CN111378723B - 一种在组织上检测PD-L1 mRNA的试剂盒及方法 - Google Patents
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Abstract
本申请属于生物技术领域，公开了一种在组织上检测PD‑L1 mRNA的试剂盒及方法。本发明所述试剂盒包括SEQ ID NO.1‑91所示的探针组，组成简单，弥补了免疫组化有效抗体不足的现状，解决了FISH技术的缺陷，极大的拓宽了分子病理的检测领域。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种在组织上检测PD-L1 mRNA的试剂盒及方法。
背景技术
细胞程序性死亡-配体1(Programmed cell death 1 ligand 1，PD-L1)也称为表面抗原分化簇274(cluster of differentiation 274，CD274)或B7同源体(B7homolog 1，B7-H1)，是人类体内的一种蛋白质，由CD274基因编码。.PD-L1是大小为40kDa的第一型跨膜蛋白，据信其在某些特殊情形(例如怀孕、组织移植、自体免疫疾病，以及诸如肝炎等某些疾病)下，免疫系统的抑制有关。正常情形下免疫系统会对聚集在淋巴结或脾脏的外来抗原产生反应，促发具抗原特异性的细胞毒杀性T细胞(CD8+Tcell增生)。而细胞程序性死亡受体-1(PD-1)与细胞程序性死亡-配体1(PD-L1)结合，可以传导抑制性的信号，减低淋巴结CD8+T细胞的增生，而且PD-1还可以借由调节Bcl-2基因，控制淋巴结中抗原特异性T细胞的聚积。因此在检测组织上PDL1具有重要意义。
免疫组织化学(Immunohistochemistry)又称免疫细胞化学。它是组织化学的分支，它是用标记的特异性抗体(或抗原)对组织内抗原(或抗体)的分布进行组织和细胞原位检测技术。凡是组织细胞内具有抗原性的物质，如肽类、激素、神经递质、细胞因子、受体、表面抗原等等均可用免疫组织化学方法显示，因而目前在基础与临床科研中被广泛应用。最近几年，分子生物学研究异常活跃，但最终还要归到形态上来。用免疫组织化学方法对所研究的大分子分子进行定位，进而深入研究其功能。但是，往往由于技术原因导致很多项目的检测抗体不容易被制备出来，导致项目迟迟不能开展起来，有很多项目理论上可行，但是实际上受限于特异性抗体的制备。例如，安捷伦公司的PD-L1 IHC 22C3抗体，目前全球仅有一家，而且价格十分昂贵。
荧光原位杂交(Fluorescence in situ hybridization，FISH)是20世纪80年代末在放射性原位杂交技术基础上发展起来的一种非放射性分子生物学和细胞遗传学结合的新技术。FISH是以荧光标记取代同位素标记而形成的一种新的原位杂交方法。荧光原位杂交技术的原理是将荧光素直接或间接标记的核酸探针，或生物素、地高辛、dinit rophenyl(I)NP、aminoacetylAAFfluorine(AAF)等标记的核酸探针与待测样本中的核酸序列按照碱基互补配对的原则进行杂交，经洗涤后直接在荧光显微镜下观察。荧光原位杂交技术是一种重要的非放射性原位杂交技术，原理是利用报告分子(如生物素、地高辛等)标记核酸探针，然后将探针与染色体或DNA纤维切片上的靶DNA杂交，若两者同源互补，即可形成靶DNA与核酸探针的杂交体。此时可利用该报告分子与荧光素标记的特异亲和素之间的免疫化学反应，经荧光检测体系在镜下对待DNA进行定性、定量或相对定位分析。但目前FISH检测准确性不高，存在假阳性及假阴性的问题。
造成FISH检测假阳性原因包括(a)探针设计不合理；(2)微生物自身荧光的干扰；(c)环境样品(如活性污泥或饮用水等)中天然的可发荧光的生物或化学残留物的干扰；(d)培养基、固定方法和封固剂等对荧光信号强度的影响。造成FISH检测的假阴性的原因包括：(a)细胞壁的结构影响探针的渗透力，导致杂交信号强度降低，革兰氏阳性菌必须进行特殊的固定和前处理，以提高探针的渗透力；(b)细菌细胞中rRNA含量过低。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于针对现有技术的缺陷，提供一种在组织上检测PD-L1mRNA的试剂盒及方法。
为了实现本发明的目的，本发明采用如下技术方案：
一种在组织上检测PD-L1 mRNA的试剂盒，包括SEQ ID NO.1-91所示的探针组。
在一些实施方案中，本发明所述在组织上检测PD-L1 mRNA的试剂盒还包括标记探针。
进一步的，在一些具体实施例中，所述标记探针如SEQ ID NO.92所示，3’末端带碱性磷酸酶。
在一些实施方案中，本发明所述在组织上检测PD-L1 mRNA的试剂盒中还包括预处理液、蛋白酶反应液、探针稀释液、预放大混合液、放大混合液、探标稀释液、清洗缓冲液(50×)、底物增强液、底物、底物稀释液中至少一种。
在一些实施方案中，所述蛋白酶反应液为0.5％(g/ml)胃蛋白酶反应液。
在一些实施方案中，预处理液为0.5％(g/ml)柠檬酸水溶液。
在一些实施方案中，探针稀释液配方为甲酰胺2wt％、柠檬酸钠5wt％、NaCl1.5wt％、SDS 3wt％，余量为水。
在一些实施方案中，预放大混合液放大分子0.1wt％、甲酰胺10wt％、SDS 2wt％、柠檬酸钠5.6wt％，余量为水。
在一些实施方案中，放大混合液放大分子0.1wt％、甲酰胺10wt％、SDS 2wt％、柠檬酸钠5.6wt％，余量为水。
在一些实施方案中，探标稀释液探标稀释液配方为SDS 2.5wt％、柠檬酸钠5wt％，余量为水。
在一些实施方案中，50×清洗缓冲液配方为SDS 2wt％、柠檬酸钠5wt％，余量为水。
本发明还公开了一种基于SightRNA技术，在常见的肿瘤组织上进行RNA原位杂交检测技术，包括组织处理消化，探针杂交，信号放大，显色报告；其中所述探针为SEQ IDNO.1-91所示的探针组。
本发明所述试剂盒组成简单，弥补了免疫组化有效抗体不足的现状，解决了FISH技术的缺陷，极大的拓宽了分子病理的检测领域。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1示实施例2操作流程图
图2示对7例(A-G)肺腺癌组织进行检测的染色结果图；其中编号为A、B的组织表达为2+，C为3+，D-G组织无表达。
具体实施方式
本发明公开了一种在组织上检测PD-L1 mRNA的试剂盒及方法。本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及产品已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
SightRNA是一种新型RNA原位杂交技术，融合了传统RNA原位杂交技术与FISH技术的优点，可以在单细胞中对多个目标基因低拷贝乃至单拷RNA做出检测。SightRNA整个实验流程与FISH相似，但时间大大缩短。通过QuantiMAT信号放大树对捕获靶标进行400倍的放大。探针配对设计--探针设计遵循两两配对、协同捕获的原则，所有原位杂交的cDNA探针都不是孤立存在，需要同配对的探针两两配合，与支链DNA放大树结构结合。双“Z”型探针结构选择性与靶标探针结合，大大降低了非特异性反应，使特异性、信噪比极大提高。
为了进一步理解本发明，下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
如无特殊说明，本发明实施例中所涉及的试剂均为市售产品，均可以通过商业渠道购买获得。如底物增强液、底物、底物稀释液购自Invitrogen公司。本发明所述的百分数如无特殊说明均为质量百分数。
实施例1、探针设计
通过对PD-L1mRNA序列进行比对，设计并合成多条PD-L1特异的探针，具体如表1所示。探针设计遵循两两配对、协同捕获的原则，所有原位杂交的cDNA探针都不是孤立存在，需要同配对的探针两两配合，与支链DNA放大树结构结合。
表1 PD-L1特异的探针
实施例2、检测方法
一、组织的预处理与靶标的杂交
1、组织切片60℃烤片1h。
2、在烤片的间隙，配制如下液体：
(1)准备2L 1×PBS：1.8L ddH2O+0.2L 10×PBS；
(2)准备200ml 10％NBF：通风厨内178ml 1×PBS+22ml 37％甲醛；
(3)配制3L 1×清洗缓冲液：2.94L ddH2O+60ml 50×清洗缓冲液，此清洗缓冲液可在室温下保
存1个月；
(4)配制500ml 1×预处理液：495ml ddH2O+5ml 100×预处理液；
(5)准备好以下试剂：
400ml二甲苯，400ml 100％乙醇
(6)预热1×PBS和探针稀释液到40℃。预热底物增强液和底物稀释液到室温。
3、脱蜡30min：
在通风橱中进行以下操作：
(1)将各200ml二甲苯分别倒入两洗液缸中。
(2)将带有玻片的玻片架放入一盛有200ml二甲苯的洗液缸，上下来回洗涤5min。
(3)立刻移入另一盛有200ml新的二甲苯的洗液缸，再上下来回洗涤5min。
(4)马上用200ml 100％乙醇进行1min洗涤，重复两次。
(5)移出切片，正面朝上放在纸巾上室温干燥5min。
4、画疏水圈40min：
(1)将疏水笔笔尖在吸水纸上轻触几下，让疏水液流畅地缓慢渗出。
(2)在样本切片周围画一圈蓝色的疏水圈，风干20-30min左右至完全干透。
(3)等待期间，用铝箔盖紧盛有500ml 1×预处理液的烧杯。把它放在热板上加热至温度为95℃。
5、组织预处理10-25min：
(1)使用防水温度计测量预处理液，保持预处理期间温度在90-95℃。
(2)使用镊子把玻片架放入加热的1×预处理液，用铝箔封住烧杯口，90-95℃孵育的最优时间参考：标本预处理最优程序，见表2：
表2 标本预处理最优程序
(3)预处理后，将玻片架浸入含有200ml ddH2O的洗液缸中清洗1min并上下经常搅动。重复洗涤一次，转移玻片架到含1×PBS的染色皿。
6、蛋白酶消化和固定30-50min:
(1)将杂交仪设置为实际杂交温度40±1℃，并确认已插入两条保湿条；
(2)将100×消化酶用预热40℃的1×PBS稀释至所需体积(每片约需100-300μl，视切片面积而定)。
(3)甩去玻片上多余的1×PBS，不用完全干燥，轻拍玻片边缘，擦拭背面。将玻片放在孵育器面板上，立即加入配好的消化液，盖上盖子，并开始计时。孵育时间参照：标本预处理最优程序，见上述表2。
(4)消化结束后，将玻片放入玻片架，在200ml 1×PBS中上下洗涤1min。重复步骤一次。
(5)在通风橱中用4％甲醛固定5min。再用200ml 1×PBS上下洗涤1min，共洗两次。
7、目标探针杂交2h 10min：
将玻片取出，甩掉正面残存的缓冲液，背面用吸水纸擦干。在疏水圈范围内加入约250μl预热的含有实施例1所述的SEQ ID NO.1-91的91种探针的PD-L1探针杂交液(各探针含量均为100mM)覆盖整片组织。立即将玻片放在孵育器面板上，盖上盖子，在40℃杂交2h。
8、冲洗玻片8min：
室温下，洗片缸中上下快速洗涤玻片3次，每次用200ml 1×清洗缓冲液冲洗2min。
二、信号放大和检测
1、准备其他溶液和试剂5min：
(1)准备1L 0.01％的氨水和200ml苏木精染液。
(2)预热预放大混合液、放大混合液和探标稀释液到40℃，将底物增强液、底物稀释液取出放置在室温等候使用。
2、冲洗玻片8min：
室温下，洗片缸中上下快速洗涤玻片3次，每次用200ml 1×清洗缓冲液冲洗2min。
3、预放大杂交35min：
(1)将玻片取出，甩掉正面残存的清洗缓冲液，背面用吸水纸擦干。在疏水圈范围内加入约200μl预热的预放大混合液覆盖整片组织。
(2)立即将玻片放在孵育器面板上，盖上盖子，在40℃杂交25min。
4、冲洗玻片8min：
室温下，洗片缸中上下快速洗涤玻片3次，每次用200ml 1×清洗缓冲液冲洗2min。
5、放大杂交20min：
(1)将玻片取出，甩掉正面残存的清洗缓冲液，背面用吸水纸擦干。在疏水圈范围内加入约200μl预热的放大混合液覆盖整片组织。
(2)立即将玻片放在孵育器面板上，盖上盖子，在40℃杂交15min。
6、冲洗玻片8min：
室温下，洗片缸中上下快速洗涤玻片3次，每次用200ml 1×清洗缓冲液冲洗2min。
7、标记探针(Label Probe-AP)杂交20min，所述标记探针序列为acgtgtatacgtatatgc-AP(SEQ ID NO.92，3’末端带碱性磷酸酶)：
(1)Label Probe-AP和探标稀释液按1:1000混合。甩去玻片上多余的清洗缓冲液，不用完全干燥，背面用吸水纸擦干。在疏水圈范围内加入约150ul标记探针-AP工作液覆盖整片组织。
(2)立即将玻片放在孵育器面板上，盖上盖子，40℃孵育15min。
8、冲洗玻片12min：
室温下，洗片缸中上下快速洗涤玻片3次，每次用200ml 1×清洗缓冲液冲洗2min。
9、使用Fast Red底物显色：
(1)将玻片取出，甩掉正面残存的清洗缓冲液，背面用吸水纸擦干。在疏水圈范围内加入约100μl常温的底物增强液覆盖整片组织，室温反应5min，同时准备Fast Red底物。
(2)底物配制：在试管中加入5ml底物稀释液(常温)，加入1粒底物，上下颠倒直至完全溶解。该底物必须在30min内使用。
(3)甩掉玻片上的底物增强液，在疏水圈内加入约400μl新鲜配制的底物。
(4)立即将玻片放在孵育器面板上，盖上盖子，在40℃孵育30min。
(5)将空玻片架放入盛有200ml 1×PBS的洗片缸中。孵育结束后，将玻片从孵育器取出，甩掉底物反应液，将玻片放入玻片架。上下洗涤1min。换新液再次洗涤2min。
10、复染25min：
(1)将玻片转移到含有200ml苏木精的染缸中染色5-30s(依所使用的苏木精浓度而定)。
(2)用新的200ml ddH2O洗1min，重复三次，去除多余苏木精。
(3)在200ml 0.01％的氨水中浸泡10s。
(4)用新的200ml ddH2O洗1min。
(5)从玻片架中取出玻片，然后轻轻地甩掉表面多余的液体，用吸水纸擦拭玻片背面。
(6)将玻片放在空气中风干，确保在封装前完全干燥(约20min)
11、封片：
用推荐的封片剂(水性封片剂)和盖玻片封片。
12、图像报告工作：
普通光学显微镜下观察组织切片中的红色信号，计算组织PD-L1 mRNA的阳性率。
实施例3
按照上述实验流程方法对7例肺腺癌组织进行检测，同时使用Dako的PD-L1抗体22C3抗体进行检测，结果见图2。统计结果见表3。
表3 7例肺腺癌组织检测结果
| 肺腺癌组织样本 | PD-L1 mRNA检测结果 | PD-L1 223C抗体检测结果 |
| A | 2+ | ++ |
| B | 2+ | + |
| C | 3+ | ++ |
| D | - | - |
| E | - | - |
| F | - | - |
| G | - | + |
结果显示，7例肺腺癌组织中有3例组织中显示PD-L1mRNA高表达(图2)，表达水平的符合性与蛋白水平检测结果相当。
序列表
<110> 郑州科蒂亚生物技术有限公司
<120> 一种在组织上检测PD-L1 mRNA的试剂盒及方法
<130> MP1933945
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<211> 44
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tctttcttca ttctcctcct ctgctttttt taaagctggc tata 44
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<211> 41
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gacatgtggc aaagccaagg tactttttta tgcattgtaa tatt 44
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<400> 92
acgtgtatac gtatatgc 18
Claims (1)
1.一种在组织上检测PD-L1 mRNA的试剂盒，其特征在于，包括SEQ ID NO.1-91所示的探针组，SEQ ID NO.92所示的标记探针，所述标记探针的3’末端带碱性磷酸酶；还包括预处理液、蛋白酶反应液、探针稀释液、预放大混合液、放大混合液、探标稀释液、清洗缓冲液、底物增强液、底物和底物稀释液；
所述蛋白酶反应液为以g/ml计0.5% 的胃蛋白酶反应液；预处理液为以g/ml计0.5%的柠檬酸水溶液；探针稀释液配方为甲酰胺2 wt %、柠檬酸钠5 wt %、NaCl 1.5 wt %、SDS3wt%，余量为水；预放大混合液配方为放大分子0.1 wt %、甲酰胺10 wt %、SDS 2 wt %、柠檬酸钠5.6 wt %，余量为水；放大混合液配方为放大分子0.1 wt %、甲酰胺10 wt %、SDS 2wt %、柠檬酸钠5.6 wt %，余量为水；探标稀释液配方为SDS 2.5 wt %、柠檬酸钠5 wt %，余量为水；50×清洗缓冲液配方为SDS2 wt %、柠檬酸钠5 wt %，余量为水；底物增强液、底物、底物稀释液购自Invitrogen公司。
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Applications Claiming Priority (1)
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2020
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Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| 放射免疫分子探针131 I-PD-L1 mAb 的制备及体内显像实验;庞小溪 等;《标记免疫分析与临床》;20181031;第25卷(第10期);第1536-1541页 * |
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