DE69314469T2

DE69314469T2 - An einem festen Träger reversibel gebundene getrocknete Nucleinsäurehybridisierungsprobe, eine solche Probe verwendendes Verfahren und dafür geeigneter Kit

Info

Publication number: DE69314469T2
Application number: DE69314469T
Authority: DE
Inventors: Donald Leonard Nicholas Cardy
Original assignee: Cytocell Ltd
Current assignee: Cytocell Ltd
Priority date: 1992-01-18
Filing date: 1993-01-18
Publication date: 1998-03-26
Anticipated expiration: 2013-01-19
Also published as: ES2108259T3; DK0623177T3; ATE159053T1; AU3360393A; EP0623177B1; WO1993014223A1; JP3401722B2; GB9201073D0; JPH07502893A; DE69314469D1; EP0623177A1

Description

Gebiet der Erfindung

Die Erfindung betrifft Verfahren zur Durchführung von Nukleinsäurehybridisierungs-Assays, neue Zusammensetzungen, die bei diesen Assays verwendet werden, und Kits zum Durchführen dieser Assays.

Hintergrund der Erfindung

Nukleinsäurehybridisierungs-Assays finden zur Zeit viele verschiedene Anwendungen, insbesondere im Bereich des Nachweises und der Diagnose von Infektions- oder genetisch bedingten Krankheiten.
Der Nachweis oder die Diagnose von genetisch bedingten Krankheiten, einschließlich der Analyse von Chromosomen in Säugerzellen, macht es gewöhnlich notwendig, Zellen in Nährmedien in Gegenwart von Substanzen, die dazu bestimmt sind, das Fortschreiten des Zellzyklus bei der Mitose zu blockieren, wie z.B. Colchicin, zu kultivieren. In diesem Zustand sind die Chromosomen in Säugerzellen kondensiert und einfach durch Färben nachweisbar. Ohne eine Zellkultur kann ein kleiner Anteil an Zellen, die sich im Stadium der Mitose befinden, gefunden werden, jedoch je nach Zelltyp mit unterschiedlicher Schwierigkeit. So werden in Laboratorien der klinischen Cytogenetik routinemäßig zur Analyse von peripheren Blutzellen oder zur Analyse von Zellen aus Amniocentesisproben (Amniozyten) diese Zelltypen einige Wochen lang vor der Chromosomenanalyse kultiviert.
Standardverfahren zur Chromosomenanalyse machen das Anlagern fixierter Zellen auf Mikroskopierplättchen und das Beobachten von sich teilenden Zellen durch das Mikroskop notwendig. Während Chromosomen in Zellen, die sich teilen, einfach sichtbar sind, ist die Identifikation einzelneü Chromosomen schwieriger und erfordert gewöhnlich die Zuordnung von Chromosomenpaaren auf Basis der Größe und des G (Giemsa)-bindenden Musters. Das wird häufig durch Fotographieren einer Ansammlung gefärbter Chromosomen und anschließendem manuellem Zuordnen von Chromosomen, die ein Paar bilden, auf dem Photo bewerkstelligt. Ein beträchtlicher Aufwand ist häufig notwendig, um chromosomale Abnormitäten in Zellen zu identifizieren, z.B. die Translokationen eines Chromosomenbereichs mit einem anderen. Bei der 9:22- Translokation, verbunden mit chronischer myelogener Leukämie, muß der Cytogenetiker z.B. das verkürzte Chromosom 22, das mit einem Teil des Chromosoms 9 assoziiert ist (das "Philadelphia- Chromosom"), identifizieren. Weniger ausgeprägte Abnormitäten bei Chromosomen, wie kleine Deletionen oder Mutationen innerhalb der Gene, können nicht durch visuelle Standardverfahren zur Chromosomenanalyse identifiziert werden.
Das Verwenden von Hybridisierungsproben zur Chromosomenanalyse hat die Identifikation von einzelnen Chromosomen in Zellen, die sich teilen, und die Analyse von Abnormitäten, wie Translokationen, erheblich vereinfacht. Z.B. sind DNA-Proben entwickelt worden, die an centromere Regionen einzelner Chromosomen (van Dekken and Bauman, Cytogenet. Cell Genet., Band 48 (1988), Seiten 188-189) oder an spezifische Regionen entlang der Gesamtlänge von einzelnen Chromosomen (Pinkel et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Band 83 (1986), Seiten 2934-2938) hybridisieren. Hybridisierte DNA-Proben werden gewöhnlich durch Fluoreszenzmarkierung sichtbar gemacht, wodurch ein bestimmter Fluoreszenzsignal hervorgerufen wird, welches ein bestimmtes Chromosom oder Fragment eines Chromosoms identifiziert. Beim Mar kieren bestimmter Chromosomen kann durch Hybridisierungsproben die Notwendigkeit, bestimmte Chromosomen auf Basis der Größe oder des Bindungsmusters zu identifizieren, umgangen werden. Das kann die Identifikation einer chromosomalen Abnormität, wie der Trisomie, vereinfachen, wobei drei fluoreszenzmarkierte Chromosomen anstelle von zwei, ohne Berücksichtigung eines Bindungsmusters, sofort sichtbar gemacht werden können. Bei Proben, die entlang von Chromosomen hybridisieren, wird die Identifikation von Translokationen durch das sofortige Sichtbarmachen des Bereichs eines fluoreszenzmarkierten Chromosoms, welcher an ein unmarkiertes Chromosom translokiert ist, erleichtert werden.
Hybridisierungsproben ermöglichen es, einzelne Chromosomen auf Basis eines fluoreszierenden Hybridisierungssignals anstatt durch die Größe oder das Bindungsmuster zu identifizieren. Es ist deshalb möglich, Proben zu verwenden, um Chromosomen in Zellen, die sich nicht teilen (sich in der Interphase befinden), zu detektieren, wobei die Chromosomen eine diffuse Struktur, die das visuelle Identifizieren durch Färben ausschließt, aufweisen. Bei Proben, die für centromere Regionen einzelner Chromosomen spezifisch sind, können zweie fluoreszierende Punkten in einer Zelle, die sich in der Interphase befindet, verläßlich die Gegenwart eines speziellen Chromosomenpaares anzeigen, während drei Punkten aus derselben Probe verläßlich eine Trisomie anzeigen. Eine solche Chromosomenanalyse in Zellen, die sich in der Interphase befinden, vermeidet die Notwendigkeit, sich teilende Zellen anzusammeln, und vermindert damit stark die Zeit und den benötigten Aufwand zur Analyse von chromosomalen Abnormitäten. Die Technologie kann auch zur Detektion anderer Chromosomendefekte, wie Translokationen und Deletionen, angewendet werden, wobei Paare von Chromosomenproben, die einen konservierten Translokations- oder Deletionsbereich umgeben, verwendet werden. Proben, die homolog zu chromosomalen Regionen in der Nähe sind, werden Hybridisierungssignale, wie fluoreszierende Punkten, in der Nähe hervorrufen, so daß diese einfach als Proben, die an das gleiche Chromosomenfragment hybridisieren, erkannt werden können. So kann bei Translokationen, wie die 9:22 Transiokation bei chronischer myelogener Leukämie (CML), eine Chromosomenprobe an eine Seite des Translokationsgrenzpunktes im Chromosom 9 hybridisieren, und eine andere Chromosomenprobe an die andere Seite des Grenzpunktes. Bei Deletionen, wie solche, die bei der Duchenne Muskeldystrophie (DMD) auftreten, kann eine Chromosomenprobe an eine Seite der Deletionsregion in dem X-Chromosom hybridisieren, und eine andere Chromosomenprobe hybridisiert an eine Region, die bei der DMD häufig nicht vorhanden ist. Das wird dem Untersuchenden ermöglichen, die DMD als das Fehlen eines fluoreszierenden Punkts aus einem Paar zu detektieren. So kann die örtliche Position von Chromosomenproben, die an Chromosomen von Zellen, die sich in der Interphase befinden, hybridisiert sind, spezifisch anzeigen, ob eine Läsion, wie eine Translokation oder Deletion, vorliegt. Die weite Verbreitung der vorliegenden Technologie zur Analyse von Zellen, die sich in der Interphase befinden, mittels Chromosomenproben ist im wesentlichen dadurch begrenzt, daß ein beträchtlicher technischer Aufwand zur Verwendung von Hybridisierungsproben notwendig ist.
Daher gibt es einen großen Bedarf an einfacheren Hybridisierungsverfahren, die vorzugsweise wenige Manipulationen benötigen und, sofern möglich, präzises Pipettieren vermeiden.
Eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, ein einfacheres Verfahren zur Durchführung von Nukleinsäurehybridisierungsreaktionen, insbesondere ein Verfahren, bei welchem präzises Pipettieren nicht notwendig ist, zur Verfügung zu stellen.

Zusammenfassung der Erfindung

In einem Aspekt stellt die Erfindung eine Zusammensetzung zur Verwendung in Nukleinsäurehybridisierungs-Assays, umfassend eine markierte Nukleinsäureprobe zur Hybridisierung oder einen Precursor dieser, die bzw. der reversibel in getrockneter Form an einem festen Träger gebunden und durch Zugabe von Wasser oder einer wäßrigen Lösung von diesem ablösbar ist, wobei das Hybridisierungs-Assay unter Kontakt mit der Oberfläche des festen Trägers, an den die Nukleinsäureprobe reversibel gebunden ist, durchgeführt wird, zur Verfügung.
Die Anordnung der vorliegenden Erfindung ist vorzugsweise so, daß die Probe oder der Precursor dieser einfach vom festen Träger ablösbar ist. "Einfach ablösbar", wie hier definiert, bedeutet im Sinne der vorliegenden Patentschrift, durch irgendeine wäßrige Lösung ablösbar zu sein.
Nukleinsäureproben oder Precursor dieser können entweder DNA oder RNA umfassen. Solche Proben können durch irgendeine der Vielzahl von Techniken, die aus dem Stand der Technik bekannt sind (z.B. Fluoreszenzmarkierung, Radiomarkierung, Enzymmarkierung), markiert sein. So können Proben oder Precursor dieser entweder mit einem Reagens markiert sein, das ein direkt bestimmbares Hybridisierungssignal bewirkt, oder können mit einer Substanz markiert sein (z.B. wie Biotin), welche nach der Hybridisierung mit einer oder mit mehreren anderen Substanzen (z.B. Avidin) wechselwirkt, wobei diese Wechselwirkung ein bestimmbares Hybridisierungssignal bewirkt.
Im Folgenden soll die Bezugnahme auf "Proben" grundsätzlich, sofern es der Inhalt erlaubt, auch die Precursor dieser einbeziehen.
Proben-Precursor sind gewöhnlich unmarkierte Proben. Das Markieren der Precursor, um markierte Proben zu erhalten, kann vor, während oder nach der Hybridisierung des Precursors an die Test-Nukleinsäure stattfinden. Gewöhnlich wird das Markieren des Precursors durch Vermehrung der Probe unter Verwendung einer Polymerase, wie der DNA-Polymerase I oder der Taq- Polymerase, (in einer dem Fachmann bekannten Weise) durch Zugabe markierter Nukleotide erreicht.
Der feste Träger kann eine im wesentlichen planare Oberfläche zur Verfügung stellen.
Träger mit im wesentlichen planaren Oberflächen umfassen gewöhnlich Glas oder Plastik. Vorzugsweise umfaßt der Träger mit einer im wesentlichen planaren Oberfläche ein dünnes, durchsichtiges Material, beispielsweise ein Glasdeckplättchen oder ein Mikroskopierplättchen. Eine solche bevorzugte Ausführungsform weist Vorteile auf, die weiter unten diskutiert werden.
Umfaßt der feste Probenträger Glas, wird im allgemeinen beobachtet, daß die Probe nicht so an den Träger bindet, daß diese durch die Zugabe von Wasser oder einer wäßrigen Lösung einfach ablösbar ist, was ein bevorzugtes Merkmal der Erfindung ist.
Das ist dadurch bedingt, daß Nukleinsäuren viele negative Ladungen umfassen und deshalb fest an Glas binden, welches im allgemeinen viele positive Ladungen umfaßt.
Um die Stärke dieser elektrostatischen Anziehung zu vermindern, ist es gewöhnlich notwendig, das Glas so zu behandeln, daß mindestens einige dessen Ladungen neutralisiert werden. Gewöhnlich wird das durch Silikonisierung des Glases durchgeführt, z.B. durch Behandeln mit Dimethylchlorsilan in einer dem Fachmann bekannten Weise.
Eine solche Behandlung ist für Spezialglas oder andere Materialien, die nicht so viele positive Ladungen aufweisen, nicht notwendig.
Die Probe wird grundsätzlich in Form einer wäßrigen Lösung auf den Träger aufgetragen und trocknen gelassen (entweder bei Umgebungstemperatur oder bei einer erhöhten Temperatur, um den Trockenvorgang zu beschleunigen). Die Probe kann in Form eines Punktes auf der Oberfläche des Trägers aufgetragen werden oder wird vorzugsweise als mehrere Punkte, die eine Reihe bilden, aufgetragen. Wahlweise und sofern es gewünscht wird, die Probe auf einer hydrophoben Oberfläche zu verteilen (z.B. auf silikonisiertem Glas), kann die Probe in einer Mischung organischer Lösungsmittel (z.B. 50% Methanol/10% Essigsäure, 3:1 (Vol./Vol.) mit Wasser) oder in einer Detergentienlösung, wie Natriumdodecylsulfat, aufgetragen werden.
Bei einer besonderen Ausführungsform kann eine Vielzahl verschiedener Proben reversibel an einem einzigen Träger gebunden sein. Das ist besonders dann zweckmäßig, wenn zwei Proben verwendet werden, wobei jede mit einem andersfarbigen Fluoreszenzmarker markiert ist (z.B. Fluorescein und Kumarin)
Die wäßrige Lösung, die die reversibel gebundene Probe freiset zen kann, umfaßt vorzugsweise eine Hybridisierungsflüssigkeit, deren exakte Zusammensetzung je nach Umstand unterschiedlich ist. Z.B. ist dem Fachmann gut bekannt, daß die Zusammensetzung einer Hybridisierungsflüssigkeit (besonders die Konzentration von Salzen darin) zusammen mit anderen Faktoren (z.B. Temperatur der Hybridisierung) die Stringenz der Hybridisierung, (d.h. den Grad der Homologie zwischen den Sequenzen, die hybridisiert wurden), bestimmt. Gewöhnlich umfaßt die Hybridisierungsflüssigkeit eine wäßrige Lösung von etwa 0,3M Natrium chlorid und etwa 0,03M Natriumcitrat, wobei der pH-Wert auf etwa 7 eingestellt wird. Jedenfalls variiert die Zusammensetzung deutlich, je nach Grad der Homologie zwischen der Nukleinsäureprobe und der Nukleinsäure in der Probe, die getestet werden soll, und abhängig von der Stringenz der gewünschten Hybridisierung. Die Hybridisierungsflüssigkeit kann wahlweise weitere Zusätze, wie Formamid (zu etwa 50% Vol./Vol.) oder Dextransulfat (zu etwa 10% Gew./Vol.) enthalten.
Es wird bevorzugt, daß der Probenprecursor vor Durchführung des Hybridisierungs-Assays markiert wird. Es wird jedoch geschätzt, daß das nicht essentiell ist: Der Precursor der Probe kann während oder nach der Hybridisierung an eine Test-Nukleinsäure markiert werden.
Bei einer Ausführungsform können zusätzlich zu der Probe oder dem Precursor dieser andere Substanzen an demselben Träger, an dem die Probe oder der Precursor der Probe immobilisiert ist, oder an einem oder mehreren separaten Trägern, immobilisiert (entweder reversibel oder irreversibel) werden. Gewöhnlich treten Wechselwirkungen zwischen diesen anderen Substanzen und der Probe oder dem Precursor dieser auf. Z.B. können es bindende Substanzen (wie Antikörper) sein, die an die Probe oder den Precursor binden, oder es können Substanzen zum Markieren, die die Probe oder den Precursor markieren, sein.
Z.B. kann eine markierte Nukleinsäureprobe (z.B. Biotin oder Fluorescein derivatisiert) reversibel an einem Glasdeckplättchen immobilisiert werden, und Agenzien zum weiteren Markieren der hybridisierten Probe (z.B. markierte Antikörper gegen Biotin oder Fluorescein) können an einem oder mehreren separaten Glasdeckplättchen immobilisiert sein, die im Laufe der Hybridisierung und nachdem das erste Glasdeckplättchen von der hybridisierten Probe entfernt wurde, der Reihe nach verwendet werden.
Wahlweise dazu kann ein Beispiel betrachtet werden, wobei eine Kombination des Precursors der Nukleinsäureprobe und Agenzien zum Markieren des Precursor der Probe an einer kontinuierlichen festen Phase zur Verfügung gestellt werden, wobei das schrittweise Zugeben des Precursors der Nukleinsäureprobe und der mar kierenden Verbindungen zu einer zu untersuchenden Probe (Testprobe) erreicht werden kann.
Natürlich können Substanzen anstelle von oder zusätzlich zu markierenden Agenzien an demselben oder einem anderen Träger als dem, an welchem der Precursor der Probe immobilisiert ist, co-immobilisiert sein (reversibel oder irreversibel).
Z.B. kann eine DNA-Polymerase an einem Glasdeckplättchen co-immobilisiert sein oder auf einem zweiten Glasdeckplättchen zur Verfügung gestellt werden, um die Vermehrung der Nukleinsäureprobe oder des Precursors dieser auf einer Matrize, die mit der Test-Nukleinsäure zur Verfügung gestellt wird, zu erzielen. Zusätzlich können die Desoxynukleotide für die Vermehrung auch an demselben oder einem anderen Deckgläschen immobilisiert sein. So werden Hybridisierungs-Assays, die die Vermehrung von Nukleinsäureproben oder Precursorn dieser, z.B. mit der Polymerasekettenreaktion (PCR, US-Patente Nm. 4683195 und 4683202) beinhalten, gewöhnlich so durchgeführt, daß die Komponenten der Vermehrungsreaktion auf einer festen Phase in Verbindung mit den Nukleinsäureproben zur Verfügung gestellt werden. Von besonderem Interesse bei der Analyse von Säugerchromosomen ist die Technik des Narkierens der Primer in situ (primer in situ labelling (PRINS), siehe Koch et al., Chromosoma Band 98 (1989), S. 259), wobei eine oder mehrere unmarkierte Nukleinsäureproben an eine spezifische Region des Chromosoms der präparierten Testprobe hybridisieren, und vermehrt werden, wobei eine DNA-Polymerase verwendet wird, um detektierbare Nukleotide, wie biotinylierte Nukleotide, zu inkorporieren, um folglich den Bereich oder die Bereiche der Hybridisierung an dem Chromosom oder an den Chromosomen sichtbar zu machen. Wie in Beispiel 9 unten gezeigt, kann das PRINS-Verfahren durch Co- Immobilisieren eines Precursors, einer Nukleinsäureprobe und einer DNA-Polymerase an demselben Glasdeckplättchen durchgeführt werden, um so eine besonders bequeme Vorrichtung bereitzustellen, um die Probe und das Enzym zur Durchführung des Verfahrens zur Verfügung zu stellen. Die Kombination einer oder mehrerer Nukleinsäureproben und der Agenzien, die zu einem bestimmten Hybridisierungsverfahren notwendig sind, kann an einer kontinuierlichen festen Phase in Erwägung gezogen werden, wobei erreicht werden kann, daß die Nukleinsäureprobe und die dazugehörigen Agenzien nacheinander auf die Testprobe aufgebracht werden können.
Ein anderer Aspekt der Erfindung ist das zur Verfügung stellen eines Verfahrens zur Durchführung eines Nukleinsäurehybridisierungs-Assays umfassend: Behandeln einer markierten Nukleinsäureprobe oder eines Precursors dieser, die bzw. der reversibel in getrockneter Form an einem festen Träger gebunden und durch Zugabe von Wasser oder einer wäßrigen Lösung von diesem ablösbar ist, durch die Zugabe von Wasser oder einer wäßrigen Lösung, um die Probe oder den Precursor abzulösen; das Inkontaktbringen der abgelösten Probe oder des Precursors mit einer zu untersuchenden Probe (Testprobe), umfassend Nukleinsäure, unter solchen Bedingungen, die die Hybridisierung von homologen oder im wesentlichen homologen Sequenzen ermöglichen; das Behandeln des Precursors, sofern notwendig, in geeigneter Weise, um eine markierte Probe herzustellen; das Entfernen der nicht hybridisierten Probe aus der Mischung und das Bestimmen, ob und wieviel markierte Probe vorliegt, die an die Nukleinsäuresonde hybridisiert ist, vorliegt, wobei das Assay in Kontakt mit der Oberfläche des festen Trägers durchgeführt wird.
Ein Vorteil dieses Verfahrens im Vergleich zu bekannten Techniken ist, daß das Verwenden einer reversibel gebundenen Probe in getrockneter Form dazu führt, die Notwendigkeit präzisen Pipettierens zu verringern, und daß es möglich ist, das Assay verhältnismäßig schnell und einfach von verhältnismäßig ungeschultem Personal durchzuführen.
Das Verfahren kann sowohl für qualitative als auch für quantitative Bestimmungen verwendet werden.
Bei einer bevorzugten Ausführungsform wird die Probe in einem Schritt durch die einfache Zugabe von Wasser oder einer wäßrigen Lösung freigesetzt und mit der zu untersuchenden Probe (Testprobe) in Kontakt gebracht. Gewöhnlich wird eine wäßrige Lösung verwendet, die wie oben diskutiert eine Hybridisierungsflüssigkeit umfaßt.
Die unhybridisierte Probe wird im allgemeinen aus der Mischung des Hybridisierungs-Assays durch einen oder mehrere Waschschritte entfernt. Gewöhnlich umfaßt die Waschflüssigkeit Hybridisierungsflüssigkeit, deren Zusammensetzung, wie oben beschrieben, etwas variabel ist.
Das Assay wird unter Bedingungen durchgeführt, so daß die Nukleinsäureprobe zur Hybridisierung an homologe oder im wesentlichen homologe Sequenzen hybridisieren wird. Eine im wesentlichen homologe Sequenz ist eine solche, die nicht gänzlich sondem nur annähernd komplementär zu der Probe ist. Gewöhnlich weisen solche im wesentlichen homologe Sequenzen mindestens 90% Homologie auf.
Es ist ein bevorzugtes Merkmal der Erfindung, daß insbesondere bei Verwendung von fluoreszenzmarkierten Proben die Proben reversibel an einem festen Träger, umfassend ein dünnes, durchsichtiges Material, wie Glas oder Plastik, welches eine im wesentlichen planare Oberfläche aufweist, gebunden sind, wobei ein solches Material gewöhnlich ein Mikroskopierplättchen oder Deckplättchen umfaßt. Diese Anordnung hat eine Vielzahl von Vorteilen.
Zunächst kann das Mikroskopierplättchen oder Deckplättchen, an welches die Probe reversibel gebunden ist, in der Nähe der Oberfläche des Materials (gewöhnlich ein Deckplättchen oder Mikroskopierplättchen), welches die Testprobe trägt, plaziert werden, so daß die Hybridisierungsflüssigkeit, die verwendet wird, um die Probe freizusetzen, durch Kapillarkräfte zwischen die beiden Oberflächen eingebracht werden kann. Das hat den Vorteil, daß die Person, die das Assay durchführt, keine präzisen Mengen irgendeines Agens abmessen muß. Des weiteren ist es einfach möglich, die Gegenwart von hybridisierter, fluoreszenzmarkierter Probe durch Anwendung von Fluoreszenzmikroskopie zu bestimmen, sofern sowohl das Material, das die Probe trägt, als auch das Material, das die Testprobe trägt, durchsichtig ist. Natürlich hängt jedoch das Verfahren zur Bestimmung der Gegenwart hybridisierter Probe von der Art der Markierung der Probe ab.
Es wird dem Fachmann einfach verständlich sein, daß das oben beschriebene Verfahren insbesondere zur Analyse (insbesondere Chromosomenanalyse) von Säugerzellen, insbesondere menschlichen Zellen, einschließlich der Analyse von frischen Blutzellen oder frischen amniotischen Zellen und der Analyse von Samenzellen, Chorionzellen und Zellen aus Nabelschnurblut, geignet ist.
Es wird darüber hinaus wünschenswert sein, daß das oben beschriebene Verfahren zur Analyse von einigen verschiedenen Chromosomencharakteristika verwendet werden kann. Z.B. können Proben, die zu einem spezifischen Chromosom homolog sind, Informationen über die Kopienzahl dieses Chromosoms, z.B. um das Vorliegen einer Trisomie zu bestimmen, zur Verfügung stellen. Proben, die zum Bestimmen eines Translokations- oder Deletionsbruchpunktes geeignet sind, können zusätzliche örtliche Informationen liefern, um anzuzeigen, ob ein Chromosom normal (zwei Hybridisierungssignale nebeneinander) oder abnormal, wie bei einer Translokation (ein Hybridisierungssignal ist vom anderen abgerückt) oder Deletion (eines aus einem Paar zweier angrenzender Hybridisierungssignale fehlt), ist.
Das erfindungsgemäße Verfahren ist keinesfalls auffrisch isolierte Zellen beschränkt.
Z.B. ist gefunden worden, daß das erfindungsgemäße Verfahren gleichermaßen für kultivierte Säugerzellen als auch für frisch isolierte Säugerzellen angewendet werden kann, obwohl einige kleine Verfahrensmodifikationen für bestimmte Zelltypen notwendig sind, und die Detektion von Chromosomen mit den Proben zu optimieren. Insbesondere ist das Ausmaß an Permeabilität für Nukleinsäureproben, die durch Inkubation in hypotonischen Lösungen erreicht werden kann, für verschiedene Zelltypen verschieden, und es ist gefunden worden, daß bestimmte Zelltypen, einschließlich Amniozyten, eine Vorbehandlung mit einer RNAse oder Proteinase oder beidem erfordern, um zelluläre Bestandteile, an die die Proben binden könnten, zu entfernen.
Es ist auch gefunden worden, daß das erfindungsgemäße Verfahren auf sogenanntes "Archiv"-Material, wie cytogenetische Objekte, angewendet werden kann, die vorher durch Färbung analysiert wurden und einige Zeit später der Hybridisierung mit Chromosomenproben unterworfen werden können, um chromosomenspezifische Hybridisierungssignale zu erhalten. Es ist wünschenswert, daß ein solches Verfahren mit kleineren Veränderungen für viele andere Arten von Zellpräparaten, wie Gewebebereiche und Materialien verschiedensten Alters angewendet werden kann, vorausgesetzt es liegt intaktes und unzersetztes Chromosomenmaterial vor.
Es wird dem Fachmann auch geläufig sein, daß das erfindungsgemäße Verfahren, das insbesondere auf die Chromosomenanalyse von Säugerzellen gerichtet ist, jedoch nicht auf diese Anwendung beschränkt ist.
Z.B. kann es für die meisten Arten von Säugerzellen angewendet werden, für Mikroorganismen, die Nukleinsäure enthalten, und für verschiedene der zuvor genannten Präparate.
Z.B. kann das Verfahren zum Nachweis von virusinfizierten Säuger- oder Bakterienzellen, zum Nachweis von Eukarioten, (wie Hefen, Pilze, Protozoen, Algen oder Pflanzenzellen), oder zum Nachweis von Prokarioten angewendet werden.
Insbesondere findet das erfindungsgemäße Verfahren Anwendung bei dem Nachweis von Mikroorganismen (z.B. Viren, Bakterien, Rickettsien) unter Proben von Säugerzellen (egal ob kultiviert oder frisch isoliert) oder unter Proben von Kulturen anderer Mikroorganismen (wie Bakterien, Pilze oder Hefen).
Ein anderer Aspekt der Erfindung ist das zur Verfügung stellen eines Kits zur Verwendung in Nukleinsäurehybridisierungs-Assays, umfassend: Eine markierte Nukleinsäurehybridisierungsprobe oder einen Precursor dieser, der bzw. die reversibel in getrockneter Form an einem festen Träger gebunden und durch Zugabe von Wasser oder einer wäßrigen Lösung von diesem ablösbar ist, zur Durchführung des Assays in Kontakt mit der Oberfläche des festen Trägers und eine Bedienungsanleitung.
Das Kit kann noch andere Substanzen, die in getrockneter Form an dasselbe oder einen weiteren festen Träger gebunden sind, umfassen. Diese anderen Substanzen können reversibel oder irreversibel gebunden sein.
Umfaßt das Kit einen Probenprecursor, wird das Kit gewöhnlich andere Substanzen, die in getrockneter Form an einen festen Träger gebunden sind, umfassen, die als Markierungsagenzien wirken können.
Gewöhnlich wird die Nukleinsäurehybridisierungsprobe reversibel an ein Deckgläschen oder Mirkroskopierplättchen gebunden. Ein bevorzugtes Merkmal dabei ist, daß das Kit darüber hinaus eine Vulkanisierungslösung (deren Zusammensetzung dem Fachmann gut bekannt ist) enthält. Andere bevorzugte Bestandteile des Kits schließen ein: Hybridisierungslösung (vorzugsweise einer Zusammensetzung, die sorgfältig ausgewählt wurde, um ideale Bedingungen bezüglich der Stringenz der Hybridisierung der Probe mit der beabsichtigten Zielsequenz in der Testprobe zu schaffen), Waschlösung und eine Lösung, die das Verblassen verhindert.
Das Signal von Fluorophoren (wie solche, die zum Floureszenzmarkieren von Proben verwendet werden) neigt dazu, mit der Zeit während der Anregung des Fluorophors gequentscht zu werden, was erfahrungsgemäß bei der Fluoreszenzmikroskopie auftritt. Eine Lösung, die das Verblassen verhindert und dem Fachmann gut bekannt ist, bewirkt diese Tendenz zu vermindern. Vorzugsweise umfaßt die Lösung, die das Verblassen verhindert, Propidiumjodid, das dazu neigt, Zellkerne rot zu färben. Es kann deshalb als ein Gegenfärbemittel für bestimmte üblicherweise verwendete Fluorophore (z.B. Fluorescein) wirken.
Das Kit kann auch Mirkroskopierplättchen, die auf dem Fachmann bekannte Weise behandelt worden sind, umfassen, um Ergebnisse, die bei der Analyse von Amniozyten (wie solche, die aus der Amniocentese erhalten werden) erhalten werden, zu verbessern.
Die verschiedenen Aspekte der Erfindung werden unter Bezugnahme auf die folgenden erläuternden Beispiele und Zeichnungen besser verständlich, wobei:
Figur 1 eine schematische Darstellung von Nukleinsäurehybridisierungsproben, die reversibel an verschiedene feste Träger immobilisiert sind, darstellt,
Figur 2 eine Mikrophotographie ist, die die Ergebnisse, die aus einem Hybridisierungs-Assay unter Verwendung von Fluoreszenzmarkierten Proben, die spezifisch für ein bestimmtes menschliches Chromosom sind, veranschaulicht und
Figur 3 eine Umrißskizze eines Mikrophotos ist, das aus Hybridisierungs-Assays erhältlich ist, wobei fluoreszenzmarkierte Proben, die spezifisch für zwei Loci auf einem bestimmten menschlichen Chromosom sind, verwendet werden.

Detaillierte Beschreibung

Figur 1 zeigt Beispiele, in welchen die Proben reversibel an feste Träger immobilisiert sind. Figur la zeigt eine Probe 2, die reversibel an die Oberfläche eines gewöhnlichen Mikroskopierdeckplättchens 5, mit im wesentlichen planarer Oberfläche, immobilisiert ist. Das Deckplättchen wird dann so positioniert, daß die Seite, die mit der Probe überzogen ist, mit der Oberfläche eines gewöhnlichen Mikroskopierplättchens 1, welches die Testprobe 3 trägt, in Kontakt ist. Eine ausreichende Menge Hybridisierungsflüssigkeit wird dann auf das Plättchen aufgebracht und durch Kapillarkräfte unter das Deckplättchen gezogen, wobei damit die Probe von dem Deckplättchen abgelöst wird und es dieser ermöglicht wird, mit irgendeiner homologen Sequenz in der Testprobe zu hybridisieren. Ein genauso effektives Verfahren ist, die Hybridisierungsflüssigkeit direkt auf die Testprobe zu geben und dann das Deckplättchen auf die Hybridisierungsflüssigkeit zu setzen, welche durch Kapillarkräfte unter den Deckplättchen verteilt wird. Bei einer alternativen Anordnung, in Figur 1b gezeigt, kann die Oberfläche des Deckplättchens, das mit der Probe 2 bedeckt ist, in Verbindung mit einem Mikroskopierplättchen 8, das eine Mulde zum Zurückhalten von Flüssigkeit umfaßt, verwendet werden. Die Testprobe wird zusammen mit der Hybridisierungsflüssigkeit in die Mulde gegeben und die mit der Probe bedeckte Oberfläche des Deckplättchens so positioniert, daß diese die Hybridisierungsflüssigkeit berührt und die Probe freigesetzt wird.
Figur 2 wird im Beispiel 1 weiter unten beschrieben.
Figur 3 ist eine Skizze hypothetischer Mikrophotographien, wie sie unter Verwendung eines Paares fluoreszenzmarkierter Proben erhalten werden, welche spezifisch sind für jede Seite des Translokationsbruchpunktes im menschlichen Chromosom 9, wobei die Translokation dazu führt, daß die Chromosomen 9 und 22 assoziiert werden, was bei Patienten mit chronischer myelogener Leukämie (CML) der Fall ist. Figur 3a zeigt die erhaltenen Ergebnisse einer Hybridisierung mit einer normalen Zelle, die sich in der Interphase befindet: Die Probenpaare hybridisieren angrenzend an jede Kopie des Chromosoms 9, was zeigt, daß keine Translokation stattgefunden hat. Figur 3b zeigt die erhaltenen Ergebnisse einer Hybridisierung mit einer abnormalen Zelle eines CML-Patienten, die sich in der Interphase befindet: Die Probenpaare haben angrenzend an eine Kopie des Chromosoms 9 hybridisiert, haben jedoch auch an zwei verschiedenen Loci hybridisiert, was zeigt, daß eine Translokation für eine Kopie des Chromosoms 9 stattgefunden hat, was zu der physikalischen Separation der beiden Hybridisierungsloci führt.

Beispiel 1

Dieses Beispiel betrifft den Nachweis von Zellen, die eine Trisomie des Chromosoms 12 aufweisen, bei chronischer lymphozytischer Leukämie (CLL). 0,1 ml vollständiges Blut von entweder einem gesunden Freiwilligen oder einem CLL-Patienten wurden in 5 ml Medium, umfassend RPMI 1640 (Gibco, Paisley, UK) 10% fötales Kalbsserum (Gibco ) und 0,05 ml Phytohämagglutininlösung (Gibco , M-Form), kultiviert. Die Zellen wurden 72 Stunden lang bei 37ºC inkubiert und 0,05 ml Colchicin (Sigma, Poole, UK) wurden zugegeben. Nach Inkubation für weitere 60 Minuten, wurden die Zellen zentrifugiert und die Pellets wurden in 0,075M Kaliumchloridlösung resuspendiert. Nach 10 Minuten wurden die Zellen wieder zentrifugiert und die Pellets in Methanol:Eisessig 5:1 (Vol./Vol.) resuspendiert. Die Zellen wurden weiter zu Pellets verarbeitet und dreimal in der Methanol:Eisessig-Fixierlösung resuspendiert. Ein Tropfen der Zellen mit einer minimalen Konzentration von 10&sup4; pro ml wurde auf einige Mikroskopierplättchen gegeben und bei Raumtemperatur trocknen gelassen. Die Plättchen wurden dann bei 65ºC auf einer Heizplatte inkubiert und eine Stunde lang bei -20ºC gelagert. Kurz vor der Hybridisierung wurden die Plättchen nacheinander 2 Minuten lang in kaltes 70%-iges Ethanol getaucht, weitere 2 Minuten lang in kaltes 85%-iges Ethanol und schließlich 2 Minuten lang in kaltes 100%-iges Ethanol, und getrocknet.
Zur Hybridisierung wurde eine DNA-Probe, homolog zur centromeren Region des Chromosoms 12, verwendet. 25 µg des Plasmids p- alpha-12H8 (Looyenga et al., Cytogenet. Cell Genet. 54 (1990) S. 216) wurde nick-translatiert durch 10 Minuten langen Verdau mit 0,005 Einheiten DNASE 1 (Life Technologies, Paisley, UK) bei 37ºC in 25 µl 4OMM Tris.HCl, pH-Wert 8, und 6mm MgCl&sub2;. Die Reaktion wurde durch 10 Minuten langes Erwärmen auf 70ºC gestoppt. 3 µl der verdauten DNA wurden dann mit 5 µl 10xA4-Puffer (200µM Deoxyadenosintriphosphat, 200µM Deoxycytosintriphosphat, 0,5M Tris.HCl, pH-Wert 7,2, 0,2mm MgCl&sub2;, 0,1mM beta-Mercaptoethanol, 0,1 mg/ml Rinderserumalbumin (Fraktion V, Sigma ), 3,3 µl bio-11 dUTP (von 100 µg/ml Stocklösung, Sigma ) und Wasser auf 49 µl) gemischt. 1 µl DNA-Polymerase J wurden zugegeben und die Mischung wurde bei 15ºC 1,5 Stunden lang inkubiert. Die Umsetzung wurde durch Zugabe von 5 µl 0,3M EDTA, pH-Wert 8, gestoppt. Bei einigen Experimenten wurden 2 µl der Probe mit 100 µl Methanol:Eisessig 3:1 (Vol./Vol.) gemischt und diese wurde auf die unmarkierte Seite eines silikonisierten 25 mm² Mikroskopierdeckplättchens (Nummer 1 Deckplättchen, BDH, Dorset, UK) gegeben. Ein zweites silikonisiertes Deckplättchen wurde auf die Probenmischung über der unmarkierte Seite plaziert, um die Probe einheitlich zu verteilen, und das Sandwich der Probe mit dem Deckplättchen wurde 2 Stunden lang bei 37ºC inkubiert. Die trockenen Deckplättchen wurden dann separiert und beide für die Hybridisierung verwendet. Bei anderen Experimenten wurde die in 200 µl Wasser verdünnte Probe entweder in Form einzelner Aliquote von 5 µl in einer Reihe auf das Deckplättchen aufgetupft oder wurde unter Verwendung eines silikonisierten Glasstabs manuell über das Deckplättchen verteilt. In jedem der Fälle wurde die Probe auf den Deckplättchen bei 37ºC getrocknet. Die Hybridisierung wurde durch Auflegen eines Deckplättchens auf einen Tupfen Hybridisierungspuffer (50% Formamid, 0,3M Natriumchlorid, 0,03M Natriumcitrat, pH-Wert 7, 10% Gew./Vol. Dextransulfat (mittleres Molekulargewicht 500.000 Dalton, Sigma )) auf jedem Mikroskopierplättchen vorgenommen. Die Deckplättchen wurden an den Enden mit Gummilösung versiegelt und 10 Minuten lang bei 85ºC auf einer Heizplatte erwärmt.
Die Plättchen wurden dann bei 37ºC über Nacht inkubiert. Die Deckplättchen wurden dann entfernt und dreimal 5 Minuten lang bei 45ºC in 50% Formamid, 0,3M Natriumchlorid und 0,03M Natriumcitrat, pH-Wert 7, gewaschen. Die Plättchen wurden dann zweimal 5 Minuten lang in PN-Puffer (0,lM Natriumphosphatpuffer, pH-Wert 8, 0,1% NP40) bei 45ºC und Raumtemperatur gewaschen. Die Plättchen wurden dann im Dunkeln bei Raumtemperatur Minuten lang in 5 µg/ml Fluorescein-Avidin-DCS-Lösung (Vector Laboratories) in PMN-Puffer (0,1M Natriumphosphatpuf fer, pH-Wert 8, 0,1% NP40, 0,02% Natriumazid und 5% fettfreies Milchpulver (Marveltm, Cadbury, Birmingham, UK)) inkubiert. Die Plättchen wurden dreimal im Dunkeln mit PN-Puffer gewaschen und weitere 20 Minuten lang im Dunklen in 5 µg/ml biotinyliertem anti-Avidin (Vector Laboratories) in PMN-Puffer inkubiert. Die Plättchen wurde wieder dreimal im Dunkeln mit PN-Puffer gewaschen, der Überschuß an Puffer wurde entfernt, und die Plättchen wurden in 1 µg/ml Propidiumjodid (Sigma )in glycerolhaltigem 250µg/ml 1,4-Diazabicyclooctan (DABCO, Aldrich, Dorset, UK) gefärbt. Jedem Plättchen wurde vor dem Mikroskopieren ein Deckplättchen aufgelegt
Typische Ergebnisse sind in Figur 2 gezeigt.
Für die Mehrzahl der Blutzellen eines normalen Freiwilligen (hauptsächlich Megakaryocyten) konnten zwei fluoreszierende Punkte beobachtet werden (Figur 2a), während sich für die Mehrzahl der Blutzellen des CLL-Patienten drei fluoreszierende Punkte (Figur 2b) zeigten, was einer Trisomie des Chromosoms 12 entspricht.

Beispiel 2

Das Verfahren aus Beispiel 1 wurde entweder unter Verwendung einer Probe eines centromeren Chromosoms 12 oder, wahlweise einer Probe eines centromeren Chromosoms 1, erhalten aus dem Plasmid pUCL77 (Cooke and Hindley, Nucleic Acids Research 6 (1979) S. 3177), wiederholt. Als Alternative zum Kultivieren der Blutzellen wurde sowohl amniotische Flüssigkeit als auch frisches Blut direkt einer Chromosomenanalyse unterzogen. Um ein Paar fluoreszierende Punkte aus normalen Amniozyten und normalen Blutzellen zu erhalten, wurden die Zellen zentrifugiert und die Pellets in 0,075M Kaliumchlorid 30 bis 60 Minuten lang resuspendiert. Die Zellen wurden dann zentrifugiert und in Methanol:Eisessig 3:1 (Vol./Vol.) resuspendiert und dann auf Mikroskopierplättchen aufgetragen. Die Zellen auf dem Plättchen wurden 1 Stunde lang bei 37ºC mit 100 µg/ml RNAse A (Rinder- RNAse, Boehringer, Lewes, UK) behandelt. Die Plättchen wurden dann viermal in 0,3M Natriumchlorid, 0,03M Natriumcitrat, pH- Wert 7, gewaschen. Die Plättchen wurden dann nacheinander in 70%-igem Ethanol, 85%-igem Ethanol und 100%-igem Ethanol gewaschen. Die Plättchen wurden dann 30 Minuten lang bei 37ºC in 0,5 µg/ml Proteinase K (Sigma ) inkubiert, zentrifugiert und zweimal in 0,3M Natriumchlorid, 0,03M Natriumcitrat, pH-Wert 7, gewaschen. Die Plättchen wurden dann in 4%-iger Paraformaldehydlösung resuspendiert, zentrifugiert und zweimal in 0,3M Natriumchlorid, 0,03M Natriumcitrat, pH-Wert 7, gewaschen. Die Plättchen wurden dann nacheinander in 70%-igem Ethanol, 85%-igem Ethanol und 100%-igem Ethanol gewaschen und wie oben mit DNA-Proben hybridisiert.
Für die Mehrzahl der frischen (unkultivierten) Amniozyten oder Blutzellen konnten zwei fluoreszierende Punkten beobachtet werden, sowohl für die DNA-Proben, des Chromosoms 12 oder Chromosoms 1.

Beispiel 3

Einige der Arbeitsschritte der Verfahren aus den Beispielen 1 und 2 konnten durch das Verwenden einer Probe, die selbst fluoresceinmarkiert war, ausgelassen werden. Die Proben-DNA wurde wie im Beispiel 1 beschrieben nick-translatiert, mit der Ausnahme, daß bio-ll dUTP, Fluorescein-Deoxyuridintriphosphat (Amersham International, Little Chalfont, UK) in einer Endkonzentration von 20µM verwendet wurde. Deoxythymidintriphosphat wurde in einer Endkonzentration von 20µM und die anderen Deoxyribonukleotidtriphosphate in Endkonzentrationen von 60µM verwendet, wobei die Inkubation bei 15ºC auf 3 Stunden ausgedehnt wurde. Während der Inkubation bei der Hybridisierung und dem Waschen in PN-Puffer wurden die Plättchen direkt mit 1 µg/ml Propidiumjodid in DABCO behandelt und unter dem Mikroskop gesichtet. Fluoreszierende Punkten konnten wie in den Beispielen 1 und 2 beobachtet werden.

Beispiel 4

Die Anwendung des Verfahrens aus den Beispielen 1 bis 3 an "Archiv"-Material wurde untersucht, indem drei Wochen alte Plättchen analysiert wurden. Ein Plättchen, das fixierte Blutzellen umfaßte, wurde in salzhaltigem Phosphatpuffer und dann in 100%-igem Ethanol gewaschen und getrocknet. Die Plättchen wurden bei 65ºC auf einer Heizplatte 1 Stunde lang inkubiert und bei -20ºC gelagert. Die Hybridisierungen wurden wie oben beschrieben durchgeführt, mit dem Ergebnis, daß die Probe des centromeren Chromosoms 12 aus p-alpha-12H8 für eine Vielzahl der Blutzellen Paare fluoreszierender Punkten verursachte.

Beispiel 5

Das im Beispiel 3 beschriebene Verfahren wird hier bezüglich dessen Anwendung zur Analyse von Keimzellen weitergehend beschrieben. Insbesondere betrifft dieses Beispiel den Nachweis von bezüglich des Chromosoms 1 disomischen Zellen von Patienten, die einer Strahlung ausgesetzt gewesen sein könnten. Es wurde eine direkt markierte Probe des Chromosoms 1 (Plasmid pUC1.77 - siehe Beispiel 2 oben) verwendet. Spermaproben wurden von einem gesunden Freiwilligen und auch von einem Patienten gespendet, der einer Strahlung ausgesetzt war.
Die Spermaproben wurden in 10 ml phosphatgepufferter Saline (PBS-0,14M Natriumchlorid, 0,002M Kaliumchlorid, 0,01M Dmatriumhydrogenorthophosphat, 0,001M Kaliumdihydrogenorthophosphat, pH-Wert 7,4) gemischt, und durch Zentrifugieren wurden Pellets gebildet. Nach vorsichtigen Entfernen des Überstands wurde frisches Fixiermittel (Methanol:Essigsäure 3:1 (Vol./Vol.)) zugegeben, bis eine "milchige" Lösung erhalten wurde. Die fixierten Zellen wurden dann auf Mikroskopierplättchen aufgetragen und trocken gelassen. Die Zellen auf den Plättchen wurden 5 Minuten lang in PBS gewaschen, schrittweise in 70%-igem Ethanol, 85%-igem Ethanol und 100%-igem Ethanol, vor einer 12 Minuten langen Behandlung in 0,lM DTT/1%-iger Trypsinlösung dehydriert. Nach einer weiteren Abfolge zum Dehydrieren wurden die Proben wie oben beschrieben mit DNA-Proben hydridisiert. Typische Ergebnisse sind in Figur 4 gezeigt. Für die Mehrzahl der Zellen des gesunden Freiwilligen konnte ein einzelner fluoreszierender Punkt für die Probe des Chromosoms 1 beobachtet werden. Eine kleine Anzahl von Zellen enthielt jedoch zwei fluoreszierende Punkte, was anzeigt, daß eine kleine Anzahl Zellen des Patienten, der einer Strahlung exponiert war, im Hinblick auf das Chromosom 1 ein Disomie aufweisen.

Beispiel 6

Dieses Beispiel betrifft den pränatalen Nachweis einer Trisomie 18 aus einer Probe aus dem Chorion (Chorionic villus sample, CVS). Es wurde eine Probe verwendet, die der centromeren Region des Chromosoms 18 homolog war (Devilee et al. Nucleic Acids Research 14: 2059-2073, (1996)). Die Probe wurde im wesentlichen wie in Beispiel 3 oben beschrieben hergestellt.
Chorionzellen wurden durch 2 Stunden lange Inkubation von getrockneten Zellen in 2 ml Changmedium (Metachem Diagnostics Ltd, Northampton, England), das Dispase (4 mg/ml) enthielt, präpariert. Colchicin (0,01% Gew./Vol.) wurde zugegeben, und vor dem Zentrifugieren wurde eine weitere Stunde lang inkubiert. Das erhaltene Zellpellet wurde in 5 ml 1% (Gew./Vol.) Natriumcitrat resuspendiert und 15 Minuten lang bei 37ºC inkubiert. Die durch Zentrifugieren pelletierten Zellen und das erhaltene Zellpellet wurden zweimal in eiskaltem Fixiermittel (Methanol:Essigsäure (3:1) Vol./Vol.) gewaschen. Die fixierten Zellen wurden dann vor der schrittweisen Dehydrierung mit Ethanol verschiedener Konzentrationen (70%, 85% und 100%) auf Glasplättchen aufgetragen. Während der Hybridisierung der fluoresceinmarkierten Probe und nach dem Waschen zur Beurteilung der Stingenz wurden die Plättchen wie in Beispiel 3 oben beschrieben behandelt. Für die Mehrzahl der CVS-Zellen konnten drei fluoreszierende Punkten beobachtet werden, gleichbedeutend einer Trisomie 18 (Edwards Syndrom).

Beispiel 7

Dieses Beispiel betrifft die Bestimmung des Geschlechts eines Fötus aus Nabelschnurblut durch Anwendung von einer in situ-Hy bridisierung mit zweifarbiger Fluoreszenz. 10 µl Nabelschnurblut wurde langsam mit 100 µl frischem Fixiermittel (Methanol:Essigsäure (3:1) Vol./Vol.) gemischt. Die fixierten Zellen wurden dann vor der schrittweisen Dehydrierung mit Ethanol verschiedener Konzentrationen (70%, 85% und 100%), die vor der Hybridisierung durchgeführt wird, auf Glasplättchen aufgetragen. Die Proben werden aus der Heterochromatinregion des Chromosoms Y und der centromeren Region des Chromosoms X (Nakahori et al., Nucleic Acids Research 14:7569-7580, (1986) and Willard et al., Nucleic Acids Research 11:2017, (1983)) gewonnen. Die Proben werden im wesentlichen wie in Beispiel 3 markiert, mit Ausnahme, daß das zur Markierung der Y-Probe verwendete Fluorophor Hydroxycumarin 6-DUTP (Boehringer Mann heim GmbH, Germany) war.
Nach der Inkubation zur Hybridisierung und dem Waschen zur Beurteilung der Stringenz wurden die Plättchen direkt mit 0,7 µg/ml Propidiumjodid in Vectashield (Vector Labs Inc, Burlin game, USA) behandelt und unter dem Epifluoreszenzmikroskop unter Verwendung eines zweifachen Filterblocks (Nikon, Japan) für Fluorescein und Kumarin betrachtet.
Ein gelber und ein blauer Punkt wurde in fixierten Lymphozyten sichtbar, was anzeigte, daß das Blut von einem männlichen Fötus stammt.
Die obigen Beispiele sind keinesfalls eine vollständige Auflistung der Arten von Testproben, auf welche diese Technologie angewendet werden kann, geben jedoch einen Einblick in den Umfang.

Beispiel 8

Dieses Beispiel betrifft die Analyse menschlicher Amniozyten und peripherer Blutzellen für die Chromosomen 13/21, 18, X und Y, und es werden kommerziell erhältliche Kits, die auf dem erfindungsgemäßen Verfahren beruhen, verwendet. "Chromoproben"- Kits zur Analyse der Chromosomen 13/21, 18, X und Y wurden von Cytocell, Lewknor, UK erhalten und wurden gemäß den Herstellerhinweisen, einschließlich der Verwendung von Hilfsagenzien, verwendet. Die Häufigkeit des Erscheinens fluoreszierender Punkten in Zellen, die sich in der Interphase befinden, für Proben, von welchen bekannt ist, daß sie den vollständigen Chromosomensatz enthalten, wurde bestimmt und die Ergebnisse sind in den folgenden Tabellen gezeigt, wobei die Tabellen 1a und 1b die Ergebnisse zeigen, die aus Amniozyten und peripheren Blutzellen unter Verwendung von Proben, die für die Chromosomen 13/21 spezifisch sind, zeigen. Die Tabellen 2a und 2b zeigen die Ergebnisse für dieselben Zelltypen (d.h. Amniozyten und periphere Blutzellen) unter Verwendung einer Probe, die für das Chromosom 18 spezifisch ist, die Tabellen 3a und 3b zeigen die Ergebnisse für dieselben Zelltypen unter Verwendung einer Probe, die für das X-Chromosom spezifisch ist, und die Tabellen 4a und 4b zeigen die Ergebnisse für dieselben Zelltypen unter Verwendung einer Probe, die für das Y-Chromosom spezifisch ist.

Beispiel 9

Diese Beispiel betrifft den Nachweis von Zellen, die bei chronischer lymphozytischer Leukämie (CLL) eine Trisomie des Chromosoms 12 aufweisen, durch eine Variation des Verfahrens aus Beispiel 1. Zellen eines Patienten mit chronischer lymphozytischer Leukämie wurden präpariert und wie in Beispiel 1 beschrieben auf Mikroskopierplättchen gegeben. 2 µg des Plasmids p-alpha-12H8 (Beispiel 1) wurden mit dem Enzym DdeI gemäß den Anweisungen des Herstellers (Promega, Southampton, UK) verdaut. Die verdaute Plasmid-DNA wurde mit Phenol:Chloroform extrahiert und mit Ethanol gefällt (siehe "Molecular Cloning, A Laboratory Manual", Herausgeber Sambrook, Fritsch and Maniatis, Cold Spring Harbor Press (1989)) und in 10 µl Wasser resuspendiert. Einzelne Aliquote von 1 µl dieser DNA wurden in einer 3x3- Matrix auf ein silikonisiertes 25 mm² Deckplättchen aufgetragen und trocknen gelassen. Eine Einheit Tag-Polimerase (Promega) wurde, wie vom Hersteller empfohlen, auf 10 µl mit Umsetzungspuffer verdünnt und als Aliquote von 1 µl (3x3-Matrix) auf dasselbe Deckplättchen aufgetragen und trockenen gelassen. Zur Hybridisierung und Vermehrung wurden 10 µl wäßriger Lösung von jeweils 50µM dATP, dGTP und dCTP und 25 mM Fluorescein-12-dUTP (Boehringer ) auf die Testprobe an dem Gläschen aufgebracht und das Deckgläschen mit dem verdauten Plasmid und der Taq-Polimerase wurde aufgelegt. Das Gläschen wurde 5 Minuten lang auf 93ºC erhitzt und dann 1 Stunde lang bei 70ºC inkubiert. Das Deckgläschen wurde dann entfernt und das Gläschen bei 70ºC 5 Minuten lang in 500mM NaCl und 50mM EDTA, pH-Wert 8, gewaschen. Die Gläschen wurden dann mit Propidiumjodid gefärbt und wie in Beispiel 1 betrachtet. Für eine Vielzahl der Blutzellen des Patienten mit CLL konnten drei fluoreszierende Punkten beobachtet werden, was dem Vorliegen von drei Kopien des Chromosoms 12 entspricht.
Die obigen Beispiele sind keinesfalls eine vollständige Auflistung der Arten von Testproben, für die diese Technologie angewendet werden kann, geben jedoch einen Einblick in den Umfang.

Tabelle 1a:

Ergebnisse, erhalten aus Amniozyten unter Verwendung der Chromoprobe 13/21 Normale Zellen

Tabelle 1b:

Ergebnisse, erhalten aus peripheren Blutzellen unter Verwendung der Chromoprobe 13/21 Normale Zellen Trisomie 13

Tabelle 2a:

Ergebnisse, erhalten aus Amniozyten unter Verwendung einer Probe, die für das Chromosom 18 spezifisch ist Normale Zellen Fälle von Trisomie 18

Tabelle 2b;

Ergebnisse, erhalten aus peripheren Blutzellen unter Verwendung einer Probe, die für das Chromosom 18 spezifisch ist
Anmerkung: Zwei der abnormalen Testproben in der Tabelle waren Blutreste von einer Herzpunktion. Die Ergebnisse, die unter Verwendung dieser Art Testprobe erhalten wurden, sind nicht streng vergleichbar mit den normalen Zellen. Normale Zellen Fälle von Trisomie 18

Tabelle 3a:

Ergebnisse, erhalten aus Amniozyten unter Verwendung einer Probe, die für das X-Chromosom spezifisch ist Einfaches X-Chromosom XX-Chromosomen

Tabelle 3b:

Ergebnisse, erhalten aus peripheren Blutzellen unter Verwendung einer Probe, die für das X-Chromosom spezifisch ist Einfaches X Chromosom XX-Chromosomen

Tabelle 4a:

Ergebnisse, erhalten von Amniozyten unter Verwendung einer Probe, die für das Y-Chromosom spezifisch ist Kein Y-Chromosom erwartet Y-Chromosom erwartet

Tabelle 4b:

Ergebnisse, erhalten aus peripheren Blutzellen unter Verwendung einer Probe, die für das Y-Chromosom spezifisch ist Y-Chromosom erwartet Kein Y-Chromosom erwartet

Claims

1. Zusammensetzung zur Verwendung in Nukleinsäurehybridisierungs-Assays, umfassend eine markierte Nukleinsäureprobe zur Hybridisierung oder einen Precursor dieser, die bzw. der reversibel in getrockneter Form an einen festen Träger gebunden und durch Zugabe von Wasser oder einer wäßrigen Lösung von diesem ablösbar ist, wobei das Hybridisierungs-Assay unter Kontakt mit der Oberfläche des festen Trägers, an den die Nukleinsäureprobe reversibel gebunden ist, durchgeführt wird.

2. Zusammensetzung nach Anspruch 1, umfassend einer Precursorprobe in Form einer unmarkierten Nukleinsäureprobe.

3. Zusammensetzung nach Anspruch 2, worin das Markieren der Precursorprobe durch Zugabe von markierten Nukleotiden zu dieser erreicht wird.

4. Zusammensetzung nach einem der Ansdrüche 1 bis 3, worin der feste Träger im wesentlichen planar ist.

5. Zusammensetzung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, worin der feste Träger einen Objektträger oder ein Deckglas umfaßt.

6. Zusammensetzung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, worin der feste Träger siliconisiertes Glas umfaßt.

7. Zusammensetzung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, worin eine Vielzahl von verschiedenen Proben oder deren Precursor reversibel an einen einzigen festen Träger gebunden sind.

8. Zusammensetzung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, darüber hinaus umfassend andere Substanzen, die in getrockneter Form an denselben oder einen weiteren festen Träger gebunden sind.

9. Zusammensetzung nach Anspruch 8, worin die anderen Substan zen eine reversibel oder irreversibel immobilisierte Substanz umfassen, die dazu in der Lage ist, mit der Nukleinsäureprobe in Wechselwirkung zu treten.

10. Zusammensetzung nach Anspruch 8 oder 9, worin die anderen Substanzen ein Enzym umfassen.

11. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 8, 9 oder 10, worin die anderen Substanzen eine DNA-Polymerase umfassen.

12. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 8 bis 11, worin die anderen Substanzen Deoxynukleotide zur Zugabe zu der Probensubstanz umfassen.

13. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 8 bis 12, worin die anderen Substanzen Reagenzien zur Markierung umfassen.

14. Verfahren zum Ausführen eines Nukleinsaurenybridisierungs Assays, umfassend das Behandeln einer markierten Nukleinsäure- probe oder eines Precursors dieser, die bzw. der reversibel in getrockneter Form an einen festen Träger gebunden und durch Zugabe von Wasser oder einer wäßrigen Lösung von diesem ablösbar ist, die Zugabe von Wasser oder einer wäßrigen Lösung, um die Probe oder den Precursor abzulösen, das Inkontaktbringen der abgelösten Probe oder des Precursors mit einer zu untersuchenden Probe, umfassend Nukleinsäure, unter solchen Bedingungen, die die Hybridisierung von homologen oder im wesentlichen homologen Sequenzen ermöglichen, das Behandeln des Precursors, sofern notwendig, in geeigneter Weise, um eine markierte Probe herzustellen, das Entfernen der nicht hybridisierten Probe aus der Mischung und das Bestimmen, ob und wieviel der markierten Probe, die an die Nukleinsäuresonde hybridisiert ist, vorliegt, wobei das Assay in Kontakt mit der Oberfläche des festen Trägers durchgeführt wird.

15. Verfahren nach Anspruch 14, wobei die Probe oder der Precursor dieser durch Zugabe einer Hybridisierungsflüssigkeit abgelöst wird.

16. Verfahren nach Anspruch 14 oder 15, wobei ein reversibel an den Träger gebundener Precursor in geeigneter Weise behandelt wird, um eine markierte Probe herzustellen, wobei eine Polymerase verwendet wird, um dem Precursor markierte Nukleotide hinzuzufügen.

17. Verfahren nach einem der Ansprüche 14 bis 16, wobei das Verfahren so durchgeführt wird, daß genau bestimmte Mengen an Reagenzien nicht zusätzlich benötigt werden.

18. Verfahren nach einem der Ansprüche 14 bis 17, wobei das Verfahren zur Chromosomenanalyse von Zellen angewendet wird.

19. Kit zur Verwendung in Nukleinsäurehvbridisierungs-Assays, umfassend eine markierte Nukleinsäureprobe oder einen Precursor dieser, die bzw. der reversibel in getrockneter Form an einen festen Träger gebunden und durch Zugabe von Wasser oder einer wäßrigen Lösung von diesem ablösbar ist, zur Durchführung des Assays in Kontakt mit der Oberfläche des festen Trägers und Bedienungsanleitungen.

20. Kit nach Anspruch 19, darüber hinaus umfassend andere Substanzen, die in getrockneter Form an denselben oder einen weiteren festen Träger gebunden sind.

21. Kit nach Anspruch 19 oder 20, worin die anderen Substanzen Regenzien zur Markierung umfassen.

22. Kit nach einem der Ansprüche 19 bis 21, darüber hinaus umfassend eine oder mehrere der folgenden Substanzen: Hybridi sierungsflüssigkeit, Waschlösung, Vulkanisierungslösung und eine Lösung, umfassend Propidiumjodid, die das Verblassen verhindert.