체에 중성 포르말린을 주입하여 24 내지 48시간 고정시켜 파라핀 포매시킨 후, 3 내지 5㎛ 두께로 분절하여 제조할 수 있다.
또한, 상기 (a) 단계의 표적핵산 노출은 ⅰ) 조직 절편상에 산 및 단백질 분해효소를 처리하여 단백질을 제거하는 단계; ⅱ) 고정제로 처리하여 조직을 고정하는 단계; ⅲ) 고정된 조직을 아세틸화시키는 단계;를 포함하는 방법으로 수행할 수 있다.
구체적으로, 단백질을 제거하기 위하여 바람직하게는 염산(HCl), 시트릭산 또는 포름산 등의 단독 또는 혼합 형태의 산과 프로테아제 K, 펩신 또는 트립신 등의 단독 또는 혼합 형태의 단백질 분해 효소를 처리할 수 있다. 상기 고정제는 조직 고정을 위하여 통상적으로 사용되는 고정제라면 특별한 제한은 없으나, 보다 바람직하게는 파라포름알데하이드 또는 포름알데하이드를 처리하여 고정시킬 수 있다. 고정된 조직 절편에 아세틸화제를 처리하여 아세틸화하는 단계를 거치는데, 아세틸화제로 보다 바람직하게는 아세틱 안하이드라이드를 처리하여 아세틸화시킬 수 있다.
다음으로, (b) 단계는 상기 표적핵산이 노출된 조직절편에 서열번호 1의 염기서열로 표시되는 조직내 교잡법(in situ hybridization)용 프로브를 처리하여 표적핵산과 프로브의 교잡을 유도하는 단계이다.
상기 (b) 단계는 400 내지 600 ng/㎖의 농도의 서열번호 1의 염기서열로 표시되는 조직내 교잡법(in situ hybridization)용 프로브를 포함하는 조성물을 처리하여 94 내지 96℃에서 10분간 가열한 다음, 45℃에서 15 내지 20시간 반응시키는 것을 특징으로 할 수 있다.
마지막으로, (c) 단계는 상기 교잡되지 않은 프로브를 제거한 다음, 조직절편내 낭충봉아 부패병 바이러스의 존재 유무를 관찰하는 단계이다.
상기 공정에서 교잡된 하이브리드로부터 미교잡물을 제거하기 위한 세척공정을 수행하여 순수 하이브리드만이 포함되도록 할 수 있다.
조직절편내 낭충봉아 부패병 바이러스의 존재 유무를 관찰하는 검출 공정의 경우, 표지에 따라 다양한 방법으로 분석될 수 있다. 예를 들어, 프로브가 효소로 라벨링되는 경우에, 혼성화의 발생은 효소에 대한 기질을 혼성화 결과물과 반응시킴으로써 측정될 수 있다. 바람직한 상기 효소/기질 쌍은 페록시다아제(peroxidase)(예컨대, 양고추냉이 페록시다아제)와 클로로나프톨(chloronaphtol)의 쌍, 아미노에틸카바졸(aminoethylcarbazol), 디아미노벤지딘(diaminobenzidine), D-루시페린(luciferin), 루시제닌(lucigenin) (bis-N-methylacridinium nitrate), 레소루핀 벤질 에테르(resorufin benzyl ether), 루미놀(luminol), 앰플렉스 레드 시약(Amplex Red reagent) (10-acetyl-3,7-dihydroxyphenoxazine), HYR (pphenylenediamine-HCl and pyrocatechol), TMB (3,3,5,5-tetramethylbenzidine), ABTS (2,2-Azine-di[3-ethylbenzthiazoline sulfonate]), o-페닐렌디아민(phenylenediamine, OPD) 또는 나프톨(naphtol)/피로닌(pyronine); 알칼리 포스파타아제(alkaline phosphatase)와 브로모클로로인돌릴포스페이트(bromochloroindolylphosphate, BCIP)의 쌍, 니트로 블루 테트라졸륨(nitro blue tetrazolium, NBT), 나프톨(naphthol)-AS-B1-포스페이트(phosphate) 또는 ECF 기질; 글루코시다아제(glucosidase)와 t-NBT(nitrobluetetrazolium)의 쌍 또는 m-PMS(phenzaine methosulfate)를 포함하나 이에 한정되지는 않는다. 프로브가 금 입자로 라벨링되는 경우에, 혼성화의 발생은 질산은(silver nitrate)을 이용하는 은 염색 방법으로 검출될 수 있다.
한편, DNA 프로브에 디곡시제닌(digoxigenin)으로 임의 표지한 경우 상기 검출공정은 보다 바람직하게는 ⅰ) DNA 프로브에 표지된 표지물과 특이적으로 결합할 수 있으며, 효소가 부착된 상보성 물질을 조직 절편상에 반응시키는 단계; 및 ⅱ) 발색제를 조직 절편상에 반응시켜 발색시키는 단계를 포함할 수 있다.
디곡시제닌(digoxigenin)으로 임의 표지한 경우 이와 특이적으로 결합할 수 있는 상보성 물질로 항디곡시제닌(anti-digoxigenin)을 반응시킬 수 있다. 상기 상보성 물질에 부착되는 효소로는 바람직하게는 알카린 포스파테이즈(alkaline phosphatase), β-갈락토시다아제, 루시페라아제, 시토크롬P450 또는 양고추냉이 페록시다아제 등이 있을 수 있으며, 가장 바람직하게는 알카린 포스파테이즈(alkaline phosphatase)일 수 있다. 상기 효소 부착 상보성물질은 0.1 내지 10%로 희석하여 조직 절편상에 반응시킬 수 있다.
상기에서 수득된 조직 절편 상에 발색제를 반응시켜 발색시킬 수 있는데, 상보성 물질에 부착되는 효소로 알칼리 포스파타아제(alkaline phosphatase)를 사용하는 경우에는 발색제로 5-브로모-4-클로로-3-인돌일포스파테이트(BCIP) 및 니트로 블루 테트라졸륨(NBT)을 사용하거나 또는 ECF기질이 사용될 수 있고, 양고추냉이 페록시다아제를 사용하는 경우에는 클로로나프톨, 아미노에틸카바졸, 디아미노벤지딘, D-루시페린, 루시제닌(bis-N-methylacridinium nitrate), 레소루핀 벤질 에테르, 루미놀, 앰플렉스 레드 시약(10-acetyl-3,7-dihydroxyphenoxazine), HYR(pphenylenediamine-HCl and pyrocatechol), TMB(3,3,5,5-tetramethylbenzidine), ABTS(2,2-Azine-di[3-ethylbenzthiazoline sulfonate]), o-phenylenediamine(OPD) 또는 나프톨/피로닌이 발색제로서 사용될 수 있다.
다음으로, 메틸그린 등으로 대조 염색을 한 후 현미경을 통해 낭충봉아 부패병 바이러스 특이적 프로브의 교잡여부를 확인함으로써 낭충봉아 부패병 바이러스의 감염상태와 병원체의 분포상황을 육안으로 확인하여 낭충봉아 부패병 바이러스에 의한 꿀벌의 낭충봉아 부패병을 신속하고 정확하게 진단할 수 있다.
본 발명에서는 바람직하게 ⅰ) 블로킹버퍼에 0.1 내지 10%로 희석된 알카라인 포스파테이즈 결합 항디곡시제닌을 조직절편상에 반응시키는 단계;
ⅱ) 상기 반응 후 조직절편을 말레익산 버퍼, 블로킹버퍼 및 검출버퍼로 처리하는 단계;
ⅲ) 검출버퍼에 희석시킨 니트로블루 테트라졸리움(NBT)과 5-브로모-4-클로로-3-인돌일포스파테이트(BCIP)를 조직절편상에 3 내지 4시간 반응시키는 발색단계; 및
ⅳ) 메틸그린으로 대조염색한 후 암갈색의 양성반응을 확인하는 단계;
를 포함하는 방법으로 조직절편내 낭충봉아 부패병 바이러스의 존재유무 관찰하였다.
본 발명의 일실시예에서는 서열번호 1의 염기서열로 표시되는 프로브를 이용하여 상기의 방법으로 낭충봉아 부패병 바이러스의 감염 여부를 진단하였으며, 그 결과, 도 3에 나타난 바와 같이 꿀벌 애벌레 조직에서 낭충봉아 부패병 바이러스가 존재하는 것이 관찰되었으며, 화살표에 표시된 것처럼 바이러스는 핵 내부가 아닌 세포질에 분포하는 것으로 확인되었다.
또한, 도 3a는 제3기 애벌레 단계를 관찰한 것으로, 바이러스는 오직 지방체 세포(fat body cell)의 일종인 영양세포(trophocyte; 화살표)에서만 관찰되었으며, 편도세포(oenocyte; 삼각형)에서는 확인되지 않았다. 도 3b은 꿀벌의 전용기(prepupal period) 단계를 관찰한 것으로, 바이러스는 오직 지방체 세포(fat body cell)의 일종인 유로사이트(urocyte; 화살표)에서만 관찰되었다.
도 4는 조직내 교잡법을 이용하여 낭충봉아 부패병 바이러스에 감염된 꿀벌의 애벌레 조직(a) 및 바이러스에 감염되지 않은 꿀벌의 애벌레 조직(b)을 비교한 데이터로, 본 발명의 조직내 교잡법을 이용한 진단 조성물 또는 진단방법을 이용하여 꿀벌의 애벌레가 낭충봉아 부패병 바이러스에 감염되었는지를 육안으로 쉽게 판단 가능한 것을 확인하였다.
본 발명은 또한, 상기 낭충봉아 부패병 바이러스 감염 진단용 조성물을 포함하는 낭충봉아 부패병 바이러스 감염 진단 키트를 제공하며, 상기 낭충봉아 부패병 바이러스 감염 진단 방법을 메뉴얼로 포함할 수 있다.
상기 키트는 상술한 서열번호 2 및 서열번호 3의 염기서열로 표시되는 프라이머 세트 또는 서열번호 1의 염기서열로 표시되는 프로브 이외에 다른 시약을 선택적으로 포함할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 키트가 핵산 증폭에 사용될 수 있는 경우에는 버퍼, 써머스 아쿠아쿠스(Taq), 써머스 써모필러스(Tth), 써머스 필리포르미스, 써미스 플라부스, 써모코커스 리터랄리스, 및 피로코커스 푸리오수스(Pfu) 등의 열에 안정한 DNA 중합효소, DNA 중합효소 보조인자, 및 데옥시리보뉴클레오티드-5-트리포스페이트와 같은 PCR 반응을 수행하는데 필요한 시약들을 선택적으로 포함할 수 있다. 상기 키트는 대체로, 전술한 구성성분들을 개별 패키징(separate packaging)하거나 또는 구획화하여 포함하도록 개조될 수 있다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
조직내 교잡법을 위한 프로브 제작
본 발명에서는 낭충봉아 부패병 바이러스 감염 여부 확인을 통한 꿀벌의 낭충봉아 부패병을 진단하기 위해 조직내 교잡법용 프로브를 제작하기 위해, 중합효소 연쇄반응(polymerase chain reaction, PCR)을 통해 교잡(hybridization)에 필요한 충분한 양의 타겟서열을 증폭시키고자 하였다.
먼저, 낭충봉아 부패병 바이러스의 특이적인 유전자(RNA)를 증폭하기 위하여 중합효소 연쇄반응를 실시하였다. 낭충봉아 부패병 바이러스에 감염된 꿀벌의 애벌레 및 성충을 파쇄한 다음, RNA 추출 키트(insect virus specific RNA extraction kit; ZR Tissue & Insect RNA MicroPrepTM(50 preps.) Zymo Research, 미국)를 이용하여 낭충봉아 부패병 바이러스의 RNA를 추출하였으며, 상기 추출한 바이러스 RNA를 역전사 PCR(reverse transcription PCR)을 통해 cDNA를 합성하였다.
상기 역전사 PCR 수행은 바이러스 RNA 추출물 2 ㎕에 DEPC-DW 3.5 ㎕, ×10 버퍼 2 ㎕, dNTP 2 ㎕, RNA 분해효소 저해제(RNase inhibitor) 0.5 ㎕, MuLV 역전사 효소(MuLV reverse transcriptase) 0.5 ㎕, 랜덤 헥사머(random hexamer) 0.5 ㎕을 첨가하여, 45℃에서 40분, 95℃에서 10분, 4℃에서 10분 동안 중합효소 연쇄반응을 수행하였다.
조직내 교잡법용 프로브 제작을 위해 상기 합성된 cDNA를 이용하여 낭충봉아 부패병 바이러스 서열을 일부를 증폭시켰으며, 증폭은 하기의 프라이머 세트를 이용하여 수행하였다.
[서열번호 2] 전방향 프라이머(forward primer)
5'-AAC AAC CGA TTC CTC AGT AG-3'
[서열번호 3]역방향 프라이머(reverse primer)
5'-TCT TCG TCC ACT CTC ATC AC-3'
상기 두 프라이머는 (주)바이오니아(한국)에 의뢰하여 합성 및 OPC 방법으로 정제하여 사용하였다. PCR을 위해서 1 ㎕ 전방향, 역방향 프라이머 (20pmol/㎕), 10 ㎕ 10×반응 버퍼[100mM Tris-HCl(pH 8.3), 400mM 염화칼륨(KCl), 15mM 염화마그네슘(MgCl2), 5 ㎍/㎖ 활성 소혈청 알부민(activated BSA)], 500μM 디옥시뉴클레오타이드, 1.5U Taq 중합효소를 각각 넣고, 100 ㎕의 반응량이 되도록 멸균된 증류수를 첨가하여 섞은 후 써모사이클러(Thermocycler; Perkin Elmer사, Norwalk, USA)를 이용하여 95℃ 5분간 변성(denaturation)시킨 후 95℃에서 30초, 58℃에서 30초, 72℃에서 30초를 35 주기로 시행한 후 72℃에서 신장 반응(elongation)를 10분 동안 실시하는 중합효소 연쇄반응을 수행하였다.
도 1에 나타난 바와 같이, 상기 중합효소 연쇄반응의 산물은 1% 아가로즈겔에 전기영동하여 258bp의 밴드를 확인하였으며, 염기서열 분석 결과, 서열번호 1의 염기서열로 표시되는 것을 확인하였다.
다음으로, 위저드 PCR액(Wizard PCR preps; Promega Biotech사, Madison, WI, USA)을 이용하여 증폭된 DNA를 정제하고, DIG DNA 라벨링 & 검출키트(DIG DNA labeling & detection kit; Boehringer Mannheim사, 미국)를 사용하여 디곡시제닌(digoxigenin)으로 임의 표지(random labeling) 한 후, 나일론 막(nylon membrane)으로 표지된 프로브의 농도를 결정하여 조직내 교잡법 적용 시 그 분량을 결정하도록 하였다.
조직내 교잡 공정 수행
2-1 : 슬라이드 전처리 과정
낭충봉아 부패병 바이러스에 감염된 것으로 의심되는 애벌레와 성충 개체에 주사기를 이용하여 10% 중성 포르말린을 주입한 후 24시간 (1일) 동안 고정시킨 다음, 일반적인 조직 처리과정을 거쳐 파라핀 포매(paraffin embedding) 후 5 ㎛ 두께로 절편하여 슈퍼프로스트/플러스 슬라이드(Superfrost/Plus slide; Fisher Scientific사, 미국)에 부착시켜 상온에 보관하고, 조직절편을 크실렌(xylene)에 탈파라핀시키고 함수과정을 거친 후 인산 버퍼 식염수[phosphate-buffered saline; PBS, 0.01M, pH 7.4]에 5분 동안 반응시켰다.
2-2 : 표적 핵산의 노출과정
표적 핵산을 노출시키기 위해 0.2N 염산(HCl)에 20분 동안 처리하여 단백질을 제거한 후 200 ㎍/㎖의 프로티아제 K(Gibco BRL사, 미국)를 37℃에서 25분 동안 처리한 후 4% 파라포름알데하이드로 상온에서 10분 동안 고정하였다. 인산 버퍼 식염수로 2회 세척한 후 0.1M 트리에탄올아민 버퍼(pH 8.0) 에 0.25% 아세틱 안하이드라이드를 넣고 5분 동안 아세틸화 시킨 후, 0.25% 아세틱 안하이드라이드를 한 번 더 넣고 5분 동안 아세틸화를 재차 진행시켰다. 그 다음 2×소듐시트레이트 식염수[2×saline sodium citrate(1×SSC: 50 mM NaCl, 15mM sodium citrate, pH 7.0)]로 2회 세척 후 교잡(hybridization)을 수행하였다.
2-3 : 조직내 교잡( in situ hybridization ) 공정
프로브를 첨가하지 않은 교잡버퍼[2×SSC, 50% deionized formamide, 10mg salmon sperm DNA(Oncor, 미국), 0.02% sodium dodecyl sulfate(SDS), 1% Denhart's solution, 50% dextran sulfate solution]를 조직절편상에 잘 떨어뜨린 후 45℃에서 60분 동안 교잡전 반응을 수행한 후 2×SSC로 2회 세척하였다.
그 다음, 실시예 1에서 제작한 디곡시제닌(Digoxigenin)으로 표지된 서열번호 1의 염기서열로 표시되는 DNA 프로브를 500 ng/㎖의 농도가 되도록 표준 교잡 버퍼에 희석하여 30 ㎕ 정도를 슬라이드 조직 위에 떨어뜨린 후 커버슬라이드를 덮고 가장자리를 고무 시멘트(rubber cement)로 잘 봉하고, 45℃에서 15시간 동안 반응시켰다.
2-4 : 교잡 후 세척과정
교잡반응 후 커버슬라이드를 제거하고 상온의 4×SSC에 5분 동안 2회, 45℃ 2×SSC와 상온의 2×SSC에서 각각 10분씩 2회, 그리고 0.2×SSC에서 5분 동안 2회 세척한 다음, 말레익산 버퍼(100mM maleic acid, 150mM NaCl, pH 7.5)로 5분 동안 처리하고, 1×블로킹 버퍼(blocking buffer; Boehringer Manheim사, 미국)에서 40분 동안 처리하였다.
낭충봉아 부패병 바이러스 검출 공정
상기 조직내 교잡 공정을 수행한 조직절편에서 양성반응(낭충봉아 부패병 바이러스 감염)을 검출하기 위해 알카라인 포스파테이즈 결합 항디곡시제닌(alkaline phosphatase conjugated anti-digoxigenin; Boehringer Manheim사, Indianapolis, IN, USA)을 블로킹 버퍼에 1 : 200으로 희석하여 조직절편상에 잘 떨어뜨린 후 37℃에서 90분 동안 반응시켰다. 반응이 끝난 후 말레익산 버퍼에서 2회, 블로킹 버퍼에서 2회 처리 후 검출버퍼 (Buffer 3; 0.1M Tris-HCl, 0.1M NaCl, 0.05M MgCl2 , pH9.5)로 5분 동안 처리하였다.
발색을 위하여 알카라인 포스파테이즈의 기질인 니트로블루 테트라졸리움(NBT)과 5-브로모-4-클로로-3-인돌일포스파테이트(BCIP)를 검출버퍼에 희석하여 조직절편 위에 잘 떨어뜨린 후 상온에서 3 내지 4시간 동안 반응시켰다. 반응이 끝난 다음, 1mM EDTA에 여러 번 침적하여 반응을 중지시키고 0.5% 메틸그린으로 대조 염색한 후 증류수에 세척하여 완전히 말린 후 봉입(mounting)하여 현미경으로 관찰하여 암갈색의 양성반응을 확인하였다.
그 결과, 도 3에 나타난 바와 같이 꿀벌 애벌레 조직에서 낭충봉아 부패병 바이러스가 존재하는 것이 관찰되었으며, 화살표에 표시된 것처럼 바이러스는 핵 내부가 아닌 세포질에 분포하는 것으로 확인되었다. 이들 세포는 꿀벌 애벌레가 분화하면서 외각으로 유도된 지방체 세포(fat body cell)로 보이며 이들은 분열이 왕성한 세포로 향후 꿀벌의 다양한 기관으로 분화될 세포로 알려져 있다.
낭충봉아 부패병 바이러스는 제3기 애벌레를 관찰한 도 3a에 나타난 바와 같이, 최외각 큐틴질에서는 검출되지 않았으며, 오직 지방체 세포(fat body cell)의 일종인 영양세포(trophocyte; 화살표)에서만 관찰되었으며, 편도세포(oenocyte; 삼각형)에서는 확인되지 않았다. 이는 바이러스에 감염된 애벌레가 성충이 되지 못하고 조직이 붕괴되는 병인론을 뒷받침해줄 수 있다. 도 3b은 꿀벌의 전용기(prepupal period) 단계를 관찰한 것으로, 바이러스는 오직 지방체 세포(fat body cell)의 일종인 유로사이트(urocyte; 화살표)에서만 관찰되었다.
도 4는 조직내 교잡법을 이용하여 낭충봉아 부패병 바이러스에 감염된 꿀벌의 애벌레 조직(a) 및 바이러스에 감염되지 않은 꿀벌의 애벌레 조직(b)을 비교한 데이터로, 본 발명의 조직내 교잡법을 이용한 진단 조성물 또는 진단방법을 이용하여 꿀벌의 애벌레가 낭충봉아 부패병 바이러스에 감염되었는지를 육안으로 쉽게 판단 가능한 것을 확인하였다.
이상으로, 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
<110> SNU R&DB FOUNDATION <120> Composition for diagnosing sacbrood virus using in situ hybridization and method for diagnosing the same <130> 104827 <160> 3 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 258 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sacbrood virus probe <400> 1 aacaaccgat tcctcagtag tggaggaatc agaagagatc agtcttctga atatagttca 60 tgcgccagaa tctataatac caagttggag gcgcataatt gtggagtgga aagattatct 120 acaatcctta cctcttgtaa gaagacattt gatgcagtgg actcttatac cgatttgttt 180 aatggttggg tttctggtat gtatgttaac aagaatgtcc tctacaccga aatgtccagt 240 gatgagagtg gacgaaga 258 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sacbrood virus forward primer <400> 2 aacaaccgat tcctcagtag 20 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sacbrood virus reverse primer <400> 3 tcttcgtcca ctctcatcac 20

Claims (10)

  1. 낭충봉아 부패병 바이러스(sacbrood virus)에 특이적인 서열번호 1의 염기서열로 표시되는 조직내 교잡법(in situ hybridization)용 프로브를 포함하는 낭충봉아 부패병 바이러스 감염 진단용 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 프로브는 서열번호 2 및 서열번호 3의 염기서열로 이루어진 프라이머 세트를 이용하여 낭충봉아 부패병 바이러스 유전자를 증폭시켜 제조된 것을 특징으로 하는 낭충봉아 부패병 바이러스 감염 진단용 조성물.
  3. 제1항에 있어서, 상기 프로브는 디곡시제닌(digoxigenin)으로 표지한 것을 특징으로 하는 낭충봉아 부패병 바이러스 감염 진단용 조성물.
  4. 낭충봉아 부패병 바이러스 감염이 의심되는 꿀벌의 조직절편상에 청구항 제1항 내지 청구항 제3항 중 어느 한 항 이상의 낭충봉아 부패병 바이러스 감염 진단용 조성물을 적용시켜 조직내 교잡(in situ hybridization) 공정을 수행하는 것을 특징으로 하는 낭충봉아 부패병 바이러스 감염 진단 방법.
  5. 제4항에 있어서, 상기 조직내 교잡공정은,
    (a) 낭충봉아 부패병 바이러스 감염이 의심되는 꿀벌의 애벌레 또는 성충 개체를 파라핀 포매(paraffin embedding)시켜 조직절편을 제조한 다음, 상기 조직절편에 표적핵산을 노출시키는 단계;
    (b) 상기 표적핵산이 노출된 조직절편에 서열번호 1의 염기서열로 표시되는 조직내 교잡법(in situ hybridization)용 프로브를 포함하는 조성물을 처리하여 표적핵산과 프로브의 교잡을 유도하는 단계; 및
    (c) 상기 교잡되지 않은 프로브를 제거한 다음, 조직절편내 낭충봉아 부패병 바이러스의 존재유무를 검출하는 단계;
    를 포함하는 방법으로 수행하는 것을 특징으로 하는 낭충봉아 부패병 바이러스 감염 진단 방법.
  6. 제4항에 있어서, 상기 (a) 단계에서 조직절편은 낭충봉아 부패병 바이러스 감염이 의심되는 꿀벌의 애벌레 또는 성충 개체에 중성 포르말린을 주입하여 24 내지 48시간 고정시켜 파라핀 포매시킨 후, 3 내지 5㎛ 두께로 분절하여 제조하는 것을 특징으로 하는 낭충봉아 부패병 바이러스 감염 진단 방법.
  7. 제4항에 있어서, 상기 (a) 단계의 표적핵산 노출은,
    ⅰ) 조직절편에 염산(HCl)을 처리하는 단백질 제거단계;
    ⅱ) 프로티아제 K를 처리 후 파라포름알데하이드로 처리하는 고정단계; 및
    ⅲ) 아세틱 안하이드라이드를 처리하는 아세틸화 단계;
    를 포함하는 방법으로 수행하는 것을 특징으로 하는 낭충봉아 부패병 바이러스 감염 진단 방법.
  8. 제4항에 있어서, 상기 (b) 단계는 500 ng/㎖의 농도의 서열번호 1의 염기서열로 표시되는 조직내 교잡법(in situ hybridization)용 프로브가 포함된 조성물을 처리하여 94 내지 96℃에서 10분간 가열한 다음, 45℃에서 15 내지 20시간 반응시키는 것을 특징으로 하는 낭충봉아 부패병 바이러스 감염 진단 방법.
  9. 제4항에 있어서, 상기 (c) 단계의 조직절편내 낭충봉아 부패병 바이러스의 존재유무 검출은,
    ⅰ) 블로킹버퍼에 0.1 내지 10%로 희석된 알카라인 포스파테이즈 결합 항디곡시제닌을 조직절편상에 반응시키는 단계;
    ⅱ) 상기 반응 후 조직절편을 말레익산 버퍼, 블로킹버퍼 및 검출버퍼로 처리하는 단계;
    ⅲ) 검출버퍼에 희석시킨 니트로블루 테트라졸리움(NBT)과 5-브로모-4-클로로-3-인돌일포스파테이트(BCIP)를 조직절편상에 3 내지 4시간 반응시키는 발색단계; 및
    ⅳ) 메틸그린으로 대조염색한 후 암갈색의 양성반응을 확인하는 단계;
    를 포함하는 방법으로 수행하는 것을 특징으로 하는 낭충봉아 부패병 바이러스 감염 진단 방법.
  10. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항 이상의 낭충봉아 부패병 바이러스 감염 진단용 조성물을 구성성분으로 포함하는 낭충봉아 부패병 바이러스 감염 진단 키트.
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RU2735869C1 (ru) * 2019-12-13 2020-11-09 Федеральное государственное бюджетное научное учреждение "Федеральный научный центр - Всероссийский научно-исследовательский институт экспериментальной ветеринарии имени К.И. Скрябина и Я.Р. Коваленко Российской академии наук" Способ определения вирусоцидного действия средств и способов борьбы с вирусом мешотчатого расплода пчел

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RU2735869C1 (ru) * 2019-12-13 2020-11-09 Федеральное государственное бюджетное научное учреждение "Федеральный научный центр - Всероссийский научно-исследовательский институт экспериментальной ветеринарии имени К.И. Скрябина и Я.Р. Коваленко Российской академии наук" Способ определения вирусоцидного действия средств и способов борьбы с вирусом мешотчатого расплода пчел

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