DE19630770C2 - Analyse der Genexpression einzelner Zellen - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Analyse der Gen­ expression von Zellen in verschiedenen Wachstumsstadien.

Ein derartiges Verfahren ist aus BRADY, G. et al. , "Analysis of gene expression in a complex differentiation hierarchy by global amplification of cDNA from single cells", Current Biology 5 Nr. 8 (1995), Seiten 909 bis 922 bekannt.

Ein ähnliches Verfahren ist aus CHENG, T. et al. , "Sequential Pattern of Regulatory Gene Expression as Single Progenitor Cells Undergo Specific Differentiation Programs", Blood 86 (1995): Nr. 10 (Supplement), Seite 1199, bekannt.

Unter dem Begriff "Genexpression" versteht man allgemein Vorgänge, die in einer Zelle ausgehend von der Nukleotidsequenz eines Gens bis zum fertigen Genprodukt (Protein) ablaufen. Sie umfassen die Umschreibung einer DNA-Sequenz in ein primäres RNA-Molekül (Transkription) sowie die Modifikation eines primären RNA-Moleküls in eine fertige mRNA (Prozessierung), die Synthese (Translation) eines Proteins aus der mRNA, sowie alle Modifika­ tionen, die am Protein vorgenommen werden.

Mehrere weit verbreitete Methoden zur Analyse der Genexpression sind aus der Literatur bekannt.

Diese gängigen Methoden zur Analyse der Genexpression umfassen einerseits die Analyse der fertigen Genprodukte, also der Proteine. In den meisten Fällen werden jedoch die mit einfacheren und schnelleren Methoden zu untersuchenden Nukleinsäuren, also die DNA oder RNA analysiert. Während aus der Sequenz der DNA einer Zelle nicht geschlossen werden kann, welche Gene zu einem gegebenen Zeitpunkt tatsächlich angeschaltet, d. h. exprimiert werden, entspricht die zelluläre RNA den tatsächlich exprimierten Genen.

Es gibt eine ganze Reihe von Standardmethoden zur Analyse zellulärer RNA. Die am weitesten verbreiteten sind der sogenannte "Northern Blot" und der sogenannte "Nuklease-Protection Assay". Mit diesen Methoden kann untersucht werden, ob Gene, von denen Teile bereits bekannt sein müssen, in einer bestimmten Zell­ population, einem bestimmten Gewebe oder einem spezifischen Entwicklungsstadium eines Organismus exprimiert werden.

Weitere Standardmethoden zur Analyse der Genexpression enthalten einen Schritt, in dem die zelluläre RNA in DNA umgeschrieben wird (Reverse Transkription oder RT). Diese Reaktion wird von dem aus Retroviren isolierbaren Enzym "RNA-abhängige DNA-Poly­ merase", auch "Reverse Transkriptase" genannt, katalysiert.

Die daraus hervorgehende DNA (cDNA oder Copy DNA) ist dann Standardklonierungsmethoden zugänglich. Meist wird die cDNA nach der reversen Transkription (RT) durch eine Polymerase Kettenreaktion, im folgenden PCR, verstärkt (amplifiziert). Die Kombination beider Verfahren wird meist als RT-PCR bezeich­ net.

Bei der PCR werden zwei Oligonukleotid-Primer benutzt, die die zu amplifizierende DNA-Sequenz flankieren. Mehrere Zyklen von DNA-Hitzedenaturierung, Annealing (Andocken) der Primer an ihre komplementäre Sequenz und Verlängerung der Primer durch die DNA-Polymerase werden hintereinander wiederholt. Die Primer hybridisieren an entgegengesetzte Stränge der Zielsequenz und sind so orientiert, daß die DNA-Synthese durch die DNA-Polymerase über die Region zwischen den Primern voranschreitet, so daß die Ziel-DNA verdoppelt wird. Da die entstehende, verdoppelte DNA-Sequenz an ihrem 3'-Ende ebenfalls komplementär zu den Primern ist, wird in jedem Zyklus die DNA, die im vorher­ gehenden Zyklus synthetisiert wurde, verdoppelt. Mit diesem Verfahren wird also eine spezifische Zielsequenz exponentiell vermehrt.

Bei allen gängigen Verfahren zur Analyse der Genexpression wird von großen Zellzahlen ausgegangen. Dies ist ganz besonders bei der Analyse auf der Protein-Ebene wichtig, da noch keine hoch­ sensitiven Methoden zum Nachweis von Proteinen zur Verfügung stehen.

Zum Nachweis von Nukleinsäuren sind dagegen wesentlich sensi­ tivere experimentelle Ansätze einsetzbar. Bei der PCR genügt bspw. theoretisch ein einziges DNA-Molekül, um daraus eine große Menge identischer DNA-Moleküle zu amplifizieren. Dies wird in der Praxis jedoch bei weitem nicht erreicht. Vor allem dann, wenn mit zellulärem Material gearbeitet wird, ist bei der Extraktion und Reinigung der zu verstärkenden DNA oder in DNA umzuschreibenden RNA nämlich mit großen Verlusten zu rechnen.

Werden nun große Zellzahlen benutzt, um die Analyse der Gen­ expression von Zellen zu untersuchen, so ist dies nur dann sinnvoll, wenn die Genexpression von etablierten, immortali­ sierten Zellinien untersucht werden soll. Solche sich unendlich teilenden Zellinien, die für einen unbegrenzten Zeitraum in Kultur gehalten werden können, liegen in einem undifferenzierten Stadium vor. Während diese Zellen einen hohen Grad an Homogenität aufweisen, ist mit einer großen Heterogenität vor allem dann zu rechnen, wenn Zellen aus einem Organismus isoliert und danach in der Zellkultur kultiviert werden (sogenannte Primärkulturen). Primärkulturen werden bspw. angelegt, wenn die Entwicklung und Differenzierung von Zellen untersucht werden soll, wenn Krank­ heiten aus Blut- oder Biopsiematerial diagnostiziert werden müssen, oder wenn der Einfluß von Arzneimitteln auf Zellen gemessen werden soll, da Primärkulturen eher der in vivo- Situation entsprechen als etablierte, immortalisierte Zellinien.

Primärkulturen weisen also einen hohen Grad an Heterogenität auf. Selbst wenn es gelingt, einzelne Zellen in Kultur zu nehmen, und diese dort zu kultivieren, bis größere Zellzahlen erreicht sind, so kann nicht mit einer koordinierten Genexpression dieser Zellen gerechnet werden. Weder der Zellteilungsrhythmus noch die Entwicklung und Differenzierung dieser Zellen sind synchroni­ siert. Daher sind bei der Analyse der Genexpression solcher Zellen keine homogenen und reproduzierbaren Ergebnisse zu erwarten, vor allem dann nicht, wenn hochsensitive molekular­ biologische Methoden eingesetzt werden. Da hier die Zellen, aus denen DNA oder RNA isoliert wird, kein definiertes Wachstums- oder Differenzierungsstadium aufweisen, ist keine Aussage darüber möglich, welche Gene zu spezifischen Wachstums- oder Differen­ zierungsstadien exprimiert werden.

Es wurden daher Methoden vorgeschlagen, mit denen die Gen­ expression in wenigen oder sogar einzelnen Zellen analysiert werden kann; siehe z. B. Ziegler, B.L., et al., "Single-Cell cDNA-PCR", Methods in Neurosciences 26 (1995), Seiten 62-74, beschrieben. Hier wurden die Methoden zur Isolierung der zellulären RNA sowie der Reversen Transkription und der an­ schließenden PCR für geringe Zellzahlen oder sogar einzelne Zellen adaptiert. Um trotz des geringen Ausgangsmaterials in der PCR-Reaktion Signale zu erhalten, muß jeder Schritt hoch­ effizient, d. h. ohne große Verluste ausgeführt werden. Vor allem der Schritt der Extraktion der RNA aus der bzw. den Zellen ist kritisch, da hier das Material für die darauffolgende Reverse Transkription und PCR-Reaktion bereitgestellt wird.

Bei dem eingangs genannten Dokument von Brady et al. wird ein Verfahren beschrieben, bei dem mehrere hämetopoetische Vorläufer­ zellen in Kultur genommen werden, die vier bis elf Zellen umfassende sogenannte Startkolonien bilden. Die Zellen der Startkolonien werden kultiviert, bis sie sich zwei- bis dreimal geteilt haben. Aus dem entstandenen Zellhaufen wird dann eine individuelle Zelle entnommen, deren Genexpression durch RT-PCR- Analyse untersucht wird. Weitere individuelle Zellen werden aus dem Zellhaufen isoliert und weiter kultiviert, bis sie sich ausdifferenziert haben. Der Zelltyp, in den sich die Zelle differenziert hat, wird anhand der Zellmorphologie bestimmt.

Bei diesem Verfahren ist nachteilig, daß sich die Zellen der Startkolonie bereits hinsichtlich ihres Wachstums- bzw. Differen­ zierungsstadiums unterscheiden können, so daß die Kolonie bereits sehr uneinheitlich sein kann, wenn eine individuelle Zelle zur Analyse der Genexpression entnommen wird. Daraus folgt, daß das Wachstumsstadium der analysierten Zelle nicht mit Sicherheit das Wachstumsstadium der übrigen Zellen repräsentiert. Daß die Startkolonien häufig uneinheitlich sind, zeigt sich an dem Befund, daß in rund 20% der Fälle nach Weiterkultivierung individueller weiterer Zellen unterschiedlich differenzierte Kolonien entstehen. Daher kann das Genexpressionsmuster der analysierten Zelle nicht einem bestimmten Differenzierungsstadium zugeordnet werden.

In dem eingangs erwähnten Dokument von CHENG et. al. wird der Einsatz der für einzelne Zellen adaptierten Analyseverfahren zur Analyse der Genexpression von hämatopoetischen Zellen und deren Differenzierung beschrieben. Hämatopoetische Stamm- bzw. Vorläuferzellen werden in vitro kultiviert, so daß Kolonien entstehen. Daraus werden individuelle Zellen isoliert und deren Genexpression durch die RT-PCR analysiert.

Dabei wird versucht, aus dem Genexpressionsmuster der einzelnen Zelle auf den Wachstums- und Differenzierungszustand der Kolonie zu schließen. Dies ist jedoch nicht möglich, da, wie oben schon erwähnt, Zellen innerhalb einer Kolonie einer Primärkultur heterogen sind und sich in keiner Weise synchronisiert teilen. So kann nicht entschieden werden, ob Zellen, die zu verschiedenen Zeitpunkten aus der Kolonie isoliert werden, sich tatsächlich bezüglich ihres Wachstumsstadiums unterscheiden, d. h. ob sie sich tatsächlich unterschiedlich oft geteilt haben. Auch hinsichtlich ihres Differenzierungsstadiums ist keine Aussage möglich, da jede Zelle innerhalb der Kolonie ein individuelles Stadium aufweisen kann.

Zudem ist die Isolierung einzelner Zellen aus einem Zellhaufen zeit- und arbeitsaufwendig und erfordert diffizile Geräte zur Mikromanipulation. Die Isolation einzelner Zellen aus einem Zellhaufen kann nur von gut ausgebildeten, erfahrenen Fachkräften erfolgreich durchgeführt werden.

Ein weiteres Problem der von Cheng et al. angewandten Methode liegt darin, daß Zellen im Inneren einer Kolonie mit Nährstoffen und Wachstumsfaktoren, die in Primärkulturen immer essentiell für das Überleben der Zellen sind, unterversorgt sein können.

Eine Unterversorgung kann wiederum zu einer veränderten Gen­ expression führen. So können die Analyseergebnisse verfälscht werden, wenn eine Zelle aus dem Inneren einer Kolonie analysiert wird, denn diese repräsentiert in keiner Weise den Gesamtzustand der Primärkultur.

Vor diesem Hintergrund ist es Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren bereitzustellen, mit dessen Hilfe die Genexpression von Zellen, die in einem definierten Wachstumsstadium vorliegen, auf einfache und reproduzierbare Weise analysiert werden kann.

Erfindungsgemäß wird die Aufgabe dadurch gelöst, daß bei dem eingangs erwähnten Verfahren zur Analyse der Genexpression einzelner Zellen folgende Schritte vorgesehen sind:

• a) Inkulturnahme einer einzelnen Zelle,
• b) Abwarten, bis die Zelle sich in zwei oder vier Geschwisterzellen geteilt hat,
• c) Entnahme von zumindest einer Geschwisterzelle und Analyse ihrer Genexpression, sowie
• d) Entnahme einer weiteren Geschwisterzelle und Verwendung dieser Zelle gemäß Schritt a).

Bei diesem Verfahren wird von einer einzigen Zelle ausgegangen, der nur erlaubt wird, durch Zellteilung zwei oder vier Geschwi­ sterzellen zu erzeugen, von denen eine oder zwei direkt bezüglich ihrer Genexpression analysiert werden.

Dies kann durch die Untersuchung der zellulären Proteine geschehen, bspw. durch eine auf spezifischen Antikörpern beruhende Immunzytochemie der einzelnen Zellen, oder durch Analyse der zellulären Nukleinsäuren. Hier ist z. B. die direkte Analyse der RNA durch Sequenzierung oder deren Amplifikation über RNA-abhängige RNA-Polymerasen möglich.

Das neue Verfahren hat den erheblichen Vorteil, daß keine Inhomo­ genität und kein "Rauschen" des Meßergebnisses auftreten kann, weil die Genexpression nur einer einzigen Zelle untersucht wird.

Darüber hinaus ist die untersuchte Zelle bezüglich ihres Wachstumsstadiums definiert, denn die Anzahl der Zellteilungen ist genau bekannt.

Hierin liegt ein wesentlicher Unterschied und Vorteil zu den von BRADY et al. und von CHENG et al. beschriebenen Verfahren.

Die Geschwisterzelle der analysierten Zelle darf sich nämlich erneut teilen, und eine der daraus hervorgehenden neuen Geschwi­ sterzellen wird erneut bezüglich ihrer Genexpression analysiert. Wird dieses Verfahren mehrfach wiederholt, so ist von jeder analysierten Zelle bekannt, wie oft sie sich in Kultur bereits geteilt hat. Damit geht einher, daß sie in einem diskreten Entwicklungs- bzw. Differenzierungsstadium vorliegt, so daß nun eine eindeutige Zuordnung zwischen Genexpression und Wachstums- sowie Differenzierungsstadium möglich ist.

Somit wird die Aufgabe vollkommen gelöst.

In einer Weiterbildung des neuen Verfahrens ist es bevorzugt, wenn eine dritte Geschwisterzelle entnommen und diese Geschwi­ sterzelle für eine morphologische Kontrolle kultiviert wird.

Hierbei ist es von Vorteil, daß dadurch eine morphologische Kontrolle der Zellen möglich wird.

Bei einer morphologischen Kontrolle wird aufgrund des Aussehens der Zellen im Mikroskop, also der Zellgestalt, -größe, ihrem Anheften am Boden der Zellkulturschale oder dem Floaten im Zellkulturmedium oder dem Nachweis morphologischer Marker, wie bspw. spezifischer Proteine, kontrolliert, welcher Zelltyp vorliegt. Dies ist besonders dann wichtig, wenn die in Kultur genommene Zelle sich zu einem ganz spezifischen Phänotyp ausdifferenzieren soll.

Außerdem kann hier beobachtet werden, wie oft sich die Zelle insgesamt teilen kann, d. h. wie viele Zellteilungen sie tat­ sächlich in Kultur durchführen kann. Ist die Zelle nur zu einer begrenzten Anzahl von Zellteilungen befähigt, so ist es sinnvoll, genau so viele individuelle Analysen der Genexpression bei einzelnen Geschwisterzellen, im folgenden "Geschwisterzell­ analyse", vorzunehmen, wie Zellteilungen möglich sind. Mit jedem Schritt dieses Verfahrens kann dann ein definierter, diskreter Schritt des Zellwachstums sowie der Zellentwicklung und- differenzierung gesondert analysiert werden.

Zur Analyse der Genexpression einer Geschwisterzelle ist es bevorzugt, wenn die folgenden Schritte durchgeführt werden:

• 1. Lyse der Geschwisterzelle,
• 2. Isolierung von RNA aus dem Lysat,
• 3. Reverse Transkription der isolierten RNA in DNA,
• 4. Verstärkung der DNA durch eine Polymerase Kettenreaktion und Analyse der Verstärkungsprodukte.

Hier ist es von Vorteil, daß die Analyse der Genexpression auf der Grundlage der zellulären RNA, die direkt die exprimierten Gene repräsentiert, beruht. Die RNA kann nämlich mit der beschriebenen RT-PCR in DNA umgeschrieben und danach amplifiziert werden, so daß trotz der geringen Ausgangsmenge an RNA ein starkes und eindeutiges Meßsignal erhalten wird.

Die Isolierung der RNA aus dem Zellysat kann dabei durch einfache Phenol/Chloroform-Extraktion oder über Dichtegradientenzentri­ fugation erfolgen.

In einer bevorzugten Ausgestaltung erfolgt die Isolation der RNA jedoch über Dichtegradientenzentrifugation.

Diese Methode hat den Vorteil, daß auch sehr geringe Mengen an RNA mit großer Reinheit aus einem Zellysat isoliert werden können.

Es ist außerdem bevorzugt, die RNA von genomischer DNA zu befreien.

Die Abtrennung auch von Resten der genomischen DNA, die u. U. mitisoliert wurde, ist von Vorteil, da auch kleine Mengen von DNA bei der nachfolgenden PCR-Reaktion störend wirken können. Sind DNA-Sequenzen im Ansatz enthalten, die den in der PCR eingesetzten Primern komplementär sind, so ist nach erfolgter PCR-Reaktion nicht mehr zu entscheiden, ob das amplifizierte Fragment von genomischer DNA oder von zellulärer RNA stammte. Nur die zelluläre RNA spiegelt das tatsächlich exprimierte Gen wider.

Dabei ist es besonders bevorzugt, wenn die Entfernung der genomischen DNA mit Hilfe immobilisierter DNAse durchgeführt wird.

Die Verwendung von immobilisierter DNAse zur Entfernung genomi­ scher DNA erlaubt auf vorteilhafte Weise die Wiedergewinnung der RNA mit hoher Ausbeute, besonders dann, wenn DNAse-Säulen verwendet werden. Hier müssen keine freien DNAse-Moleküle aus dem Ansatz entfernt werden, die Lösung mit der von DNA befreiten RNA wird vielmehr als Säuleneluat gewonnen und kann dann direkt weiterverwendet werden.

In einer bevorzugten Ausgestaltung wird die mRNA isoliert.

Dabei ist es vorteilhaft, daß spezifisch die mRNA von den übrigen zellulären RNAs, der rRNA und der tRNA, abgesondert wird, da so die Erzeugung von falsch positiven Signalen in der darauf­ folgenden PCR-Reaktion minimiert wird. tRNAs und rRNAs enthalten nämlich häufig repetitive Sequenzen, an die die in der PCR eingesetzten Primer u. U binden können, was zu falsch positiven Aussagen führen kann.

In einer bevorzugten Ausgestaltung wird die mRNA mit Hilfe von immobilisierten Oligonukleotiden isoliert.

Dabei ist es vorteilhaft, als Oligonukleotide OligodT-Sequenzen einzusetzen, da viele mRNAs an ihrem 3'-Ende mit einem polyA- Schwanz versehen sind. Es ist außerdem vorteilhaft, die OligodT- Sequenzen an eine geeignete Matrix zu immobilisieren, um so festphasengekoppeltes OligodT zu erhalten, an das wiederum die polyA-Schwänze der mRNAs binden können. Alle übrigen RNAs sowie alle übrigen Bestandteile des Zellysats verfügen nicht über polyA-Schwänze, werden nicht an die OligodT-Matrix gebunden und können deshalb verworfen werden. Die mRNA kann hingegen bspw. durch verminderte Salzkonzentrationen spezifisch eluiert werden, so daß im Eluat dann hochreine mRNA enthalten ist.

In einer weiteren bevorzugten Ausgestaltung wird die Zellyse, die Isolierung von RNA aus dem Lysat sowie die Reverse Trans­ kription der isolierten RNA in einem einzigen Reaktionsgefäß durchgeführt.

Dieses Verfahren hat den Vorteil, daß die durch mehrfaches Überführen des Reaktionsansatzes in neue Reaktionsgefäße oder durch Schritte über Säulen auftretenden Verluste hier nicht vorkommen können, so daß eine größtmögliche Ausbeute gewähr­ leistet ist. Eine Entfernung der genomischen DNA kann in diesem Fall mit freier DNAse durchgeführt werden, wobei die Reaktion z. B. durch die Zugabe von EDTA abgestoppt werden kann. EDTA fängt die für die Funktion der DNAse essentiellen Magnesiumionen ein. Außerdem kann die DNAse durch einen Hitzeschritt inaktiviert werden. Das Durchführen mehrerer Reaktionsschritte in einem Gefäß erhöht nicht nur die Ausbeute, sondern spart auch Zeit und vereinfacht das Verfahren erheblich.

In einer bevorzugten Ausgestaltung der Erfindung werden in der PCR für bestimmte DNA-Sequenzen spezifische Primer eingesetzt werden.

Dieses Verfahren hat den Vorteil, daß auch bei geringen Ausgangs­ mengen an cDNA durch den in der PCR auftretenden Verstärkungs­ effekt klare Signale erhalten werden. Außerdem sind die amplifi­ zierten Produkte, die auch PCR-Produkte genannt werden, in so hohen Mengen vorhanden, daß sie direkt in weitere Analysen, wie bspw. Klonierungsreaktionen, eingesetzt werden können.

Soll die Expression bestimmter, bereits bekannter Gene analysiert werden, so setzt man in die PCR für diese Gene spezifische Primer ein. Ergibt die PCR-Reaktion ein amplifiziertes Produkt, so war das Gen in der analysierten Zelle exprimiert, denn es war als RNA-Transkript in der Zelle enthalten. Werden nun mit Hilfe jeweils spezifischer Primer eine ganze Reihe von interessierenden Genen in aufeinanderfolgenden Zyklen der Geschwisterzellanalyse analysiert, so ergeben sich für bestimmte Wachstumsstadien spezi­ fische Expressionsmuster.

Mit Hilfe des neuen Verfahrens kann damit erstmals ein gegebenes Expressionsmuster einem diskreten Wachstums- und Differen­ zierungsstadium einer definierten Zelle zugeordnet werden.

Zur Untersuchung der Expression noch nicht bekannter Gene ist es bevorzugt, eine sogenannte "sequenzunabhänge RT-PCR" der einzelnen Geschwisterzellen durchzuführen.

Als Ausgangsmaterial hierfür kann die isolierte Gesamt-RNA oder das gesamte Zellysat verwendet werden. Es wird zunächst eine Reverse Transkription durchgeführt. Die 3'-Enden der cDNA- Moleküle werden einer sogenannten "Tailing-Reaktion" unter Verwendung des Enzyms Terminale Transferase modifiziert. In dieser Reaktion werden an das 3'-Ende Nukleotidsequenzen ange­ hängt, die nur ein einziges Nukleotid, bspw. ein Guanosin oder ein Adenosin, enthalten, und zwar vielfach wiederholt hinter­ einander. Die in der nachfolgenden PCR-Reaktion eingesetzten Primer bestehen dann aus einer Wiederholungseinheit des zu der in der Tailing-Reaktion angehängten Sequenz komplementären Nukleotids.

Dieses Verfahren hat den Vorteil, daß eine Vielzahl von PCR- Produkten erhalten werden kann, die durch Klonieren und Sequen­ zieren in Standardreaktionen weiter analysierbar sind. Es ist außerdem vorteilhaft, daß vor der Analyse keine Nukleotid­ sequenzen bekannt sein müssen.

In einer alternativen Ausgestaltung ist es bevorzugt, die sogenannte "Differential Display RT-PCR"-Methode durchzuführen.

Diese Methode dient dazu, exprimierte Gene zu identifizieren, die in verschiedenen Zellen unterschiedlich (differentiell) exprimiert werden. Dazu werden zwei Geschwisterzellen aus verschiedenen Runden der Geschwisterzellanalyse getrennt voneinander analysiert. Die Zellen werden lysiert, die RNA isoliert und eine Reverse Transkription durchgeführt, wie es schon oben beschrieben wurde. Danach wird jeweils eine PCR- Reaktion durchgeführt, wobei bestimmte, randomisierte (zu­ fällige) Primer eingesetzt werden. Dieses Verfahren ist in der Literatur bereits beschrieben: siehe D. Bauer et. al. "Identi­ fication of Differentially Expressed mRNA Species by an Improved Display Technique (DDRT-PCR)", Nucleic Acids Research, 21 No. 18 (1993), Seiten 4272-4280, und P. Liang et al. "Distribution and Cloning of Eucaryotic mRNAs by Means of Differential Display: Refinements and Optimization, Nucleic Acids Research", 21 No. 14, (1993), Seiten 3269-3275. Die in der PCR-Reaktion erhaltenen PCR-Produkte werden in diesem Verfahren auf Sequenzgele auf­ getragen, wodurch eine sehr gute Auftrennung der PCR-Produkte möglich ist. Das Bandenmuster, das mit der RNA aus verschiedenen Geschwisterzellen erhalten wurde, wird dann miteinander ver­ glichen. Treten unterschiedliche Banden auf, so können diese Banden aus dem Sequenzgel extrahiert, erneut mittels PCR amplifiziert und dann mit Hilfe von Standardmethoden kloniert und identifiziert werden.

Dieses Verfahren hat den Vorteil, daß analysiert werden kann, ob verschiedene, noch nicht bekannte Gene sich in verschiedenen Wachstums- und Entwicklungsphasen einer Zelle voneinander unterscheiden. Von besonderem Vorteil ist es, daß hier noch nicht bekannte Gene gefunden und einer Analyse mit Standard­ methoden zugänglich gemacht werden können.

Allgemein ist es bevorzugt, wenn hämatopoetische Stamm- oder Vorläuferzellen in die Geschwisterzellanalyse eingesetzt werden.

Solche Zellen können aus humanem Gewebe isoliert und nach Vereinzelung in Kultur genommen werden. Durch das neue Verfahren ist es nun möglich, zu analysieren, welche bereits bekannten oder noch zu identifizierenden Gene zu bestimmten, definierten Wachstums- bzw. Differenzierungsstadien exprimiert werden.

Hier ist von Vorteil, daß definierte Expressionsmuster nun bestimmten Stadien der Entwicklung hämatopoetischer Zellen bis hin zur Differenzierung zugeordnet werden können.

Dies kann besonders vorteilhaft in der Diagnose von Blutbildungs­ störungen oder Tumoren von Blutzellen, sogenannten Leukämien, eingesetzt werden. Solche diagnostischen Tests müssen häufig in großer Zahl in Diagnostiklabors, die sich z. B. in Kranken­ häusern befinden, durchgeführt werden.

Durch das neue Verfahren kann die Diagnose schnell und reprodu­ zierbar auch in Standardlabors durchgeführt werden. Dabei ist besonders vorteilhaft, daß in diesem Verfahren nur sehr wenig Ausgangsmaterial, d. h. nur wenige Zellen, benötigt werden und dem Patienten daher nur geringe Mengen an Biopsiematerial entnommen werden müssen.

Mit dem Verfahren der Geschwisterzellanalyse ist es außerdem möglich, herauszufinden, welcher Zelltyp bei einer bestimmten Leukämie entartet ist. Der Zelltyp entscheidet über die jeweilige Therapie und wurde bisher durch eine rein morphologische Untersuchung des Biopsie- oder Blutmaterials entschieden. Durch die Analyse des Expressionsmusters einzelner Tumorzellen in der Geschwisterzellanalyse hat man dagegen einen reproduzierbaren und verläßlichen Parameter, um sowohl den Zelltyp als auch das Zellstadium der Tumorzelle zu bestimmen. Dabei ist besonders vorteilhaft, daß das Expressionsmuster, das mit dem neuen Verfahren gewonnen wird, ein objektiver Parameter ist, der nicht wie die morphologische Begutachtung von Zellen von der Erfahrung eines Arztes abhängig ist.

Auch bei weiteren Tumoren und anderen Krankheiten können mit Hilfe des erfindungsgemäßen Verfahrens Gene identifiziert oder Expressionsmuster gefunden werden, die typisch für diese Krankheiten sind. Dabei können Zellen von erkrankten Personen mit Zellen von gesunden Personen verglichen werden. Wiederum ist besonders vorteilhaft, daß nur wenig Ausgangsmaterial, also Blut- oder Biopsiematerial von Erkrankten, eingesetzt werden muß.

Sind neue Gene erst gefunden, die mit bestimmten Krankheiten in Verbindung stehen, so können daraus spezifische kommerziell vermarktbare Sonden hergestellt werden, mit Hilfe derer andere, wesentlich einfachere Diagnoseverfahren etabliert werden können.

Das Verfahren der Geschwisterzellanalyse kann für spezifische Zelltypen oder bestimmte Krankheiten standardisiert werden, so daß diese in Diagnostiklabors eingesetzt werden können.

Da das neue Verfahren sich aus mehreren immer gleich ablaufenden Schritten zusammensetzt, kann das Verfahren auch in Routinelabors von angelernten Kräften durchgeführt werden. Aufgrund seiner breiten Anwendbarkeit z. B. in der Diagnostik verschiedener Tumoren kam das Verfahren auch von einem Dienstleistungsbetrieb außerhalb eines Krankenhauses angeboten werden.

Findet man mit Hilfe dieses Verfahrens einzelne Gene, die ganz spezifisch für bestimmte Krankheiten sind, so lassen sich daraus darüber hinaus Ansätze für gentherapeutische Verfahren ent­ wickeln.

In einer weiteren Ausgestaltung ist es bevorzugt, wenn bei der Geschwisterzellanalyse von hämatopoetischen Stamm- oder Vor­ läuferzellen ein Zellkulturmedium verwendet wird, das Wachstum und Differenzierung der Zellen beeinflußt.

Der Vorteil eines solchen Zellkulturmediums ist es, die häma­ topoetischen Stamm- oder Vorläuferzellen in ganz bestimmte Zellreihen hineinzudrängen. In vivo differenzieren solche Zellen in Erythrozyten, Megakaryozyten, Granulozyten, Monozyten oder dentritische Zellen. Wird ein Zellkulturmedium einge­ setzt, mit Hilfe dessen die jeweilige Zellinie ausgewählt werden kann, so kann die Genexpression nicht nur zu definierten Wachstumsstadien, sondern auch entlang einer definierten Differenzierungslinie verfolgt werden.

Die Erfindung betrifft auch einen Kit zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens, in dem ein Zellkulturmedium sowie Reagenzien zur Isolation der zellulären RNA, zur reversen Transkription der RNA und zur PCR-Reaktion enthalten sind.

Dieser Kit bietet den Vorteil, das erfindungsgemäße Verfahren, das aus einer Reihe von Reaktionsschritten besteht, wobei eine Vielzahl verschiedener Reagenzien notwendig sind, einem Diagno­ stiklabor zugänglich zu machen. So kann das Verfahren zeitsparend und ohne hohen Vorbereitungsaufwand durchgeführt werden. Die Verwendung eines Kits erhöht darüber hinaus die Reproduzier­ barkeit des Verfahrens.

Weitere Vorteile ergeben sich aus der Beschreibung und der beigefügten Zeichnung.

Es versteht sich, daß die vorstehend genannten und die nach­ stehend noch zu erläuternden Merkmale nicht nur in der jeweils angegebenen Kombination, sondern auch in anderen Kombinationen oder in Alleinstellung verwendbar sind, ohne den Rahmen der vorliegenden Erfindung zu verlassen.

Ein Ausführungsbeispiel der Erfindung wird nachfolgend in Verbindung mit der Zeichnung näher erläutert.

Die einzige Figur zeigt schematisch eine Übersicht über das Verfahren der Geschwisterzellanalyse.

Eine einzelne Zelle 10 wird in einem Zellkulturmedium 11 in Kultur genommen. Die Zelle 10 teilt sich zweimal, so daß vier Geschwisterzellen 12, 13, 14 und 15 entstehen. Die Geschwister­ zellen 12 und 14 werden entnommen und einer Analyse 16 der Gen­ expression unterworfen.

Die Geschwisterzelle 13 wird entnommen und erneut einzeln so lange kultiviert, bis sie sich mehrfach geteilt hat. Der daraus entstehende Zellhaufen 17 dient der morphologischen Kontrolle. Diese ist vor allem dann notwendig, wenn in dem Verfahren Zellen untersucht werden, die in Kultur weiterdifferenzieren und nach mehreren Zellteilungen ein Endstadium erreichen, das mit einem bestimmten Phänotyp einhergeht.

Die übriggebliebene Zelle 15 wird in einen neuen Zyklus der soeben beschriebenen Geschwisterzellanalyse eingebracht. Sie wird einzeln kultiviert, bis sie sich zweimal in die Geschwister­ zellen 18, 19, 21 und 22 geteilt hat. Die Zellen 18 und 21 werden entnommen, um sie einer Analyse 16 der Genexpression zu unter­ werfen. Die Geschwisterzelle 19 wird entnommen und so lange kultiviert, bis sie einen Zellhaufen 17 gebildet hat. Dieser dient erneut der morphologischen Kontrolle. Die übriggebliebene Geschwisterzelle 22 wird einem erneuten Zyklus der Geschwister­ zellanalyse unterworfen. Sie wird kultiviert, bis sie sich in die Geschwisterzellen 23, 24, 25 und 26 geteilt hat. Die Geschwisterzellen 23 und 25 werden entnommen, um eine Analyse 16 ihrer Genexpression durchzuführen. Die Geschwisterzelle 24 wird so lange einzeln kultiviert, bis sie sich mehrfach zu einem Zellhaufen 17 geteilt hat. Dieser dient der morphologischen Kontrolle. Die übriggebliebene Zelle 26 wird einem neuen Zyklus der Geschwisterzellanalyse ausgesetzt.

Die Erfindung wird nachfolgend anhand zweier konkreter Ausfüh­ rungsbeispiele näher erläutert.

Beispiel 1: Geschwisterzellanalyse von hämatopoetischen Stamm­ zellen.

Hämatopoetische Stamm- oder Vorläuferzellen werden aus humanem Gewebe, bspw. aus Nabelschnurgewebe, gereinigt (Gabbianelli, M. et al. "Multi-Level Effects of FLT3 Ligand on Human Hemato­ poiesis: Expansion of Putative Stem Cells and Proliferation of Granulomonocytic Progenitors/Monocytic Precursors". Blood 86 (1995), Seite 1661). Die Zellen werden vereinzelt und jeweils als einzelne Zelle in Kultur genommen. Durch Auswahl des Zellkulturmediums kann die Entwicklung der Zelle beeinflußt werden. Dies wird bspw. durch Zusatz von hämatopoetischen Wachstumsfaktoren (HGFs) erreicht.

Die einzelne Stamm- bzw. Vorläuferzelle teilt sich zweimal, bis vier Geschwisterzellen entstanden sind (Zyklus 1 der Geschwisterzellanalyse). Zwei dieser Zellen werden in die Analyse der Genexpression (siehe unten) eingesetzt. Eine der übrig­ gebliebenen zwei Zellen wird wiederum einzeln in Kultur genommen und so lange weiterkultiviert, bis sie ein Endstadium (z. B. Ausdifferenzierung, Einstellung der Zellteilung) erreicht und einen Zellhaufen gebildet haben. Die Kultivierung dieser Zellen erfolgt im gleichen ursprünglichen Zellkulturmedium, so daß sie sich entlang der gewünschten Zellinie differenzieren. Die morphologische Kontrolle des Zellhaufens erlaubt die Überprüfung, ob die Differenzierung entlang der gewünschten Zellinie tat­ sächlich erfolgt ist.

Die vierte Geschwisterzelle wird in einen neuen Zyklus der Geschwisterzellanalyse eingespeist (Zyklus 2), wobei sie sich wiederum zweimal teilen darf. Mit den entstehenden Geschwister­ zellen wird wie für den ersten Zyklus beschrieben Verfahren.

Die Analyse der Genexpression umfaßt die folgenden Schritte:

Zunächst werden die Zellen lysiert, um einen Zellextrakt zu erhalten, in dem die zelluläre RNA enthalten ist. Aus dem Zellextrakt wird die zelluläre RNA isoliert. Um mögliche Reste genomischer DNA aus der isolierten RNA zu entfernen, kann in einem optionalen Schritt die genomische DNA mit Hilfe einer DNAse entfernt werden. Die zelluläre RNA kann direkt in die RT-PCR eingesetzt werden, oder es wird spezifisch die mRNA isoliert. Dazu stehen verschiedene Methoden zur Auswahl. Danach wird die isolierte mRNA oder zelluläre Gesamt-RNA mit Hilfe der Reversen Transkriptase in cDNA umgeschrieben (RT). In der anschließenden PCR-Reaktion kann die Expression bekannter Gene mit Hilfe von spezifischen Primern analysiert werden. Mit Hilfe der "sequenzunabhängigen PCR" und der "Differential Display-" Methode können aber auch noch unbekannte DNA-Sequenzen detektiert werden. Die in der PCR erhaltenen PCR-Produkte können dann mit molekularbiologischen Standardmethoden weiter analysiert werden.

Im einzelnen werden die Schritte wie folgt durchgeführt:

• 1. Zellyse:
  Die beiden Geschwisterzellen, deren Genexpression untersucht werden soll, werden in ein geeignetes Volumen eines Lysepuffers transferiert. Der Lysepuffer enthält 4 M Guanidinium-Thiocyanat, 25 mM Natriumcitrat, pH 5, 0,5% SDS und 0,1% β-Mercaptoethanol. Dieser Lysepuffer ist geeignet, zelluläre RNAsen zu inhibieren. Je 100 µl Zellysat werden 20 µg einer stabilisierenden RNA, bspw. E. coli rRNA, eingesetzt.
• 2. Isolation der zellulären RNA:
  Nach kräftigem Mischen des Zellysats wird dieses auf ein Cäsiumchlorid-Kissen (5, 7 M CsC1) in einem Mikroultra­ zentrifugationsröhrchen aufgebracht. Die Ultrazentrifugation erfolgt für sechs Stunden bei 45.000 upm in einem SW 60- Rotor. Die verwendeten Ultrazentrifugationsröhrchen müssen RNAse-frei sein, es können z. B. 0,3 ml silikonisierte Polyallumer-Röhrchen verwendet werden. Das RNA-Sediment wird in RNAse-freiem Wasser resuspendiert und mit Ethanol und Kaliumacetat gefällt. Nach der Fällung wird die RNA in RNAse-freiem Wasser resuspendiert.
• 3. Entfernung genomischer DNA
  In der isolierten Gesamt-RNA können Reste genomischer DNA enthalten sein. Diese kann in einem optionalen Schritt entfernt werden. Dazu werden DNAse-Säulen eingesetzt. Solche Säulen sind kommerziell erhältlich, z. B. von der Firma MOBITEC (Göttingen). Diese Säulen bestehen aus einer G3M- Matrix mit konjugierter DNAse I. Die aus einer Zelle isolierte RNA wird in 10 µl Puffer gelöst und auf die Säule aufgebracht. Die Säule wird für fünf Minuten inkubiert und dann durch Zentrifugation (drei Sekunden bei 500 × g) eluiert. Dieser Vorgang wird mehrfach (2 bis 8 mal) wiederholt. Im letzten Eluat befindet sich die nun DNA-freie RNA. Sie wird erneut mit Ethanol und Kaliumacetat präzi­ pitiert und nach der Fällung in RNAse-freiem Wasser gelöst.
  Die DNAse-Behandlung kann auch in Lösung, also ohne Benutzung von DNAse-Säulen, erfolgen. Dazu werden 0,1-1 U DNAse I für 15 Minuten bei Raumtemperatur in einem geeig­ neten Puffer inkubiert. Nach Verdau der genomischen DNA durch DNAse I wird die DNAse durch eine zehnminütige Inkubation bei 65°C hitzeinaktiviert.
• 4. Isolierung der mRNA
  Aus der isolierten Gesamt-RNA oder dem Zellysat, die optional durch DNAse-Behandlung von Resten genomischer DNA befreit wurden, kann spezifisch die mRNA isoliert werden. Sonstige zelluläre RNAs, hauptsächlich rRNA und tRNA, werden durch diesen Schritt abgetrennt.
  Zur Isolierung der mRNA aus dem Zellysat bzw. der zellulären Gesamt-RNA stehen mehrere Methoden zur Verfügung:
  • a) Abtrennung der mRNA durch biotinyliertes OligodT und Streptavidin-konjugierte paramagnetische Partikel
    Dieses Verfahren ist als "polyATract 1000 System" von der Firma PROMEGA-SERVA kommerziell erhältlich. Dieses Verfahren hat den Vorteil, daß direkt aus dem Zellysat die mRNA extrahiert werden kann. Dazu wird eine Zelle in 25 µl Guanidinium-Thiocyanat-Lösung (zur Zusammensetzung siehe Lysepuffer unter (1) auf Seite 20) lysiert und sofort gemischt. 50 µl eines auf 70°C erhitzten Verdünnungspuffers, der 5 pM bio­ tinyliertes OligodT enthält, wird zum Zellysat zugegeben. Nach Mischen wird das Homogenat für fünf Minuten bei 70°C inkubiert und dann bei 12.000 × g für 15 Minuten bei Raumtemperatur zentrifugiert. Der Überstand mit den mRNA-Biotin-Oligonukleotid-Hybriden wird abgenommen und mit 50 µl Streptavidin-konju­ gierten paramagnetischen Partikeln (SA-PMP) in 0,5 × SSC (75 mM Natriumchlorid, 7,5 mM Natriumcitrat) für fünf Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. In dieser Zeit bindet das Streptavidin an die biotinyl­ lierten Oligonukleotide, an die aufgrund ihrer Komplementarität zu den polyA-Schwänzen der zellulären mRNAs diese gebunden sind. Zur Isolierung der an die paramagnetischen Partikel gebundenen mRNA wird das Reaktionsgefäß in ein Magnetfeld eingebracht, so daß die paramagnetischen Partikel an der Gefäßwand des Reaktionsgefäßes anhaften. Der Überstand wird abge­ nommen. Die verbleibenden isolierten SA-PMP-mRNA- Komplexe werden sofort in 100 µl 0,5 × SSC re­ suspendiert. Aus dem abgenommenen Überstand kann durch erneute Zugabe von 50 µl SA-PMPs eine zweite mRNA- Extraktion durchgeführt werden. Die SA-PMP-mRNA- Komplexe in 0,5 × SSC werden dreimal im magnetischen Feld gewaschen, d. h. Einführung in das Magnetfeld und erneute Zugabe von 0,5 × SSC. Die gewaschenen SA-PMP-mRNA-Komplexe werden in RNAse-freiem Wasser (Gesamtvolumen 100 µl) voneinander dissoziiert. Die mRNA wird von den SA-PMPs dadurch getrennt, daß das Reaktionsgefäß erneut in das Magnetfeld eingeführt wird, und die paramagnetischen Partikel daher an der Gefäßwand anhaften. Der wäßrige Überstand, in dem die mRNA enthalten ist, wird abgenommen und mit Ethanol und Kaliumacetat gefällt.
  • b) Isolierung durch OligodT-konjugierte paramagnetische Partikel Dieses Verfahren ist als "Dynabeads mRNA Direktkit" von der Firma DYNAL kommerziell erhältlich. Zur Durch­ führung dieses Verfahrens wird auf das Protokoll der Firma DYNAL verwiesen.
  • c) Abtrennung der mRNA durch OligodT-konjugierte Latex­ partikel Dieses Verfahren ist als "Oligotex Direkt-mRNA-Kit" von der Firma QIAGEN kommerziell erhältlich.
    Nach Durchführung eines dieser Verfahren wird die mRNA erhalten, die von übrigen zellulären RNAs befreit wurde.
• 5. Reverse Transkription der isolierten RNA in cDNA:
  Die Umschreibung der RNA in DNA (cDNA) erfolgt mit dem Enzym Reverse Transkriptase. Dieses retrovirale Enzym kann z. B. aus dem Virus Moloney Murine Leukemia Virus (MMLV) gewonnen werden. Kommerziell erhältlich ist bspw. das Enzym rtTh DNA-Polymerase der Firma PERKIN ELMER CETUS. Die Reaktion läuft bei 37-42°C für eine Stunde ab.
• 6. Verstärkung der cDNA durch PCR
  • a) PCR mit spezifischen Primern
    5 µl der in Schritt 5 gewonnenen cDNA werden in 50 µl PCR-Puffer aufgenommen und in Gegenwart von 200 µM von jedem dNTP, 0,5 µM des Upstream und 0,5 µm des Downstream PCR-Primers sowie 1,25 U Taq Polymerase inkubiert.
    Die ausgewählten Primer richten sich nach den Genen, deren Expression analysiert werden soll. Bei Verwendung der oben erwähnten rtTh DNA-Polymerase erfolgt die cDNA-Synthese und die PCR-Reaktion in einem Ansatz, da dieses spezielle Enzym eine Doppel­ funktion aufweist, d. h. sowohl Reverse Transkriptase- als auch DNA-Polymerase-Aktivität aufweist.
  • b) Sequenzunabhängige PCR
    Diese Reaktion wird durchgeführt, wenn die Expression noch nicht bekannter Gene analysiert werden soll, oder wenn exprimierte Gene, die man noch nicht kennt, gefunden werden sollen.
    In dieser Reaktion werden die 3'-Enden der in Schritt 5 gewonnenen cDNA modifiziert (sogenannte "Tailing-Reaktion"). Dazu wird das Enzym Terminale Transferase sowie ein einziges Desoxynukleotid, z. B. dATP eingesetzt, so daß alle 3'-Enden viele Kopien eines einzigen Nukleotids (z. B. polyA) enthalten. Die Reaktion erfolgt für 60 Minuten bei 37°C. Sie wird durch eine zehnminütige Inkubation bei 70°C abgebrochen.
    Danach wird eine PCR-Reaktion mit oligodT-Primern durchgeführt, wie in Schritt a) beschrieben.
    Die Besonderheit der sequenzunabhängigen PCR liegt darin, daß nur ein einziger Primer für die PCR verwendet wird (OligodT-Primer). Nach entsprechender Durchführung der Tailing-Reaktion kann die sequenz­ unabhängige PCR jedoch auch mit zwei verschiedenen Primern durchgeführt werden, um ein direktionales Klonieren der erzeugten PCR-Produkte zu ermöglichen. Die Amplifikation erfolgt mit Hilfe der TaqPolymerase, wobei die Annealing-Temperatur bei z. B. 45°C liegt. Insgesamt werden 30-90 PCR-Zyklen durchgeführt.
    Mit Hilfe dieser sequenzunabhängigen PCR-Reaktion wird eine Vielzahl von PCR-Produkten erhalten, die das Expressionsmuster der beiden Ausgangszellen repräsentieren.
  • c) Differential Display-Methode
    Bei dieser Methode werden die Expressionsmuster von zwei verschiedenen Zellen miteinander verglichen, z. B. von Geschwisterzellen aus dem ersten Zyklus der Geschwisterzellanalyse und von Geschwisterzellen aus dem zweiten Zyklus der Geschwisterzellanalyse. Dabei geht es darum, herauszufinden, welche Gene bei beiden Zellen unterschiedlich (differentiell) exprimiert werden. Diese werden mit Hilfe dieses Verfahrens spezifisch detektiert und molekularbiologischen Analysen zugänglich gemacht.
    Voraussetzung zur Durchführung der DDRT-PCR ist zunächst die Erzeugung ausreichender sequenz­ unabhängiger RT-PCR-Produkte aus einer Zelle. An diesen werden randomisierte Primer (Primer mit zufälliger Sequenz) eingesetzt und die PCR unter spezifischen Bedingungen durchgeführt (beschrieben bei Bauer et al. "Identification of Differentially Expressed mRNA Species by an Improved Display Technique (DDRT-PCR)", Nucleic Acids Research 21 No. 18 (1993), Seiten 4272-4280). Die Produkte der DDRT-PCR werden in einem Sequenzgel aufgetrennt. Die Sequenzgele, die aus der Analyse der beiden verschie­ denen Zellen erhalten werden, werden miteinander verglichen. Diejenigen Banden, die auf beiden Sequenz­ gelen verschieden sind, entsprechen einem Genprodukt, das nur in einer spezifischen Zelle, nicht aber in der anderen Zelle, mit der die Zelle verglichen wird, exprimiert wird.
    Dieses Verfahren eröffnet die Möglichkeit, heraus­ zufinden, welche Gene zu bestimmten Wachstums- und Differenzierungsphasen an- oder abgeschaltet sind. Zudem können mit dieser Methode neue, noch nicht bekannte Gene gefunden werden, denn die im Sequenzgel aufgetrennten Produkte der DDRT-PCR können wieder­ gewonnen werden und durch molekularbiologische Standardmethoden weiter analysiert werden.
  • d) Quantitative RT-PCR
    Dieses Verfahren dient der Quantifizierung einzelner, bekannter mRNA-Transkripte. Dazu werden RNA-Delek­ tionsmutanten eingesetzt, die sich von der originalen mRNA (Wildtyp-mRNA) unterscheiden.
    In diesem Verfahren wird vor Beginn der RT-PCR der zellulären mRNA eine definierte menge einer mRNA- Deletionsmutante zugesetzt, die dann zusammen mit der zellulären RNA in der RT-PCR amplifiziert wird.
    Aus dem Vergleich der Bandenintensität oder der radioaktiven Markierung (falls zur RT-PCR radioaktiv markierte Nukleotide eingesetzt werden) der PCR- Produkte, die aus Deletionsmutanten und Wildtyp-RNA hervorgegangen sind, kann auf die Menge an Wildtyp-RNA geschlossen werden, denn die Menge an Deletions­ mutanten war ja bekannt.
• 7. Analyse der in Schritt 6 erhaltenen PCR-Produkte
  Die mit den verschiedenen Methoden aus Schritt 6 erhaltenen PCR-Fragmente können mit molekularbiologischen Standard­ verfahren weiter analysiert werden. Sie werden in Gelen aufgetrennt und können als Banden isoliert werden, oder sie können zur Erhöhung der Menge eines spezifischen PCR- Produkts re-amplifiziert werden. Die isolierten PCR-Produkte können kloniert und sequenziert werden, um herauszufinden, aus welchen Genen sie hervorgegangen sind. Die erhaltenen Sequenzen werden dabei mit den Sequenzen einer Datenbank (z. B. Gen Embl) verglichen. Stellt man fest, daß die ermittelte Sequenz noch nicht bekannt ist, so kann in cDNA- Banken mit Hilfe von Standardmethoden die vollständige Sequenz der cDNA und damit des exprimierten Gens ermittelt werden.

Beispiel 2: Geschwisterzellanalyse durch "whole Cell RT-PCR"

Einzelne hämatopoetische Stamm- bzw. Vorläuferzellen werden in Kultur genommen und weiterbehandelt, wie in Beispiel 1 beschrieben.

Die Analyse der Genexpression dieser Geschwisterzellen erfolgt durch die "Whole Cell RT-PCR", d. h., daß die Lyse, die Isolation der RNA und die Reverse Transkription in einem einzigen Reak­ tionsgefäß ablaufen.

Dazu wird die zu analysierende Einzelzelle in Lysepuffer (20 mM Tris/HCl, pH 8,3, 50 mM Kalimchlorid, 2,5 mM Magnesiumchlorid, 10 mM DTT, 0,5% NP 40) für eine Minute bei 65°C inkubiert und auf Raumtemperatur abgekühlt. Durch eine Zentrifugation bei 15.000 × g für wenige Sekunden werden die DNA-haltigen Zellkerne sedimentiert. Dieser Zentrifugationsschritt ist fakultativ. Danach wird der Überstand abgenommen. In diesem Überstand ist die zelluläre RNA enthalten.

Der Überstand kann optional mit DNAse I behandelt werden. In diesem Schritt können Reste genomischer DNA, die z. B. aus einzelnen lysierten Zellkernen stammen können, entfernt werden. In diesem Fall wird die DNAse nicht an ein Säulenmaterial immobilisiert. Die DNAse I-Behandlung erfolgt bei einer Kon­ zentration von 0,5 U/µl RNAse-freier DNAse für 15 Minuten bei Raumtemperatur. Danach wird die DNAse-Reaktion durch Zugabe von 2 mM EDTA für 10 Minuten bei 65°C inaktiviert.

Die Reverse Transkription erfolgt im gleichen Reaktionsgefäß und folgt dem Protokoll, das in Beispiel 1 beschrieben wurde.

Auch die PCR-Reaktionen erfolgen nach einem der in Beispiel 1 beschriebenen vorgestellten Verfahren.

Insgesamt machen diese beiden Beispiele deutlich, wie mit Hilfe der Geschwisterzellanalyse die Genexpression von Zellen in einem definierten Wachstums- und Differenzierungsstadium analysiert werden kann. Diese Methode eröffnet eine Vielzahl von Möglich­ keiten, vor allem im diagnostischen Bereich. Da auch neue Gene identifiziert werden können, können mit dieser Methode auch gentherapeutische und/oder pharmakologische Ansätze verfolgt werden.

Claims (15)

1. Verfahren zur Analyse der Genexpression von Zellen in verschiedenen Wachstumsstadien, mit den Schritten:

• a) Inkulturnahme einer einzelnen Zelle (10);
• b) Abwarten, bis die Zelle (10) sich in zwei oder vier Geschwisterzellen (14, 15) geteilt hat;
• c) Entnahme von zumindest einer Geschwisterzelle (14) und Analyse (16) ihrer Genexpression; und
• d) Entnahme einer weiteren Geschwisterzelle (15) und Verwendung dieser Zelle gemäß Schritt a).

2. Verfahren nach Anspruch 1, gekennzeichnet durch den weiteren Schritt

• a) Entnahme einer dritten Geschwisterzelle (13) und Kultivierung dieser Geschwisterzelle (13) für eine morphologische Kontrolle.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß Schritt c) die Unterschritte umfaßt:

• 1. Lyse der Geschwisterzelle (14),
• 2. Isolierung von RNA aus dem Lysat,
• 3. reverse Transkription der isolierten RNA in DNA,
• 4. Verstärkung der DNA durch eine Polymerase Ketten­ reaktion (PCR) und Analyse der Verstärkungsprodukte.

4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß in Schritt c2) die Isolation der RNA über Dichtegradienten­ zentrifugation erfolgt.

5. Verfahren nach Anspruch 3 oder 4, dadurch gekennzeichnet, daß in Schritt c2) die RNA von genomischer DNA befreit wird.

6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß die Entfernung der genomischen DNA mit Hilfe immobilisierter DNAse erfolgt.

7. Verfahren nach einem der Ansprüche 3 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß in Schritt c2) die mRNA isoliert wird.

8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß die mRNA mit Hilfe immobilisierter Oligonukleotide isoliert wird.

9. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Schritte c1), c2) und c3) in einem Reaktionsgefäß durchgeführt werden.

10. Verfahren nach einem der Ansprüche 3 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß in der PCR-Reaktion aus Schritt c4) für bestimmte DNA-Sequenzen spezifische Primer eingesetzt werden.

11. Verfahren nach einem der Ansprüche 3 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß in Schritt c4) eine "sequenzunabhängige RT-PCR" durchgeführt wird.

12. Verfahren nach einem der Ansprüche 3 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß in Schritt c3) eine "Differential Display RT-PCR11 durchgeführt wird.

13. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 12, dadurch gekennzeichnet, daß die eingesetzten Zellen hämatopoetische Stamm- oder Vorläuferzellen sind.

14. Verfahren nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß in den Schritten a) und b) ein Zellkulturmedium verwendet wird, das Wachstum und Differenzierung der Zellen beein­ flußt.

15. Kit zur Durchführung des Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 14, enthaltend ein Zellkulturmedium sowie Reagenzien zur Isolation der zellulären RNA, zur reversen Transkription der RNA und zur PCR-Reaktion.