DE60128908T2

DE60128908T2 - Verfahren zum Nachweis und zur Lokalisierung von Genen in situ durch Hybridisierung einer verzweigten DNA

Info

Publication number: DE60128908T2
Application number: DE60128908T
Authority: DE
Inventors: Daryn Moraga KENNY; Lu Ping San Leandro SHEN; Vincent P. Antao; Audrey N. Silver Springs PLAYER; Wei Gu Bei New District CAO
Original assignee: Bayer Corp
Current assignee: Siemens Healthcare Diagnostics Inc
Priority date: 2000-06-02
Filing date: 2001-06-01
Publication date: 2008-02-28
Anticipated expiration: 2021-06-02
Also published as: ES2287134T3; ATE364722T1; EP1287165B1; EP1287165A2; US20020172950A1; WO2001094632A3; US7033758B2; DE60128908D1; JP2003535600A; WO2001094632A2

Description

TECHNISCHES GEBIET
Diese Erfindung betrifft im Allgemeinen die Nucleinsäurechemie sowie biochemische Tests. Insbesondere betrifft die Erfindung hochgradig empfindliche Verfahren zur In-situ-Detektion eines Nucleinsäureanalyten. Das Verfahren verwendet Verzweigte-DNA-Oligosonden (Branched-DNA-Oligosonden) und Hybridisierungsverfahren, um die Position eines Nucleinsäureanalyten in einer biologischen Probe zu detektieren und zu identifizieren.
HINTERGRUND NACH DEM STAND DER TECHNIK
Das Verfahren der Verzweigte-DNA-(bDNA-)Signalamplifikation wurde in einem Mikrowell-Format ausgiebig verwendet, um spezifische Nucleinsäure-Sequenzen zu detektieren und zu quantifizieren. Urdes et al., Branched-DNA (bDNA) Technology, in: Nonradioactive Analysis of Biomolecules, 388-395, C. Kessler (Hrsg.), Springer-Verlag, New York (2000). Von Natur aus quantitativ und hochgradig reproduzierbar, kann bDNA auf die Detektion jeglichen Nucleinsäure-Targets angewandt werden, für das ohne die Verwendung von radioaktiven Sonden eine Sequenz bekannt ist.
Es wurden eine Reihe an bDNA-Tests für die Quantifizierung von viralen Nucleinsäuren entwickelt. Diese umfassen: die RNA des menschlichen Typ-1-Immundefizienzvirus (HIV-1), Kern et al., J. Clin. Microbiol. 34, 3196-3203 (1996); die RNA des Affen-Immundefizienzvirus (SIV), Sodora et al., AIDS Res. Hum. Retroviruses 14, 171-181 (1998); die DNA des Hepatitis-B-Virus (HBV), Hendricks et al., Am. J. Clin. Pathol. 104, 537-546 (1995); die RNA des Hepatitis-C-Virus (HCV), Detmer et al., J. Clin. Microbio. 34, 901-907 (1996); die RNA des Hepatitis-G-Virus (HGV), Brandhagen et al., Am. J. Gastroenterol. 94, 1000-1005 (1999); sowie die DNA des Zytomegalievirus (CMV), Chernoff et al., J. Clin. Microbiol. 35, 2740-2744 (1997).
Vor kurzer Zeit wurde die bDNA-Technologie verwendet, um die Expression zellulärer mRNAs zu detektieren und zu messen, unter anderem: Zytokine, Breen et al., Cell. Immunol. 178, 91-98 (1997), und Shen et al., J. Immunol. Methods 215, 123-134 (1998); Progesteron- und Östrogen-Rezeptoren, Nargessi et al., Breast Cancer Res. Treat. 50, 47-55 (1998), sowie Nargessi et al., Breast Cancer Res. Treat. 50, 57-62 (1998); Insulin, Wang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94, 4360-4365 (1997); Glucokinase, Cabrera-Valladares et al., Endocrinology 140, 3091-3096 (1999); c-fos, Shyamala et al., Anal. Biochem. 266, 140-147 (1999); sowie aP2, Burris et al., Mol. Endocrinol. 13, 410-417 (1999). Alle dieser bDNA-Tests wurden entwickelt, um Nucleinsäuren in Serum, Plasma oder Zelllysaten zu messen. Keine dieser Studien deutet jedoch auf einen bDNA-Test zur Detektion von Nucleinsäuren in morphologisch intakten Zellen oder Geweben hin oder offenbart einen solchen.
Im Gegensatz dazu hätte ein In-situ-Hybridisierungs-(ISH-)Test notwendigerweise die Fähigkeit, spezifische Nucleinsäuresequenzen in morphologisch intakten Zellen oder Geweben zu detektieren. Die ISH-Verfahren wurden seit der Einführung des allgemeinen Konzepts durch Pardue und Gall vor über zwanzig Jahren verbessert. Pardue et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 64, 600-604 (1969). Die Verwendung von nicht isotopischen Sonden hat z.B. die inhärenten Probleme eliminiert, die mit radioaktiven ISH-Verfahren assoziiert waren, z.B. lange Umlaufzeiten, das Risiko eines Aussetzens gegenüber Radioaktivität und Müllentsorgung. Zusätzlich dazu hat die Inkorporation verschiedener Target- und Signalamplifikationssysteme die (SH-Empfindlichkeit verbessert. Trotz dieser Fortschritte bei den ISH-Verfahren muss immer noch eine Reihe an Herausforderungen bewältigt werden. Diese Herausforderungen umfassen das Entwickeln einer empfindlichen und spezifischen Target-Detektion, das Sicherstellen einer genauen Co-Lokalisierung des Signals und des Targets, das Erhalten von Targetsequenzen und das Erhalten von zellulärer und Gewebemorphologie. Zusätzlich dazu müssen ISH-Verfahren eine Reihe an praktischen Bedenken ansprechen, unter anderem leichte Verwendbarkeit, Reproduzierbarkeit und mögliche Quantifizierung, mögliche Automatisierung, Vielseitigkeit und zeitgerechte Fertigstellung.
Die katalysierte Reporter-Abscheidung-Tyramid-Signalamplifikation (CARD/TSA) ist ein ISH-Verfahren, das vorgeschlagen wurde, um einige dieser Herausforderungen und Bedenken anzusprechen. Einige Studien haben gezeigt, dass das CARD/TSA-ISH-Verfahren 1-2 Kopien der HPV-16-DNA in SiHa-Zellen detektieren kann. Siadat-Pajouh et al., J. Histochem. Cytochem. 42, 1503-1512 (1994), und Adler et al., Histochem. Cell. Biol. 108, 321-324 (1997).
Eine Studie zeigte, dass es möglich ist, die bDNA-Technologie an ein ISH-Format anzupassen für die Detektion von mRNA. Cao et al., Proceedings of the American Association for Cancer Research, 89. Treffen, New Orleans, LA (1998), sowie Antao et al., In Situ Hybridization Using the bDNA Technology, in: Techniques in Quantification and Localization of Gene Expression, B. K. Patterson (Hrsg.), 81-93, Boston, Birkhauser Press (1999). Antao et al. beschreiben die Verwendung des bDNA-Verfahrens für die In-situ-Hybridisierung an RNA in einzelnen Zellen. Die Hauptschritte im bDNA-Test sind die Vorhybridisierung, die sequentielle Hybridisierung mit Target-Sonden, Preamplifier-, Amplifier- und Markierungssonde und schließlich die Signalerzeugung und -detektion. Der in dieser Studie beschriebene Test besitzt jedoch eine relativ geringe Empfindlichkeit.
Es besteht daher weiter ein Bedarf in dem Gebiet der Erfindung, hochgradig empfindliche Verfahren für die In-situ-Detektion von Nucleinsäureanalyten in biologischen Proben bereitzustellen. Die vorliegende Erfindung erfüllt diese und andere Bedürfnisse, die in dem Gebiet der Erfindung bestehen.
OFFENBARUNG DER ERFINDUNG
Dementsprechend ist es ein Hauptziel der Erfindung, den oben angesprochenen Bedürfnissen in dem Gebiet der Erfindung gerecht zu werden, und zwar durch das Bereitstellen eines Verfahrens für die In-situ-Detektion eines Nucleinsäureanalyten in einer Probe an biologischem Material, basierend auf der bDNA-Hybridisierung, worin das Verfahren zu einer erhöhten Empfindlichkeit führt.
Das Verfahren der Erfindung kann verwendet werden, um die Position, d.h. subzelluläre Position, eines Nucleinsäureanalyten innerhalb einer einzelnen Zelle zu identifizieren, und zwar basierend auf einem bDNA-Hybridisierungsverfahren.
Zusätzliche Ziele, Vorteile und neue Merkmale der Erfindung werden teilweise in der folgenden Beschreibung offenbart und werden für den Fachmann teilweise nach Untersuchung des Folgenden erkenntlich, oder sie gehen aus der Durchführung der Erfindung hervor.
Entsprechend der Erfindung wird daher ein Verfahren zur In-situ-Detektion eines Nucleinsäureanalyten in einer Probe biologischen Materials bereitgestellt, umfassend die Durchführung einer bDNA-Hybridisierung, die folgende Schritte umfasst:

(a) die Vorbereitung einer Probe biologischen Materials durch:
(i) Immobilisieren des biologischen Materials auf einem Substrat;
(ii) Permeabilisieren des substratgebundenen biologischen Materials durch Kontaktieren des substratgebundenen biologischen Materials mit einer Lösung, die Proteinase K in einer Konzentration von 0,5 μg/ml bis 50 μg/ml enthält;
(iii) Behandeln der Probe mit RNase, um jegliche RNA aus der Probe zu entfernen; und
(iv) Erhitzen des permeabilisierten biologischen Materials auf eine Temperatur und über einen Zeitraum, die wirksam sind, um jegliche doppelsträngige DNA zu denaturieren;
(b) das Kontaktieren des biologischen Materials mit einer Target-Oligonucleotidsonde unter Hybridisierungsbedingungen, worin zumindest ein Abschnitt der Targetsonde zu zumindest einem Abschnitt des Nucleinsäureanalyten komplementär ist, sodass ein Analyt-Targetsonde-Komplex gebildet wird, wenn der Nucleinsäureanalyt in der Probe vorhanden ist;
(c) das Waschen des biologischen Materials mit einer ein Detergens umfassenden Waschflüssigkeit bei einer Temperatur im Bereich von 21 bis 60 °C; und
(d) das Detektieren jeglicher Analyt-Targetsonde-Komplexe auf dem Substrat durch
(i) das Kontaktieren des gewaschenen Substrats und des Analyt-Targetsonde-Komplexes mit einer Preamplifier-Oligonucleotidsonde unter Hybridisierungsbedingungen, worin ein erster Abschnitt der Preamplifiersonde zu einem anderen Abschnitt der Targetsonde komplementär ist als dem Abschnitt der Targetsonde, der zum Nucleinsäureanalyten komplementär ist, wodurch ein Analyt-Targetsonde-Preamplifiersonde-Komplex gebildet wird, wenn der Nucleinsäureanalyt in der Probe vorhanden ist;
(ii) Kontaktieren des Produkts aus Schritt (d) (i) mit einer Amplifier-Oligonucleotidsonde unter Hybridisierungsbedingungen, worin ein erster Abschnitt der Amplifiersonde zu einem zweiten Abschnitt der Preamplifiersonde komplementär ist, wodurch ein Analyt-Targetsonde-Preamplifiersonde-Amplifiersonde-Komplex gebildet wird, wenn der Nucleinsäureanalyt in der Probe vorhanden ist;
(iii) Kontaktieren des Produkts aus Schritt (d) (ii) mit einer Markierungssonde, die eine an alkalische Phosphatase konjugierte Oligonucleotidsonde umfasst, unter Hybridisierungsbedingungen, worin ein Abschnitt der Markierungssonde an einen zweiten Abschnitt der Amplifiersonde bindet, wodurch ein Analyt-Targetsonde-Preamplifiersonde-Amplifiersonde-Markierungssonde-Komplex gebildet wird, wenn der Nucleinsäureanalyt in der Probe vorhanden ist;
(iv) Markieren des Analyt-Targetsonde-Preamplifiersonde-Amplifiersonde-Markierungssonde-Komplexes mit einer detektierbaren Markierung; und
(v) Detektieren der Gegenwart der Markierung auf dem Substrat, worin der Nucleinsäureanalyt DNA, ein endogenes Gen oder ein Segment davon ist.

Es ist bevorzugt, dass der Nucleinsäureanalyt aus der aus HIV-DNA, CMV-DNA, HPV-DNA, LAP und IL-2 bestehenden Gruppe ausgewählt ist.
In einer zweiten Ausführungsform wird ein Verfahren zur Identifikation der Position eines Nucleinsäureanalyten in einer Zelle einer Probe an biologischem Material bereitgestellt, und zwar basierend auf bDNA-Hybridisierung. Dieses Verfahren zur Lokalisierung oder Identifikation der Position eines Nucleinsäureanalyten umfasst dieselben Schritte wie oben im Hinblick auf die In-situ-Detektion eines Nucleinsäureanalyten beschrieben. Ist die Markierung jedoch einmal detektiert, so gibt die Identifikati on der Position des Analyt-Targetsonde-Komplexes in einer Zelle der biologischen Probe die Position des Nucleinsäureanalyten in der Zelle an.
In einer anderen Ausführungsform wird ein Verfahren für die Detektion eines Nucleinsäureanalyten in einer Probe an biologischem Material bereitgestellt, wobei das Verfahren die Durchführung einer bDNA-Hybridisierung umfasst, um den Nucleinsäureanalyt in situ zu detektieren, worin das Verfahren eine Empfindlichkeit besitzt, die ausreicht, um von etwa 1 bis etwa 10 Kopien des Nucleinsäureanalyten in dem biologischen Material zu detektieren.
KURZBESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1 ist eine schematische Darstellung eines bDNA-ISH-Verfahrens gemäß der vorliegenden Erfindung.
Die 2A, 2B, 2C, 2D, 2E, 2F, 2G und 2H sind mikroskopische (60×-)Bilder von in Beispiel 1 erhaltenen Ergebnissen.
Die 3A, 3B, 3C und 3D sind mikroskopische (60×-)Bilder von in Beispiel 2 erhaltenen Ergebnissen.
Die 4A, 4B, 4C und 4D sind mikroskopische (60×-)Bilder von in Beispiel 3 erhaltenen Ergebnissen.
Die 5A, 5B, 5C, 5D und 5E sind mikroskopische Bilder von in Beispiel 4 erhaltenen Ergebnissen.
Die 6A, 6B und 6C sind mikroskopische Bilder von in Beispiel 5 erhaltenen Ergebnissen.
Die 7A, 7B, 7C, 7D, 7E, 7F und 7G sind mikroskopische Bilder von in Beispiel 6 erhaltenen Ergebnissen.
MODI ZUR DURCHFÜHRUNG DER ERFINDUNG
I. DEFINITIONEN UND ÜBERBLICK
Bevor die vorliegende Erfindung im Detail beschrieben wird, ist anzumerken, dass diese Erfindung nicht auf die spezifischen Sonden, Reagenzien, Testformate oder dergleichen beschränkt ist, da diese variieren können. Es ist ebenso anzumerken, dass die hierin verwendete Terminologie nur dem Zweck der Beschreibung bestimmter Ausführungsformen dient und nicht als einschränkend verstanden werden soll.
Es muss angeführt werden, dass, wie in dieser Beschreibung und in den im Anhang befindlichen Ansprüchen verwendet, die Singular-Formen „ein/eine", „ein" und „der/die/das" Plural-Formen umfassen, falls aus dem Kontext nicht klar und deutlich etwas anderes hervorgeht. Daher umfasst z.B. ein Verweis auf „einen Analyten-Targetsonden-Komplex" zwei oder mehr solche Komplexe, ein Verweis auf einen „Wasch"-Schritt umfasst zwei oder mehr solche Waschschritte und dergleichen.
In dieser Beschreibung und in den folgenden Ansprüchen wird die folgende Terminologie gemäß den unten stehend offenbarten Definitionen verwendet.
„Oligonucleotid" ist als generisch für Polydesoxyribonucleotide (enthaltend 2'-Desoxy-D-Ribose oder modifizierte Formen davon), für Polyribonucleotide (enthaltend D-Ribose oder modifizierte Formen davon) und für eine beliebige andere Art an Polynucleotid, die ein N-Glycosid einer Purin- oder Pyrimidin-Base oder einer modifizierten Purin- oder Pyrimidin-Base ist, zu verstehen. Die Oligonucleotide können einzelsträngig oder doppelsträngig sein, typischerweise sind sie einzelsträngig. Die in der vorliegenden Erfindung verwendeten Oligonucleotide umfassen auch normalerweise von etwa 2 bis etwa 100 Monomereinheiten, noch typischer von etwa 2 bis etwa 80 Monomereinheiten und insbesondere von etwa 2 bis etwa 60 Monomer-Einheiten.
Der Begriff „Nucleinsäureanalyt" bezieht sich auf ein einzel- oder doppelsträngiges Nucleinsäuremolekül, das eine Target-Nucleotidsequenz enthält. Der Nucleinsäureanalyt kann aus einer Reihe an Quellen stammen, z.B. biologischen Flüssigkeiten oder Feststoffen, Lebensmitteln, in der Umgebung befindlichen Materialen etc. Der Begriff „Nucleinsäureanalyt" wird hierin austauschbar mit dem Begriff „Analyt" verwendet.
Wie hierin verwendet, beziehen sich die Begriffe „Target-Region" oder „Target-Nucleotidsequenz" auf eine sondenbindende Region, die in dem Nucleinsäureanalyt enthalten ist. Die Target-Region muss zumindest 400 Basen lang sein. Der Begriff „Target-Sequenz" bezieht sich auf eine Sequenz, mit der eine Sonde, z.B. eine Target-Oligonucleotidsonde, unter den gewünschten Bedingungen ein stabiles Hybrid bildet.
Wie hierin verwendet, beziehen sich die Begriffe „Sonde" und „Oligonucleotidsonde" auf eine Struktur, die aus einem Oligonucleotid besteht, wie oben definiert, die eine Nucleinsäuresequenz umfasst, die zu einem Abschnitt einer Target-Nucleotidsequenz komplementär ist, zumindest eine andere Sonde oder beides. Die Oligonucleotid-Regionen der Sonden können aus DNA und/oder RNA und/oder synthetischen Nucleotidanaloga bestehen.
Man wird es zu schätzen wissen, dass die Bindungssequenzen keine perfekte Komplementarität besitzen müssen, um stabile Hybride bereitzustellen. In zahlreichen Situationen bilden sich stabile Hybride, wo weniger als etwa 10 % der Basen Fehlpaarungen sind, wobei Schleifen von vier oder mehr Nucleotiden ignoriert werden. Dementsprechend bezieht sich der Begriff „komplementär" auf ein Oligonucleotid, das unter Testbedingungen einen stabilen Duplex mit seinem „Komplement" bildet, im Allgemeinen, wenn die Homologie bei etwa 90 % oder mehr liegt.
Wie hierin verwendet, werden die Begriffe „biologische Probe" oder „biologisches Material" austauschbar verwendet und beziehen sich jeweils auf eine Probe an Gewebe, Zellen oder Flüssigkeit, die aus einem Individuum isoliert wurde, umfassend, jedoch nicht eingeschränkt auf, z.B. Plasma, Serum, Rückenmarksflüssigkeit, Samen, Lymphflüssigkeit, die externen Sekrete der Haut, die Sekrete der Atemwege, die Sekrete des Darmtrakts, die Sekrete des Urogenitaltrakts, Tränen, Speichel, Milch, Blutzellen, Tumoren, Organe sowie auch Proben von In-vitro-Zellkulturkonstituenten (umfassend, jedoch nicht eingeschränkt auf, konditioniertes Medium, das aus dem Wachstum von Zellen in Zellkulturmedium entsteht, mutmaßlich viral infizierte Zellen, rekombinante Zellen und Zellkomponenten). Es wird bevorzugt, dass die biologische Probe die Form einer Flüssigkeit aufweist, z.B. Gewebe oder Zellen in einer Flüssigkeit, obwohl auch festes Gewebe verwendet werden kann. Bevorzugte Verwendungen des vorliegenden Verfahrens bestehen in der Detektion und/oder Quantifizierung von Nucleinsäuren wie folgt: (a) virale Nucleinsäuren, wie z.B. aus dem Hepatitis-B-Virus („HBV"), dem Hepatitis-C-Virus („HCV"), dem Hepatitis-G-Virus („HGV"), dem menschlichen Immundefizienzvirus („HIV"), dem menschlichen Papillomavirus („HPV") und der Herpes-Virusfamilie, umfassend Herpes Zoster (Windpocken), Herpes-simplex-Virus-Typen I & II, das Zytomegalievirus („CMV") und das Epstein-Barr-Virus; (b) bakterielle Nucleinsäuren, wie z.B. Chlamydien, Mycobakterium tuberculosis etc.; sowie (c) zahlreiche menschliche Sequenzen von Interesse, unter anderem lysosomale saure Phosphatase („LAP"), Interleukin-2 (IL-2) und Interferon-γ (INF).
Der Begriff „Hybridisierungsbedingungen" soll jene Bedingungen in Bezug auf Zeit, Temperatur und pH sowie die notwendigen Mengen und Konzentrationen an Reaktanten und Reagenzien beschreiben, die ausreichen, um das Annealing von zumindest einem Teil einer Sonde mit ihrer komplementären Sequenz zu ermöglichen. Wie nach dem Stand der Technik wohlbekannt ist, hängen die Zeit-, die Temperatur- und die pH-Bedingungen, die erforderlich sind, um die Hybridisierung zu erreichen, von der Größe der zu hybridisierenden Oligonucleotidsonde, vom Ausmaß der Komplementarität zwischen der Oligonucleotidsonde und dem Target und von der Gegenwart anderer Materialien in der Hybridisierungsreaktionsmischung ab. Die tatsächlichen Bedingungen, die für jeden Hybridisierungsschritt erforderlich sind, sind nach dem Stand der Technik wohlbekannt oder können ohne übermäßiges Experimentieren bestimmt werden.
Typische Hybridisierungsbedingungen umfassen die Verwendung von Lösungen, die auf einen pH von etwa 7 bis etwa 8,5 gepuffert sind, und werden bei Temperaturen von etwa 30 °C bis etwa 55 °C, vorzugsweise von etwa 37 °C bis etwa 55 °C, für eine Zeitspanne von etwa 1 Sekunde bis zu etwa 1 Tag, vorzugsweise von etwa 15 Minuten bis etwa 16 Stunden und insbesondere bevorzugt von etwa 15 Minuten bis etwa 3 Stunden, durchgeführt.
„Hybridisierungsbedingungen" erfordern auch einen wirksamen Puffer. Es kann jeder Puffer, der kompatibel, d.h. chemisch inert, im Hinblick auf die Sonden und andere Komponenten ist, jedoch trotzdem eine Hybridisierung zwischen Komplementaritäts-Basenpaaren ermöglicht, verwendet werden. Ein besonders bevorzugter Puffer, hierin als „Hybridisierungslösung A" bezeichnet, umfasst 3 × SSC, 50 % Formamid, 10 % Dextransulfat (MG 500.000), 0,2 % Casein, 10 μg/ml Poly A, 100 μg/ml denaturierte Lachsspermien-DNA, worin 1 × SSC 0,15 M Natriumchlorid und 0,015 M Natriumcitrat umfasst. Ein weiterer, besonders bevorzugter Puffer, hierin als „Hybridisierungslösung B" bezeichnet, umfasst 5 × SSC, 0,1 bis 0,3 % Natriumdodecylsulfat, 10 % Dextransulfat, 1 mM ZnCl₂ und 10 mM MgCl₂, worin 1 × SSC wie oben stehend definiert ist.
„Gegebenenfalls" bedeutet, dass die im Anschluss beschriebenen Umstände zutreffen können oder auch nicht, so dass die Beschreibung Fälle umfasst, in denen der Fall eintritt, und Fälle, in denen dies nicht der Fall ist. So umfasst z.B. „gegebenenfalls das Erhitzen des permeabilisierten biologischen Materials" Fälle, in denen das permeabilisierte biologische Material erhitzt wird, und Fälle, in denen das permeabilisierte biologische Mateial nicht erhitzt wird.
Das Verfahren der vorliegenden Erfindung ist ein In-situ-bDNA-Hybridisierungstest. Wie nach dem Stand der Technik anerkannt wird, stellen bDNA-basierte Verfahren einen wirksamen Weg zur Amplifikation eines Signals dar, das andernfalls mit anderen Verfahren nicht detektierbar wäre. Der Fachmann ist mit den für die Durchführung von bDNA-basierten Tests erforderlichen Verfahren und Materialien vertraut.
Kurz gesagt, umfasst bei einer bDNA-Amplifikation eine Target-Oligonucleotidsonde zwei Stellen: eine zur spezifischen Hybridisierung mit einem Abschnitt des Nucleinsäureanalyten und eine zur spezifischen Hybridisierung mit zumindest einer anderen Sonde. Zusätzliche Oligonucleotidsonden mit einzigartigen Stellen, die dafür ausgelegt sind, spezifisch an verschiedene Sonden zu hybridisieren, können verwendet werden, so dass wiederholte Stadien der Hybridisierung vorkommen und eine verzweigte DNA-Struktur gebildet wird. Die End-Oligonucleotidsonde, die in der verzweigten Struktur durch Annealing verbunden werden soll, trägt zumindest eine detektierbare Markierung in sich. Daher führt das ursprüngliche Targetmolekül zu einer Vielzahl an Signalen, wodurch das Signal zur einfachen Detektion amplifiziert wird. Zusätzlich dazu kann auf die einschlägige(n) Literatur, Texte und auf andere Verweise für eine Beschreibung herkömmlicher bDNA-Verfahren verwiesen werden. Siehe z.B. Collins et al., Nucleic Acid Res. 25 (15), 2979-2984 (1997).
Die vorliegende Erfindung stellt hochgradig empfindliche Verfahren zur Detektion eines Nucleinsäureanalyten basierend auf In-situ-bDNA-Hybridisierung bereit. Vorherige In-situ-bDNA-Hybridisierungsverfahren haben relativ unempfindliche Resultate bereitgestellt. Die vorliegende Erfindung stellt jedoch ein In-situ-bDNA-Verfahren bereit, das hochgradig empfindlich ist, z.B. mit einer Empfindlichkeit, die ausreicht, um etwa 1 bis etwa 10 Kopien eines Nucleinsäureanalyten in biologischem Material zu detektieren.
II. DAS DETEKTIONSVERFAHREN
In einer ersten Ausführungsform stellt die Erfindung ein Verfahren zur In-situ-Detektion eines Nucleinsäureanalyten in einer Probe an biologischem Material bereit, und zwar basierend auf bDNA-Hybridisierung.
Das Verfahren umfasst die Schritte des (a) Vorbereitens der Probe biologischen Materials, (b) Kontaktierens des biologischen Materials mit einer Target-Oligonucleotidsonde unter Hybridisierungsbedingungen, (c) des Waschens des biologischen Mate rials und (d) des Detektierens jeglichen Analyt-Targetsonde-Komplexes auf dem Substrat.
Die Probe des biologischen Materials wird durch herkömmliche Verfahren erhalten und umfasst z.B. die Biopsie und die biologische Flüssigkeitsextraktion. Da das Verfahren für die In-situ-Analyse gedacht ist, können jedoch Gewebe, Zellen oder Organellen anstatt eines Lysats analysiert werden. Beim Erhalt und beim Umgang mit Gewebe, Zellen oder Organellen muss während des ganzen Tests vorsichtig vorgegangen werden, um sicherzustellen, dass das Material im Wesentlichen intakt bleibt.
Die biologische Probe zur Verwendung im vorliegenden Verfahren, d.h. die Gewebe oder Zellen, die zu analysieren sind, können aus einem beliebigen Körperteil stammen, solange vom biologischen Material angenommen wird, dass es den Analyten von Interesse enthält. Geeignete Gewebe zur Verwendung im vorliegenden Verfahren umfassen z.B., ohne Einschränkung, Gewebe aus den Nebennieren, der Blase, dem Knochenmark, dem Gehirn, der Brust, dem Herzen, dem Kolon, dem Ösophagus, dem Darm, den Nieren, der Leber, der Lunge, den Lymphknoten, den Nerven, den Eierstöcken, dem Pankreas, der Prostata, den (quergestreiften) Skelettmuskeln, den glatten Muskeln, der Milz, dem Magen, den Hoden, den Tonsillen, der Luftröhre und dem Uterus. Weiters sind Zellen, die aus denselben Geweben entnommen werden, für die hierin beschriebenen Verfahren geeignet. Zusätzlich dazu können Zellen, wie oben stehend beschrieben, aus zellhältigen Flüssigkeiten, wie z.B. Plasma, Serum, Rückenmarksflüssigkeit etc., erhalten werden. Anfänglich muss das biologische Material konserviert oder „fixiert" werden. Obwohl nach dem Stand der Technik zahlreiche Verfahren zur Fixierung von biologischen Proben bekannt sind, wird es bevorzugt, dass die biologische Probe mit Formaldehyd fixiert wird. Das biologische Material kann mit einer 4-%-Formaldehyd-Lösung 30 Minuten lang auf Eis kombiniert werden. Alternativ dazu können auch andere Fixiermittel, z.B. Alkohol, verwendet werden. Einmal fixiert, muss das biologische Material auf einem Substrat immobilisiert werden. Geeignete Substrate umfassen jene Materialien, die eine Immobilisierung eines Gewebes, einer Zelle oder Organelle ermöglichen, während die Morphologie der Probe beibehalten wird. Das Substratmaterial muss zusätzlich zu der Ei genschaft hitzeresistent auch fest sein. Weiters muss das Substrat inert sein im Hinblick auf die verwendeten Reagenzien. Bevorzugte Substrate umfassen Glas, z.B. einen Glas-Objektträger, obwohl auch elastischer Kunststoff verwendet werden kann.
Das biologische Material kann auf dem Substrat unter Verwendung herkömmlicher Verfahren immobilisiert werden. Für Zellen wird bevorzugt, dass das biologische Material unter Verwendung einer Zentrifuge immobilisiert wird. Im Allgemeinen liegt die für das Immobilisieren des biologischen Materials auf das Substrat erforderliche Kraft bei von etwa 200 × g bis etwa 500 × g (Mal der Schwerkraft). Es wird bevorzugt, wenn die verwendete Kraft bei etwa 300 × g liegt.
Die Immobilisierung der Gewebeproben wird vorzugsweise durch das Schneiden sehr dünner Schnitte der Gewebeprobe und das Platzieren dieser auf ein geeignetes Substrat durchgeführt. Vorzugsweise wird das Gewebe zuerst in einem Kryostat platziert und auf etwa –15 °C bis etwa –20 °C gekühlt, um das Gewebe zu frieren. Anschließend wird ein Mikrotom verwendet, um das gefrorene Gewebe in Abschnitte zu zerschneiden. Danach wird ein einzelner Abschnitt auf ein Substrat platziert, z.B. einen Glas-Objektträger, und es wird dem Abschnitt ermöglicht, auf dem Substrat zu „schmelzen", wodurch die Probe immobilisiert wird. Anstatt gefrorener Gewebe können Gewebe verwendet werden, die mit Wachs, z.B. Parafin, infundiert wurden. Wie man ebenfalls zu schätzen weiß, können andere Verfahren für die Immobilisierung der Gewebeprobe verwendet werden.
Um sicherzustellen, dass die Oligonucleotidsonden Zugang zu der internen Umgebung haben, ist es notwendig, das substratgebundene biologische Material permeabel zu machen. Es wurde herausgefunden, dass das Kontaktieren des substratgebundenen biologischen Materials mit einer Lösung, enthaltend Proteinase K in einer Konzentration von etwa 0,5 μg/ml bis etwa 50 μg/ml, vorzugsweise von etwa 5 μg/ml bis etwa 20 μg/ml (einer Stammlösung mit einer Aktivität von 600 Einheiten pro ml), das biologische Material in einem ausreichenden Ausmaß permeabel macht, so dass die Sonden biologische Membranen frei passieren können, während die Morphologie der Probe beibehalten wird. Die Zeit- und die Temperatur-Parameter zum Permeabel-Machen des biologischen Materials sind wohlbekannt oder können experimentell bestimmt werden. Eine Reaktionszeit von etwa 10 Minuten bei etwa 37 °C wird zur Permeabilisierung mit Proteinase K bevorzugt.
Wenn der Nucleinsäureanalyt doppelsträngige DNA umfasst, so ist es notwendig, die DNA zu denaturieren, so dass die Sondenhybridisierung durch Aussetzen der Probe gegenüber einer Hitzebehandlung erfolgen kann, und zwar mit einer Temperatur und für eine Zeitspanne, die wirksam ist, um jegliche doppelsträngige DNA zu denaturieren. Es wurde jedoch herausgefunden, dass das Erhitzen der DNA von etwa 1,5 Minuten bis etwa 5 Minuten ausreicht, um doppelsträngige DNA unter Erhaltung zellulärer Komponenten zu denaturieren. Die Temperatur kann eine beliebige Temperatur sein, die nach dem Stand der Technik bekannt ist und ausreicht, um DNA zu denaturieren. Es wird jedoch bevorzugt, dass die Temperatur bei von etwa 70 °C bis etwa 92 °C, vorzugsweise bei etwa 80 °C bis etwa 92 °C, liegt, wobei eine Temperatur von etwa 92 °C insbesondere bevorzugt wird.
Zusätzlich dazu ist es auch notwendig, wenn der Nucleinsäureanalyt DNA umfasst, etwaige RNA, die vorhanden sein kann, zu verdauen. Durch den Verdau der RNA können die Sonden nicht an die RNA hybridisieren, wodurch das Potential falsch positiver Resultate minimiert wird. Im Allgemeinen kann jedes beliebige Verfahren, das nach dem Stand der Technik für den Verdau von RNA bekannt ist, verwendet werden. Es wird jedoch bevorzugt, dass RNase (erhältlich bei Sigma, Fluka etc.) verwendet wird. RNase kann zu der Probe in einer Menge von etwa 25 μg bis etwa 100 μg (pro Fleck auf dem Objektträger) hinzugefügt werden, und es kann ihr ermöglicht werden, für eine gewisse Zeitspanne und bei einer Temperatur zu inkubieren, die ausreicht, um die RNA zu verdauen. Es wird jedoch bevorzugt, dass etwa 40 μg (pro Fleck auf dem Objektträger) an RNase zu der Probe hinzugefügt werden und bei eine Stunde lang 37 °C gehalten werden.
Andere Verfahren zur Vorbereitung des biologischen Materials sind erhältlich. Z.B. unter Verwendung von im Handel erhältlichen Sets, wie z.B. dem THINPREP^®-Objektträgersystem (Cytyc Corporation, Boxborough, MA).
Einmal hergestellt, wird das biologische Material unter Hybridisierungsbedingungen in Kontakt mit einer Target-Oligonucleotidsonde gebracht. Die Target-Sonde besitzt einen Abschnitt, der komplementär zu zumindest einem Abschnitt der Targetsequenz des Nucleinsäureanalyten ist. Ist der Nucleinsäureanalyt von Interesse in der Probe vorhanden, so hybridisieren der Nucleinsäureanalyt und die Target-Sonde, um einen Analyt-Targetsonden-Komplex zu bilden.
Die Menge der hinzugefügten Target-Sonden kann experimentell bestimmt werden, es wird jedoch bevorzugt, dass etwa 0,1 pmol bis etwa 10 pmol hinzugefügt werden (pro Fleck auf dem Objektträger), und es wird das Inkubieren bei 40 °C für etwa 3 Stunden ermöglicht. Ein bevorzugtes Reaktionsmedium für diesen Hybridisierungsschritt ist die Hybridisierungslösung A (oben stehend definiert).
Ist einmal eine ausreichende Inkubationszeitspanne verstrichen, so werden, falls vorhanden, sowohl das Substrat als auch der Analyt-Targetsonden-Komplex gewaschen, um die Entfernung ungebundener Target-Sonden zu erleichtern. Der Waschschritt erfordert die Verwendung einer Waschflüssigkeit, die im Allgemeinen ein Detergens und im Allgemeinen eine Pufferlösung umfasst.
Die Pufferlösung kann eine beliebige herkömmliche Lösung sein, die nach dem Stand der Technik bekannt ist und die für die Entfernung nicht hybridisierter Oligonucleotidsonden geeignet ist. Bevorzugte Pufferlösungen umfassen Alkalimetallsalze. Besonders bevorzugte Pufferlösungen umfassen Natriumchlorid, Natriumcitrat und Kombinationen davon.
Das Detergens ist vorzugsweise ein nicht ionisches Detergens. Zusätzlich dazu wird bevorzugt, wenn das Detergens auch ein hydrophiles Tensid ist. Beispiele für Detergenzien umfassen Polyoxyethylen-basierte Detergenzien, z.B. BRIJ^® und TRITON^®.
Ähnliche Detergenzien, die auch für die Verwendung in der vorliegenden Erfindung geeignet sind, werden unter dem Handelsnamen TWEEN^®, GENAPOL^®, IGEPAL CA^®, THESIT^® und LUPROL^® verkauft (alle von kommerziellen Lieferanten erhältlich).
Ist einmal die Waschflüssigkeit bestimmt, so wird der Waschschritt zumindest einmal, vorzugsweise zwei Mal und insbesondere bevorzugt drei Mal, durchgeführt. Es wurde herausgefunden, dass die Temperatur des Waschschritts die Empfindlichkeit des Tests beeinflusst. Daher funktionieren für das vorliegende Verfahren Temperaturen im Bereich von etwa 21 °C bis etwa 60 °C gut und werden verwendet. Optimalerweise wird der Waschschritt bei Raumtemperatur durchgeführt.
Ist der Waschschritt einmal abgeschlossen, so fehlen nicht hybridisierte Target-Sonden. Analyt-Targetsonden-Komplexe auf dem Substrat werden anschließend detektiert, um die Gegenwart des Nucleinsäureanalyten zu bestimmen. Dementsprechend werden zusätzliche Oligonucleotidsonden hinzugefügt, so dass ein verzweigtes Netzwerk gebildet wird: Hat sich einmal ein verzweigtes Netzwerk gebildet, so wird eine Vielzahl an detektierbaren Markierungen hinzugefügt, und zwar mit der Wirkung der „Amplifikation" des Signals zur leichteren Detektion. Daher wird die Detektion eines Analyt-Targetsonden-Komplexes durch Folgendes erreicht:

(d) (i) das Kontaktieren des gewaschenen Substrats und des Analyt-Targetsonde-Komplexes mit einer Preamplifier-Oligonucleotidsonde unter Hybridisierungsbedingungen, worin ein erster Abschnitt der Preamplifiersonde zu einem anderen Abschnitt der Targetsonde komplementär ist als dem Abschnitt der Targetsonde, der zum Nucleinsäureanalyten komplementär ist, wodurch ein Analyt-Targetsonde-Preamplifiersonde-Komplex gebildet wird, wenn der Nucleinsäureanalyt in der Probe vorhanden ist;
(d) (ii) Kontaktieren des Produkts aus Schritt (d) (i) mit einer Amplifier-Oligonucleotidsonde unter Hybridisierungsbedingungen, worin ein erster Abschnitt der Amplifiersonde zu einem zweiten Abschnitt der Preamplifiersonde komplementär ist, wodurch ein Analyt-Targetsonde-Preamplifiersonde-Amplifiersonde-Komplex gebildet wird, wenn der Nucleinsäureanalyt in der Probe vorhanden ist;
(d) (iii) Kontaktieren des Produkts aus Schritt (d) (ii) mit einer Markierungssonde, die eine an alkalische Phosphatase konjugierte Oligonucleotidsonde umfasst, unter Hybridisierungsbedingungen, worin ein Abschnitt der Markierungssonde an einen zweiten Abschnitt der Amplifiersonde bindet, wodurch ein Analyt-Targetsonde-Preamplifiersonde-Amplifiersonde-Markierungssonde-Komplex gebildet wird, wenn der Nucleinsäureanalyt in der Probe vorhanden ist;
(d) (iv) Markieren des Analyt-Targetsonde-Preamplifiersonde-Amplifiersonde-Markierungssonde-Komplexes mit einer detektierbaren Markierung; und
(d) (v) Detektieren der Gegenwart der Markierung auf dem Substrat.

Jeder der Sonden-Hybridisierungsschritte, d.h. Schritte (d) (i), (d) (ii) und (d) (iii), wird, wie oben stehend beschrieben, unter herkömmlichen Hybridisierungsbedingungen durchgeführt. Für diese bestimmten Hybridisierungsschritte wird jedoch bevorzugt, dass jeder Schritt bei etwa 55 °C mit einer Inkubationszeit von etwa 25 Minuten stattfindet. Es wird auch bevorzugt, dass zu jeder Sonde, d.h. Preamplifiersonde, Amplifiersonde und Markierungssonde, separat die Hybridisierungslösung B (oben stehend definiert) beigemischt wird, und zwar zum Kontaktieren jener Sonde mit dem wachsenden Komplex. Daher wird z.B. der Amplifiersonde die Hybridisierungslösung B beigemischt und in Kontakt mit dem Analyt-Targetsonde-Preamplifiersonde-Komplex platziert, um einen Analyt-Targetsonde-Preamplifiersonde-Amplifiersonde-Komplex zu bilden.
Obwohl die Menge der beigemischten Sonden unter Verwendung von Verfahren, die nach dem Stand der Technik bekannt sind, bestimmt werden kann, wird es bevorzugt, dass die Preamplifiersonde und die Amplifiersonde jeweils in einer Menge von etwa 1 fmol bis etwa 10 pmol (pro Fleck auf dem Objektträger) hinzugefügt werden. Insbesondere bevorzugt werden diese Sonden jeweils in einer Menge von etwa 1 fmol bis etwa 100 fmol (pro Fleck auf dem Objektträger) hinzugefügt.
Die Markierung wird erreicht, wenn die Markierungssonde an den Analyt-Targetsonde-Preamplifiersonde-Amplifiersonde-Komplex hybridisiert. Die Markierungssonde umfasst eine oder mehrere detektierbare Markierungen, die direkt oder indirekt ein detektierbares Signal bereitstellen. Die Markierungen können gebunden sein, kovalent oder nicht kovalent, und zwar an die Markierungssonde als einzelne Teile der komplementären Sequenz, oder sie können als terminaler Teil oder als terminaler Schwanz mit einer Vielzahl an Markierungen auftreten. Es wurden verschiedene Mittel zur Bereitstellung von Markierungen, die an eine Sonde gebunden sind, in der Literatur beschrieben. Siehe z.B. Leary et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80, 4045 (1983); Renz et al., Nucl. Acids Res. 12, 3435 (1984); Richardson et al., Nucl. Acids Res. 11, 6167 (1983); Smith et al., Nucl. Acids Res. 13, 2399 (1985); Meinkoth et al., Anal. Biochem. 138, 267 (1984).
Markierungen, die verwendet werden können, umfassen Fluoreszenzagenzien, Chemilumineszenzagenzien, Farbstoffe, Enzyme, Enzymsubstrate, Enzym-Cofaktoren, Enzyminhibitoren, Enzymuntereinheiten, Metallionen und dergleichen. Illustrative spezifische Markierungen umfassen unter anderem Fluorescein, Rhodamin, Texas-Rot, Phycoerythrin, Umbelliferon, Luminol, NADPH, α-β-Galactosidase, Meerrettich-Peroxidase sowie alkalische Phosphatase. Es wird zumindest eine alkalische-Phosphatase-Markierung verwendet.
Die Detektion der detektierbaren Markierung kann durch ein beliebiges, nach dem Stand der Technik bekanntes Verfahren erreicht werden und hängt von der Art der Markierung ab. Für Fluoreszenzagenzien ist eine große Anzahl an Fluorometern erhältlich. Für Chemilumineszenzagenzien sind Luminometer oder Filme erhältlich. Mit Enzymen kann ein fluoreszierendes, chemilumineszierendes oder gefärbtes Produkt bereitgestellt werden, und es kann fluorometrisch, luminometrisch, spektrophotometrisch oder visuell (vorzugsweise mit Hilfe eines Mikroskops) bestimmt werden. Für das vorliegende Verfahren wird es bevorzugt, dass das alkalische-Phosphatase-Substrat hinzugefügt wird, um die Gegenwart der alkalische-Phosphatase-Markierung unter Verwendung einer Hellfeld- oder einer Fluoreszenz-Mikroskopie zu detektieren.
Im Gegensatz zu vorhergehenden Tests ist das vorliegende Verfahren zur Detektion eines Nucleinsäureanalyten hochgradig empfindlich. Vorhergehende Tests basierten auf der Gegenwart zahlreicher – oftmals hunderter – Kopien des Nucleinsäureanalyten. Das vorliegende Verfahren wurde entwickelt, um relativ wenige Kopien zu detektieren. Daher wird bevorzugt, dass das Verfahren eine ausreichende Empfindlichkeit aufweist, um von 1 bis etwa 10 Kopien des Nucleinsäureanalyten zu detektieren. Es wird jedoch insbesondere bevorzugt, dass das Verfahren eine Empfindlichkeit besitzt, die ausreicht, um von 1 bis etwa 2 Kopien des Nucleinsäureanalyten zu detektieren.
III. SYNTHESE DER SONDEN
Die Sequenzen der Sonden werden unter Verwendung von Standardverfahren bestimmt, die nach dem Stand der Technik bekannt sind. Daher wird z.B. die Targetsonden-Sequenz unter Verwendung einer bekannten Sequenz des Analyten von Interesse bestimmt, der für diesen Analyten spezifisch ist. Jene Regionen der Sequenzen, die in die Bindung involviert sein sollen (und daher zu einer anderen Sequenz an Oligonucleotiden komplementär sind – entweder einer Sonde oder eines Analyten), umfassen zumindest 15 Nucleotide, normalerweise zumindest 20 Nucleotide und nicht mehr als etwa 100 Nucleotide. Typischerweise sind die Bindungssequenzen etwa 25 Nucleotide lang. Sie werden normalerweise so ausgewählt, dass sie an verschiedene Sequenzen des Analyten und/oder an spezifische und andere Abschnitte der verschiedenen Sonden binden. Zusätzlich dazu haben die Oligonucleotide für eine beliebige Reihe an Sonden optimalerweise dieselbe Schmelztemperatur.
Sonden mit einer zweiten Bindungssequenz werden ausgewählt, um im Wesentlichen komplementär zu dem geeigneten Abschnitt der Sonde zu sein. Die zweite Bindungssequenz kann an die erste Bindungssequenz angrenzen oder von dieser durch eine nicht komplementäre Zwischensequenz getrennt sein. Die Sonden können andere nicht komplementäre Sequenzen enthalten, falls gewünscht. Diese nicht komplementären Sequenzen dürfen jedoch die Bindung der Bindungssequenzen nicht behindern oder zu unspezifischer Bindung führen.
Die Sonden können durch Oligonucleotidsynthese oder durch Klonieren hergestellt werden, wobei Ersteres bevorzugt wird. Wie nun nach dem Strand der Technik wohlbekannt ist, umfassen Verfahren zur Synthese von Oligonucleotiden typischerweise die sequentielle Addition von 3'-blockierten und 5'-blockierten Nucleotidmonomeren zu der terminalen 5'-Hydroxylgruppe einer wachsenden Oligonucleotidkette, worin jede Addition durch den nucleophilen Angriff der terminalen 5'-Hydroxylgruppe der wachsenden Kette auf die 3'-Position des hinzugefügten Monomers ausgeführt wird, das typischerweise ein Phosphorderivat, wie z.B. ein Phosphotriester, Phosphoramidit oder dergleichen, ist.
IV. LOKALISIERUNG
Die vorliegende Erfindung stellt auch ein Verfahren zur Bestimmung der Lokalisierung oder der Position eines Nucleinsäureanalyten in einer Zelle bereit. Wie oben stehend angegeben, umfasst dieses Verfahren dieselben Schritte wie die In-situ-Detektion, fügt jedoch einen weiteren Schritt (e) des Identifizierens der Position des Analyt-Targetsonde-Komplexes in einer Zelle der biologischen Probe als Indikator der Position des Nucleinsäureanalyten in der Zelle hinzu. Vorherige In-situ-Detektionstests waren weniger präzise beim Aufzeigen der subzellulären Position des Signals. Das Signal bereits durchgeführter In-situ-Tests könnte z.B. nicht im subzellulären Kompartiment „enthalten" gewesen sein. Alternativ dazu kann das Signal vorhergehender In-situ-Tests über einen relativ großen Abschnitt der Zelle verbreitet gewesen sein, wodurch eine definitive Schlussfolgerung in Bezug auf die Lokalisierung des Nucleinsäureanalyten unmöglich gemacht wird. Da die Temperaturen für die Hybridisierung niedrig sind, d.h. im Allgemeinen 55 °C nicht übersteigen, und die Probe keiner rauen Behandlung unterzogen wird, macht das vorliegende Verfahren die Fähigkeit möglich, die Position eines einzelnen Analyten in einer Zelle zu bestimmen. Sogar dann, wenn die Temperatur für gewisse Schritte erhöht wird, z.B. auf etwa 92 °C, und zwar bei der Denaturierung der DNA durch Erhitzen, behält das vorliegende Verfahren trotzdem die Fähigkeit bei, die Position eines einzelnen Analyten in einer Zelle zu bestimmen.
V. NUTZEN
Das vorliegende Verfahren kann verwendet werden, um beliebige DNA, endogene Gene oder ein Segment davon zu detektieren, für welche die Sequenz bekannt ist. Bevorzugte Analyten, für die das Verfahren besonders gut geeignet ist, umfassen, sind jedoch nicht eingeschränkt auf, HIV-DNA, CMV-DNA, HPV-DNA, LAP, IL-2 und Gen-Transkripte.
Angesichts seiner Empfindlichkeit, der leichten Verwendung, der Vielseitigkeit, der Verlässlichkeit und der Schnelligkeit (Ergebnisse werden innerhalb eines Tages erhalten) besitzt das vorliegende Verfahren weite Anwendungsgebiete in der frühen Detektion von Krebsarten und Infektionskrankheiten. Die Einzelkopie-Detektion ist besonders für virale Erkrankungen, z.B. HIV und zahlreiche andere, von Vorteil, da die Diagnose viel früher gestellt werden kann (wenn die Viruslast noch relativ gering ist), wodurch früheres Einschreiten und Behandeln möglich wird. Zusätzlich dazu besitzt das vorliegende Verfahren Anwendungen im Bereich der Therapieauswahl. Das vorliegende Verfahren kann z.B. adaptiert werden, um schnell und genau die Anzahl der Genkopien des menschlichen epidermalen Wachstumsfaktor-Rezeptors 2 (HER2/neu) zu detektieren. Dies ist für die Entscheidung von Nutzen, ob mit einer Anti-HER2-Therapie begonnen werden soll, z.B. monoklonaler Anti-HER2-Antikörper-Therapie (Herceptin^®, erhältlich bei Genentech, Inc., South San Francisco, CA). Weiters kann das vorliegende Verfahren durch Modifikation zellulärer oder Gewebs-Vorbehandlungsbedingungen entweder mRNA oder DNA mit derselben Reihe an Sonden detektieren.
Das vorliegende Verfahren ist hochgradig spezifisch und ermöglicht eine genaue Lokalisierung der Targetsequenz in der Zelle, wenn ein Abschnitt der Nucleinsäure-Analytsequenz bekannt ist. Weiters ist eine Lokalisierung sogar dann möglich, wenn es nur eine einzige Kopie des Nucleinsäureanalyten in der Zelle gibt. Daher besitzt solch ein Test einen breiten Anwendungsrahmen und ist besonders in der Forschung und Medizin von Nutzen. In Rahmen von Gentherapien ist es z.B. nun möglich, zu bestimmen, ob das Medikament in das Zytoplasma und/oder den Nucleus eindringt.
Zusätzlich zu der Detektion von Krebsarten und Infektionskrankheiten und dem Assisitieren bei der Therapieauswahl besitzt die Fähigkeit, Nucleinsäuren in Gewebeschnitten unter Verwendung der vorliegenden Verfahren zu detektieren, weitere Vorteile. Die In-situ-Detektion in einer Gewebeprobe zeigt z.B. das Ausmaß, in dem sich eine Krebsart oder ein infektiöses Pathogen auf die umgebenden Gewebsbereiche ausgebreitet hat. Diese Information dient als prognostischer Indikator und stellt die Grundlage für die Fähigkeit bereit, einen geeigneten therapeutischen Ansatz für die Erkrankung maßzuschneidern.
Der Umfang der Erfindung wird durch die im Anhang befindlichen Ansprüche definiert.
EXPERIMENTELLER TEIL
Die folgenden Beispiele werden dargelegt, um dem Fachmann eine vollkommene Offenbarung und Beschreibung darüber zukommen zu lassen, wie die hieren offenbarten und beanspruchten Verbindungen herzustellen und zu verwenden sind. Es wurden Anstrengungen unternommen, um die Genauigkeit im Hinblick auf die Zahlen (z.B. Mengen, Temperatur etc.) sicherzustellen, dennoch sollten einige Fehler und Abweichungen miteinbezogen werden. Falls jedoch nicht anders angegeben, ist die Temperatur in °C angegeben, und der Druck liegt bei dem oder nahe dem Atmosphärendruck auf der Höhe des Meeresspiegels.
Falls nicht anders angegeben, wurden alle Ausgangsmaterialien und Reagenzien im Handel erworben (z.B. von Aldrich, Sigma und ICN) und ohne weitere Reinigung verwendet. Es wurden Standardzellkultur- und Zellernteverfahren verwendet.
BEISPIEL 1
DETEKTION VON HPV-DNA DURCH BDNA-ISH IN ZELLEN
A. Materialien und Verfahren
i. Zellkultur

Da sie verschiedene Stämme und Mengen des menschlichen Papillomavirus (HPV) enthalten, wurden die menschlichen zervikalen Karzinomzelllinien HeLa, CaSki und SiHa verwendet, um die vorliegende Erfindung zu evaluieren. Tabelle 1 beschreibt jede Zelllinie. Tabelle 1

Zelllinie*	Virenstamm	DNA-Kopien pro Zelle
CaSki	integrierte HPV-16-DNA	400-600 Kopien
HeLa	integrierte HPV-18-DNA	10-50 Kopien
SiHa	integrierte HPV-16-DNA	1-2 Kopien
C33A (Kontrolle)	HPV-negativ	0 Kopien

* Alle Zelllinien wurden von der American Type Cell Culture Collection (ATCC, Manassas; VA) erhalten und in Flaschen unter Bedingungen gezüchtet, die im Allgemeinen von der ATCC vorgeschlagen werden. Bei Bedarf wurden die Zellen von den Flaschen unter Verwendung einer milden Trypsinbehandlung abgelöst.

ii. Oligonucleotidsonden
Die HPV-16-spezifischen Targetsonden bestanden aus einer Gesamtmenge von 26 DNA-Oligonucleotidsonden, die etwa 90 % der E6- und E7-Regionen des HPV-Genoms abdecken. Diese Sonden wurden zuerst durch das Schaffen einer degenerierten Konsensussequenz kreiert, die auf 23 Sequenzen für die E6- und E7-Gene des HPV-16-Genoms basiert, die von GenBank unter Verwendung der Genetics-Data-Environment-Software (Harvard Genome Laborstory, Cambridge, MA) erhalten wurde.
Potentielle Targetsonden-Reihen wurden anschließend unter Verwendung der ProbeDesigner^®-Software (Bayer Diagnostics, Emeryville, CA) erzeugt, wodurch ein flexibles Design von bDNA-Sondenreihen mit minimalem Beitrag zum Hintergrund ermöglicht wird und wodurch ein konstanter Schmelzpunkt von 63 ± 2 °C bestimmt wird. Es wurden Endsonden nach dem Screening der Sondenreihen auf mögliche Wechselwirkungen mit den anderen 39 HPV-Genotypen unter Verwendung eines HybSimulators^® ausgewählt (Advanced Gene Computing Technologies, Inc., Irvine, CA) sowie menschliche genomische DNA-Sequenzen unter Verwendung von Blast2^TM (National Institutes of Health, Bethesda, MD).
HPV-18-spezifische Targetsonden bestanden aus einer Gesamtmenge an 32 DNA-Oligonucleotidsonden, die 90 % der E6- und E7-Regionen des HPV-Genoms abdeckten. Diese Sonden wurden, wie oben stehend beschrieben, unter Verwendung einer degenerierten Konsensussequenz, basierend auf vier Sequenzen für die E6- und E7-Gene des HPV-18-Genoms, und einer konstanten Schmelztemperatur von 63 ± 2 °C kreiert.
Andere DNA-Oligonucleotidsonden, unter anderem die Preamplifier-, Amplifier- und die alkalische-Phosphatase-(AP-)konjugierten Markierungssonden, wurden ausführlich beschrieben. Collins et al., Nucleic Acids Res. 25, 2979-2984 (1997). Um die nicht spezifische Hybridisierung zu reduzieren, wurden die unnatürlichen Nucleotide 5'-Methyl-2'-Desoxyisocytidin (isoC) und 2'-Desoxyisoguanosin (isoG) in die Bindungsstellen der Target-, Preamplifier-, Amplifier- und AP-konjugierten Markierungssonden inkludiert.
B. DNA-Detektion
Für die DNA-Detektion wurden die geernteten Zellen mit 4 % Formaldehyd in einer Phosphatpufferlösung fixiert (PBS; 0,01 M Phosphatpuffer, pH 7,5), und zwar 30 Minuten lang auf Eis, zwei Mal je 2 Minuten lang gewaschen und in PBS resuspendiert. 200-μl-Aliquoten der fixierten Zellsuspensionen wurden in doppeltgefleckte Cy tospintrichter pipettiert (Shandon; Pittsburgh, PA) und 6 Minuten lang bei 1500 U/min in einer Cytospin-Zentrifuge (Shandon) unter Verwendung eines berechneten Kraft-Äquivalents von 300 × g zentrifugiert. Die Zellen wurden auf Objektträgern durch eine abgestufte Reihe an 70 %, 90 % und 100 % Ethanol bei Raumtemperatur (RT) je 2 Minuten lang dehydriert, bei RT 10 Minuten lang luftgetrocknet und bei –80 °C für bis zu 2 Wochen gelagert. Die Zellen wurden auf Objektträgern durch eine abgestufte Reihe an 100 %, 90 % und 70 % Ethanol bei RT je 2 Minuten lang wieder mit Wasser gesättigt und zwei Mal je 2 Minuten lang in PBS gewaschen. Die Objektträger wurden bei 37 °C 1 Stunde lang in 40 μg/ml RNase (Sigma) in 2 × SSC inkubiert (1 × SSC ist 0,15 M NaCl, 0,015 M Na-Citrat), zwei Mal je 2 Minuten lang in PBS gewaschen und in einem vorgewärmten Glas, enthaltend 7,5 bis 10 μg/ml Proteinase K (Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN) in PBS bei 37 °C 10 Minuten lang eingetaucht. Nach zweimaligem, jeweils 2-minütigem Waschen in PBS wurden die Zellen auf Objektträgern durch eine abgestufte Reihe an 70 %, 90 % und 100 % Ethanol bei RT je 2 Minuten lang dehydriert und bei RT 10 Minuten lang luftgetrocknet.
Nach der Vorbehandlung wurden die Zellen mit einer Vorhybridisierungslösung inkubiert, mit einer Reihe an Oligonucleotid-Targetsonden (oben stehend beschrieben) hybridisiert, gefolgt von einer Hybridisierung mit einer Reihe an Oligonucleotidsonden für die Signalamplifikation. Als ein Prähybridisierungsschritt wurde jeder Fleck auf dem Objektträger mit 150 μl Hybridisierungslösung A inkubiert (3 × SSC, 50 % Formamid, 10 % Dextransulfat [MG 500.0000], 0,2 % Casein, 10 μg/ml Poly A, 100 μg/ml denaturierte Lachsspermien-DNA), und zwar bei RT 30 Minuten lang. Die Objektträger wurden in eine Feuchtigkeitskammer (Hybaid Omnislide instrument, Phenix Research Products, Hayward, CA) transferiert, bei 92 °C 5 Minuten lang inkubiert und anschließend aus der Kammer entfernt und bei RT 5 Minuten lang auf der Laborbank abgekühlt. Die Prähybridisierungslösung wurde entfernt, und jeder Fleck auf dem Objektträger wurde mit 100 μl Hybridisierungslösung A inkubiert, enthaltend 0,6 pmol HPV-spezifische Targetsonden, und zwar bei 40 °C 3 Stunden lang in der Feuchtigkeitskammer. Nach der Inkubation mit den Targetsonden wurden die Objektträger bei RT mit einer abnehmenden Reihe an SSC-Puffern, die 0,0025 % BRIJ^®- 35-Detergens (SURFACT-AMPS^® 35, 10 % Pierce, Rockford, IL) enthalten, wie folgt gewaschen: 3-mal 1-2 Minuten lang mit 2 × SSC; 3-mal 1-2 Minuten lang mit 0,2 × SSC; ein Mal 5 Minuten lang mit 0,1 × SSC; und einmal 2 Minuten lang mit 2 × SSC. Jeder Fleck auf dem Objektträger wurde mit 100 μl Hybridisierungslösung B inkubiert (5 × SSC, 0,1 bis 0,3 % Natriumdodecylsulfat [SDS], 10 % Dextransulfat, 1 mM ZnCl₂, 10 mM MgCl₂), enthaltend 90 fmol Preamplifier, und zwar bei 55 °C 25 Minuten lang in der Feuchtigkeitskammer. Die Objektträger wurden zwei Mal in 0,1 × SSC, 1 mM EDTA 1 Minute lang bzw. 4 Minuten lang gewaschen und anschließend in 100 μl Hybridisierungslösung B inkubiert, enthaltend 90 fmol Preamplifier, und zwar bei 55 °C 25 Minuten lang in der Feuchtigkeitskammer. Die Objektträger wurden zwei Mal in 0,1 × SSC, 1 mM EDTA 1 Minute lang bzw. 4 Minuten lang gewaschen und anschließend in 100 μl Hybridisierungslösung B inkubiert, enthaltend 90 fmol AP-konjugierte Markierungssonde, und zwar bei 55 °C 15 Minuten lang in der Feuchtigkeitskammer. Nach dem Waschen in Waschlösung D (100 mM Tris(hydroxymethyl)aminomethan, pH 8,0, 0,1 % BRIJ^® 35, 1 mM ZnCl₂, 10 mM MgCl₂) bei RT 5 Minuten lang wurden 50 μl gepuffertes AP-Substrat (Fast Red, Nr. K597, DAKO Corporation, Carpinteria, CA) hinzugefügt, und die Objektträger wurden bei RT 10 Minuten lang gemäß den Anweisungen des Herstellers inkubiert. Die Objektträger wurden drei Mal je 3 Minuten lang mit Wasser abgespült und anschließend 40 Sekunden lang mit entweder Gills-1-Hämatoxylin (American Histology Reagent Company, Inc., Modesto, CA) oder 0,0001 % Bisbenzimid (Nr. B2883, Sigma) gegengefärbt. Die Objektträger wurden mit ULTRAMOUNT^® (DAKO Corporation), PERMOUNT^® (Fisher Scientific) oder 75 % Glycerin versetzt und bei RT gelagert. Die Objektträger wurden unter Verwendung eines Nikon-E800-Fluoreszenzmikroskops mit einem FITC- oder einem Dreifach-Bandfilter (Nikon, Foster City, CA) oder mit einem 60×-Hellfeld-Objektiv angeschaut, und die Bilder wurden unter Verwendung einer gekühlten Optronics-3-Chip-Farb-CCD-Kamera (Optronics Engineering, Goleta, CA) aufgezeichnet. Die fluoreszierenden oder chromogenen Bilder wurden unter Verwendung der Image-Probe-Software (Media Cybernetics, Silver Springs, MA) aufgezeichnet. 1 ist ein Schema des Testformats für Beispiel 1.
C. Ergebnisse
Die Ergebnisse dieser Studie zeigen, dass nach der Hybridisierung mit HPV-16-Targetsonden eine positive Signaldetektion in CaSki-Zellen (2A) und in SiHa-Zellen (2B) beobachtet wurde. Wie erwartet, wurde eine Vielzahl an Signalen in den CaSki-Zellen detektiert, da sie etwa 400-600 Kopien von HPV-16 enthalten. Nur ein oder zwei Signale wurden in den SiHa-Zellen detektiert, auch wie erwartet, da sie nur 1-2 DNA-Kopien von HPV-16 enthalten. Schließlich wurde kein Signal bei den HPV-16-Sonden in jenen Zellen detektiert, denen HPV-16 fehlt, d.h. HeLa-(2C) und C33a-Zellen (2D). Diese Ergebnisse zeigen sowohl die quantitative Fähigkeit als auch die Spezifität des vorliegenden Verfahrens.
Nach der Hybridisierung mit HPV-18-Targetsonden wurde eine positive Signaldetektion in HeLa-Zellen (2G) beobachtet, die 10-50 DNA-Kopien von HPV-18 enthalten. Es wurde jedoch kein Signal bei HPV-18-Sonden in Zellen detektiert, denen HPV-18 fehlte, unter anderem CaSki-(2E), SiHa-(2F) und C33a-Zellen (2H). Es wurde kein Signal bei weder HPV-16- noch HPV-18-Targetsonden in der HPV-negativen HT3-Zelllinie oder der ME180-Zelllinie detektiert, die eine DNA-Sequenz in sich tragen, die der von HPV-39 (nicht dargestellt) ähnelt.
Es wurden eine Reihe an zusätzlichen Kontrollen durchgeführt, um aufzuzeigen, dass die in diesen Experimenten beobachteten positiven Signale spezifisch für HPV-DNA-Targets waren. Es wurde kein positives Signal beobachtet, als nicht spezifische Targetsonden verwendet wurden oder als HPV-16- oder HPV-18-Targetsonden, Amplifier oder AP-konjugierte Markierungssonden aus dem bDNA-ISH-Verfahren ausgelassen wurden. Die Auslassung des Proteinase-K-Verdaus oder der DNA-Denaturierungsschritte oder der Behandlung der Zellen mit DNase führte ebenfalls zu einem Verlust des Signals. Als eine weitere Kontrolle für die DNase-Verdauexperimente wurde der RNase-Behandlungsschritt ausgelassen, um zu bestätigen, dass dieser Verlust des Signals nicht auf den DNase-Abbau der Oligonucleotidsonden zurückzuführen war. Unter diesen Bedingungen wurde erneut ein positives Sig nal detektiert, was darauf hindeutete, dass die DNA-Oligonucleotidsonden nicht abgebaut wurden und daher in der Lage waren, an HPV-RNA-Targets zu binden.
BEISPIEL 2
BEWERTUNG DER SPEZIFITÄT IN ZELLEN
Es wurden gemischte Zellpopulationen verwendet, um die Spezifität des vorliegenden Verfahrens für die HPV-DNA-Detektion weiter zu untersuchen. Gemischte Zellproben bestanden aus unmarkierten CaSki-Zellen (enthaltend 400-600 DNA-Kopien von HPV-16) und markierten HeLa-Zellen (enthaltend 10-50 DNA-Kopien von HPV-18). Die HeLa-Zellen waren mit dem fluoreszierenden Zell-Tracer CFDA SE (Carboxyfluoresceindiacetatsuccinimidylester, Molecular Probes, Eugene, OR) gemäß den Anweisungen des Herstellers markiert. Beide Zelltypen wurden gemäß dem Verfahren aus Beispiel 1 getestet.
Wie in 3A und 3C gezeigt, ergab die Hybridisierung mit HPV-16-Targetsonden eine positive Signaldetektion nur bei HPV-16-infizierten CaSki-Zellen (Pfeil) und nicht bei HeLa-Zellen (Pfeil). Ähnlich, wie in den 3B und 3D dargestellt, ergab die Hybridisierung mit HPV-18-Targetsonden eine positive Signaldetektion nur in HPV-18-infizierten HeLa-Zellen (Pfeilspitze) und nicht bei CaSki-Zellen (Pfeilspitze). Wie erwartet, wurde eine stärkere Signalintensität (d.h. größere Anzahl und Größe der Flecken) für die HPV-16-DNA-Detektion in CaSki-Zellen beobachtet im Vergleich zur HPV-18-DNA-Detektion in HeLa-Zellen. Dieser Unterschied in der Signalintensität spiegelt die höhere Anzahl an HPV-DNA-Kopien wieder, die in CaSki-Zellen vorhanden sind (400-600 HPV-16-DNA-Kopien/Zelle), im Vergleich zu HeLa-Zellen (10-50 HPV-18-DNA-Kopien/Zelle).
Diese Ergebnisse zeigen, dass das vorliegende Verfahren in einer gemischten Population an Zellen zwischen Zellen, die mit HPV-16 infiziert sind, und Zellen, die mit HPV-18-DNA infiziert sind, unterscheiden kann. Weiters gibt es keinen Transfer des Signals von einer Zellart zu einer anderen, da positive Signale nur innerhalb der geeigneten Zelltypen erhalten werden. Weiters kann sogar eine geringe Menge an Tar gets leicht mit dem vorliegenden Verfahren ohne die Probleme des Hintergrunds oder der Kreuzreaktivität detektiert werden, die durch die Gegenwart eines anderen HPV-Genotyps eingeführt werden könnten.
BEISPIEL 3
DETEKTION VON HPV-RNA UND LOKALISIERUNG VON RNA/DNA INNERHALB EINER ZELLE
Für die RNA-Detektion wurden Zellen, die auf Kammer-Objektträgern gezüchtet wurden (Nr. 12-565-18, Fisher Scientific, Pittsburgh, PA), mit 4 % Formaldehyd in PBS 30 Minuten lang bei RT fixiert, mit 10 μg/ml Proteinase K in PBS 10 Minuten lang bei RT behandelt und anschließend zwei Mal 5 Minuten lang in PBS gewaschen. Die Proben wurden bei 40 °C 3 Stunden lang mit 1 pmol HPV-spezifischen Targetsonden in einem Targetsonden-Puffer (6 × SSC, 25 % Formamid, 0,2 % BRIJ^® 35, 0,2 % Casein) inkubiert und anschließend nach derselben absteigenden Serie an SSC-Puffer, wie sie in Beispiel 1 beschrieben wurde, gewaschen. Auf ähnliche Art und Weise waren die Preamplifier-, die Amplifier- und die AP-konjugierte Sondenhybridisierung und die Waschbedingungen dieselben, wie sie in Beispiel 1 beschrieben wurden.
Für die subzelluläre Lokalisierung von DNA-Targets wurden HeLa-Zellen über Nacht auf Poly-D-Lysin-überzogenen Kammerobjektträgern gezüchtet. Poly-D-Lysin ist bei Sigma erhältlich (Produktcode P7280). Am nächsten Tag wurde das Zellkulturmedium entfernt; die Zellen wurden mit PBS gewaschen und anschließend mit 4 % Formaldehyd in PBS 30 Minuten lang bei RT fixiert und auf DNA-Targets durch Hybridisierung mit HPV-18-Targetsonden oder, als negative Kontrolle, HPV-16-Targetsonden untersucht.
AP-Substrat (Fast Red, DAKO Corporation) wurde hinzugefügt, und die Objektträger wurden bei RT 4 Minuten lang inkubiert. Nach dem Beenden der Reaktion durch das Waschen in PBS wurden die Proben in 4 % Formaldehyd in PBS 5 Minuten lang bei RT nachfixiert und anschließend 40 Sekunden lang mit entweder Hämatoxylin oder Bisbenzimid gegengefärbt. Die Objektträger wurden untersucht, und die Bilder wurden erzeugt und gedruckt, wie in Beispiel 1 beschrieben.
Die Hybridisierung von HeLa-Zellen (hergestellt zur RNA-Detektion) mit HPV-18-Targetsonden führte zu der Detektion von HPV-18-mRNA, hauptsächlich im Cytoplasma (Pfeilspitze, 4A). Es wurde jedoch kein Signal in denselben Zellen beobachtet, die mit HPV-16-Targetsonden inkubiert wurden (4B).
Im Gegensatz dazu führte die Hybridisierung von HeLa-Zellen (hergestellt zur RNA-Detektion) mit HPV-18-Targetsonden zu der Detektion von HPV-18-DNA in HeLa-Zellnuclei (Pfeil, 4C). Es wurde jedoch kein Signal in denselben Zellen beobachtet, die mit HPV-16-Targetsonden inkubiert wurden (4D).
Diese Ergebnisse zeigen, dass HPV-mRNA und HPV-DNA an verschiedene Komponenten in Zellen lokalisiert sind. Insbesondere virale mRNA wird hauptsächlich an das Zytoplasma lokalisiert, wohingegen virale DNA auf den Nucleus beschränkt ist. Diese Ergebnisse zeigen auch, dass die positiven Signale in dem Kompartiment der Zelle beibehalten werden, in der die Target-Nucleinsäure lokalisiert ist. Mit anderen Worten werden das Target und das Signal co-lokalisiert.
Das vorliegende Verfahren stellt eine genaue subzelluläre Lokalisierung bereit, die positive Signale ergibt, die in den subzellulären Kompartimenten beibehalten werden, in denen die Target-Nucleinsäuresequenzen lokalisiert werden.
BEISPIEL 4
DETEKTION VON HPV-16 DURCH BDNA-ISH IN CIN-II-PROBEN
Eine Arbeitsvorschrift, die jener aus Beispiel 1 ähnelt, wurde wie folgt für die In-situ-Hybridisierung an Gewebe verwendet. Kurz gesagt, wurden formalinfixierte Paraffin-Schnitte von Zervixgewebe entwachst und unter Verwendung von Standard-Histologieverfahren mit Xylolen und einer abgestuften Alkoholreihe erneut hydratisiert. Für die DNA-Detektion wurde das Gewebe bei 100 μg/ml Rnase in einem Rnase-Puffer (0,5 NaCl, 10 mM Tris, pH 9,0, 1 mM EDTA) bei 37 °C 1 Stunde lang Rnase-verdaut, gefolgt von einem Proteinase-K-Verdau (12 μg/ml in Proteinase-K-Puffer oder PBS) bei 37 °C 10 Minuten lang. Proteinase K wurde durch 10-minütiges Nachfixierung in 4 % Paraformaldehyd in PBS bei 4 °C deaktiviert. Nach mehreren Waschschritten in PBS wurde das Gewebe acetyliert in 1 M TEA, wie von Angerer et al., In situ Hybridization with RNA Probes-An Annotated Recipe, In: K. L. Valentine et al. (Hrsg.), In situ Hybridization-Applications to Neurobiology, 71-96, Oxford, Oxford University Press (1987), beschrieben. Schnitte wurden in einer Ethanolreihe dehydriert, bevor sie 5 Minuten lang bei 92 °C in DB (80 % Formamid, 2 × SSC) auf Hybaid (Phenix) denaturiert wurden, gefolgt von einer Immersion in kalten 70 % Ethanol und einer Dehydrierung. Nach einer 30-minütigen Inkubation in einem Prähybridisierungspuffer wurden Target-Oligonucleotidsonden in frischem Prähybridisierungspuffer in einer Konzentration von 10 fmol/μl hinzugefügt und mit einem Deckglas bedeckt.
Die Hybridisierung wurde in einer befeuchteten Kammer auf einem Fisher-Objektträger-Wärmer bei 37 °C 1-3 Stunde(n) lang durchgeführt, mit Waschschritten und Signalamplifiaktion, die dieselben waren, wie sie zuvor in Beispiel 1 beschrieben wurden. Nach der Hybridisierung wurden Schnitte in einer abgestuften SSC-Reihe bis 0,1 × SSC für eine Gesamtzeitspanne von 15 Minuten Waschzeit gewaschen. Die Hybridisierung in 1 fmol/μl Preamplifier in Hybridisierungslösung B 25 Minuten lang bei 55 °C wurde von 3 Waschschritten in 0,1 × SSC mit 5 Minuten Gesamtwaschzeit gefolgt. Die Hybridisierung in 1 fmol/μl Amplifier in Hybridisierungslösung B 25 Minuten lang bei 55 °C wurde von mehreren 0,1-×-SSC-Waschschritten gefolgt. Die Hybridisierung in 1 fmol/μl Markierungssonde in Hybridisierungslösung B 15 Minuten lang bei 55 °C wurde von 0,1-×-SSC-Waschschritten und einer Inkubation in Waschlösung D gefolgt. Fast Red wurde unmittelbar vor der Aufbringung auf die Schnitte hergestellt, und die Farbentwicklung wurde zwischen 4 und 10 Minuten gestoppt. Die Nuclei wurden in Hämatoxylin gefärbt, und die Objektträger wurden für die Mikroskopie mit einem Deckglas bedeckt. Die endogene alkalische Phosphatase wurde mit Levamisol, 1 μM bis 5 μM, deaktiviert.
Die In-situ-Hybridisierung detektierte HPV-16 in CIN-II-Uterus-Zervixgewebe (CIN = intraepitheliale Zervix-Neoplasie) mit HPV-assoziierten zytopathischen Veränderungen (Proben Nr. 00B01-627, Clinomics BioSciences, Inc., Pittsfield, MA). Die Zellnuclei in jedem der Abschnitte wurden mit Hämatoxylin gefärbt. 5A stellt die Verteilung der HPV-16-Genexpression (gefärbte Bereiche) innerhalb von Schuppenepithelen des Ektozervix dar. Eine stärkere Vergrößerung der einrahmten Region in 5A zeigt die Gegenwart von HPV-16-mRNA im Zytosol einiger Schuppenepitheizellen (5B). 5C zeigt, dass HPV-16-DNA in den Nuclei von Schuppenzellen in einem Gewebeabschnitt neben der eingerahmten Region in 5A detektiert wurde. HPV-18-DNA hingegen wurde nicht in einem angrenzenden Abschnitt detektiert (5D). Wie erwartet, wurde GAPDH-mRNA im gesamten Schuppenepithel in der Nähe der Transformationszone detektiert (Fig. E). Die 5A und 5E sind etwa 200× vergrößert, während die 5B, 5C und 5D 600× vergrößert sind.
BEISPIEL 5
BDNA-ISH VON HPV-DNA MIT BEIBEHALTUNG DER HISTOPATHOLOGIE
Die In-situ-Hybridisierung unter Verwendung des Verfahrens, das jenem aus Beispiel 4 ähnelt, wurde durchgeführt, um HPV-16-DNA in Regionen mit zytopathischen Veränderungen zu detektieren, die für CIN-II-Läsionen in uterinem Zervixgewebe mit HPV-assoziierten zytopathischen Veränderungen charakteristisch sind (Proben Nr. 00B01-624, Clinomics BioSciences, Inc., Pittsfield, MA), und zwar wie folgt. Die Zellnuclei in den Abschnitten wurden mit Hämatoxylin angefärbt. Große Pfeilspitzen deuten auf zusammenhängende Basaizellen entlang der Basalmembran hin, die das Schuppenepithel vom darunter befindlichen Stroms trennt. In einer Region von scheinbar normaler Schuppenreifung wurde HPV-16-DNA nicht detektiert, die Basalzellen waren in der Nähe der Basalmembran eingeschränkt, und der apikale Teil der Epithele umfasste hauptsächlich differenzierte Schuppenzellen mit einem charakteristisch großen Zytosol (6A). Eine nahegelegene Region desselben Gewebeabschnitts zeigte eine abnormale Schuppenreifung, die für eine moderate Dysplasie des Zervix (CIN II) charakteristisch ist (6B). Diese dysplastische Region zeigte ein übermäßiges Wachstum der Basalzellen, ein Vermischen der Basaizellen und der differenzierten Schuppenzellen in der apikalen Epithelregion und die Gegenwart von HPV-16-DNA (gefärbter Bereich) (6B). Eine stärkere Vergrößerung zeigte die Gegenwart von HPV-16-DNA in Basalzellen, wie von den kleineren Pfeilen gezeigt wird (6C). Die 6A und 6B sind 400× vergrößert, und 6C ist 600× vergrößert.
BEISPIEL 6
UNTERSUCHUNG DER SPEZIFITÄT IN GEWEBEN
Die In-situ-Hybridisierung unter Verwendung genotypspezifischer HPV-Sonden und das Verfahren aus Beispiel 4 wurden verwendet, um HPV-DNA in CIN-II-Gewebeschnitten und in normalen Zervixschnitten zu detektieren. Die Zellnuclei in den Schnitten wurden mit Hämatoxylin gegengefärbt. Die gefärbten Bereiche deuteten auf die Gegenwart der Target-Nucleinsäure hin, entweder virale DNA (7A, 7B, 7C, 7D, 7E und 7F) oder endogene mRNA (7G). HPV-16-DNA wurde in ektozervikalen Schuppenepithelen von CIN-II-Gewebe Nr. 00B01-624 (7A) detektiert, HPV-18 wurde jedoch nicht detektiert (7B). HPV-18-DNA wurde in CIN-II-Gewebe mit HPV-assoziierten zytopathischen Veränderungen (Probe Nr. 00B01-625, Clinomics BioSciences, Inc., Pittsfield, MA) detektiert, wie in 7D dargestellt, HPV-16 wurde jedoch nicht detektiert (7C). Wie erwartet, wurde HPV-DNA nicht in normalem Zervixgewebe detektiert (Probe Nr. H-1188-88, Clinomics BioSciences, Inc., Pittsfield, MA), wenn mit HPV-18-(7E) oder HPV-16-Sonden (7F) getestet wurde. Wie erwartet, wurde endogene GAPDH-mRNA in normalem Zervixgewebe detektiert (7G).

Claims

Verfahren zur In-situ-Detektion eines Nucleinsäureanalyten in einer Probe biologischen Materials, umfassend das Durchführen einer bDNA-Hybridisierung, die folgende Schritte umfasst: (a) die Vobereitung einer Probe biologischen Materials durch: (i) Immobilisieren des biologischen Materials auf einem Substrat; (ii) Permeabilisieren des substratgebundenen biologischen Materials durch Kontaktieren des substratgebundenen Materials mit einer Lösung, die Proteinase K in einer Konzentration von 0,5 μg/ml bis 50 μg/ml enthält; (iii) Behandeln der Probe mit RNase, um jegliche RNA aus der Probe zu entfernen; und (iv) Erhitzen des permeabilisierten Materials auf eine Temperatur und über einen Zeitraum, die wirksam sind, um jegliche doppelsträngige DNA zu denaturieren; (b) das Kontaktieren des biologischen Materials mit einer Target-Oligonucleotidsonde unter Hybridisierungsbedingungen, worin zumindest ein Abschnitt der Targetsonde zu zumindest einem Abschnitt des Nucleinsäureanalyten komplementär ist, sodass ein Analyt-Targetsonde-Komplex gebildet wird, wenn der Nucleinsäureanalyt in der Probe vorhanden ist; (c) das Waschen des biologischen Materials mit einer ein Detergens umfassenden Waschflüssigkeit bei einer Temperatur im Bereich von 21 bis 60 °C; und (d) das Detektieren jeglicher Analyt-Targetsonde-Komplexe auf dem Substrat durch (i) Kontaktieren des gewaschenen Substrats und des Analyt-Targetsonde-Komplexes mit einer Preamplifier-Oligonucleotidsonde unter Hybridisierungsbedingungen, worin ein erster Abschnitt der Preamplifiersonde zu einem anderen Abschnitt der Targetsonde komplementär ist als dem Abschnitt der Targetsonde, der zum Nucleinsäureanalyten komplementär ist, wodurch ein Analyt-Targetsonde-Preamplifiersonde-Komplex gebildet wird, wenn der Nucleinsäureanalyt in der Probe vorhanden ist; (ii) Kontaktieren des Produkts aus Schritt (d)(i) mit einer Amplifier-Oligonucleotidsonde unter Hybridisierungsbedingungen, worin ein erster Abschnitt der Amplifiersonde zu einem zweiten Abschnitt der Amplifiersonde komplementär ist, wodurch ein Analyt-Targetsonde-Amplifiersonde-Komplex gebildet wird, wenn der Nucleinsäureanalyt in der Probe vorhanden ist; (iii) Kontaktieren des Produkts aus Schritt (d)(ii) mit einer Markierungssonde, die eine an alkalische Phosphatase konjugierte Oligonucleotidsonde umfasst, unter Hybridisierungsbedingungen, worin ein Abschnitt der Markierungssonde an einen zweiten Abschnitt der Amplifiersonde bindet, wodurch ein Analyt-Targetsonde-Preamplifiersonde-Amplifiersonde-Markierungssonde-Komplex gebildet wird, wenn der Nucleinsäureanalyt in der Probe vorhanden ist; (iv) Markieren des Analyt-Targetsonde-Preamplifiersonde-Amplifiersonde-Markierungssonde-Komplex mit einer detektierbaren Markierung; und (v) Detektieren der Gegenwart der Markierung auf dem Substrat, worin der Nucleinsäureanalyt DNA, ein endogenes Gen oder ein Segment davon ist.
Verfahren nach Anspruch 1, worin der Nucleinsäureanalyt aus der aus HIV-DNA, CMV-DNA, HPV-DNA, LAP und IL-2 bestehenden Gruppe ausgewählt ist.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, worin das Substrat Glas oder einen elastischen Kunststoff umfasst.
Verfahren nach einem der vorangegangenen Ansprüche, worin die Konzentration von Proteinase K 5 μg/ml bis 20 μg/ml beträgt.
Verfahren nach einem der vorangegangenen Ansprüche, worin 0,1 prol bis 10 pmol der Targetsonde eingesetzt werden.
Verfahren nach einem der vorangegangenen Ansprüche, worin das Detergens in der Waschflüssigkeit ein hydrophiles Tensid ist.
Verfahren nach Anspruch 6, worin das hydrophile Tensid nichtionisch ist.
Verfahren nach einem der vorangegangenen Ansprüche, worin die Waschflüssigkeit eine Pufferlösung ist.
Verfahren nach Anspruch 8, worin die Pufferlösung Salze von Alkalimetallen umfasst.
Verfahren nach einem der vorangegangenen Ansprüche, worin Schritt (c) zumindest einmal wiederholt wird.
Verfahren nach Anspruch 10, worin Schritt (c) zumindest zweimal wiederholt wird.
Verfahren nach einem der vorangegangenen Ansprüche, worin Schritt (c) bei 21 °C bis 60 °C durchgeführt wird.
Verfahren nach einem der vorangegangenen Ansprüche, worin etwa 1 fmol bis 10 pmol der Preamplifier-Oligonucleotidsonde und etwa 1 fmol bis 10 pmol der Amplifier-Oligonucleotidsonde eingesetzt werden.
Verfahren nach einem der vorangegangenen Ansprüche, worin die biologische Probe eine Zelle umfasst.
Verfahren nach Anspruch 14, worin die Zelle aus der aus Plasma, Serum, Rückenmarksflüssigkeit, Lymphflüssigkeit, äußeren Abschnitten der Haut, Sekretionen des Respirationstrakts, Sekretionen des Verdauungstrakts, Sekretionen des Urogenitaltrakts, Tränen, Speichel, Milch, Blutzellen, Tumoren, Organen und In-vitro-Zellkulturbestandteilen bestehenden Gruppe isoliert ist.
Verfahren nach Anspruch 14, worin die Zelle aus der aus Nebennieren-, Blasen-, Knochenmarks-, Gehirn-, Brust-, Herz-, Kolon-, Ösophagus-, Darm-, Nieren-, Leber-, Lungen-, Lymphknoten-, Nerven-, Ovarial-, Pankreas-, Prostata-, Skelett muskel-, glatte Muskel-, Milz-, Magen-, Testis-, Tonsilla-, Tracheal- und Uteruszellen bestehenden Gruppe ausgewählt ist.
Verfahren nach Anspruch 14, worin die Probe biologischen Materials mithilfe einer Zentrifuge auf einem Substrat immobilisiert wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, worin die biologische Probe ein Gewebe umfasst.
Verfahren nach Anspruch 18, worin das Gewebe aus der aus Nebennieren-, Blasen-, Knochenmarks-, Gehirn-, Brust-, Herz-, Kolon-, Ösophagus-, Darm-, Nieren-, Leber-, Lungen-, Lymphknoten-, Nerven-, Ovarial-, Pankreas-, Prostata-, Skelettmuskel-, Glattmuskel-, Milz-, Magen-, Testis-, Tonsilla-, Tracheal- und Uterusgewebe bestehenden Gruppe ausgewählt ist.
Verfahren nach Anspruch 18 oder 19, worin die Probe biologischen Materials mithilfe von Schnitten des Gewebes auf einem Substrat immobilisiert wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, worin die Identifizierung der Position des Analyt-Targetsonde-Komplexes in einer Zelle der biologischen Probe die Position des Nucleinsäureanalyten in der Zelle anzeigt.