CN117887820A - 一种同时原位荧光检测人类rna、dna、蛋白质的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物检测领域,具体的,一种同时原位荧光检测RNA、DNA、蛋白质的方法。本发明采用TSA信号放大系统(TSA染料)让RNA‑FISH和蛋白免疫荧光的信号可以在DNA‑FISH实验过程的高温和强酸(胃蛋白酶消化步骤)环境中保留,从而保留原来的RNA和蛋白信号,实现同时原位荧光检测人类RNA、DNA、蛋白质。具有广阔的应用前景。
Description
技术领域
本发明属于生物检测领域,具体的,本发明涉及一种同时原位荧光检测RNA、DNA、蛋白质的方法。
背景技术
蛋白质和核酸是生物学中主要的生物大分子,其中核酸包括两大类,RNA和DNA。虽然两者被统称为核酸,但他们具有截然不同的性质。首先两者的构成不同,DNA由碱基、脱氧核糖和磷酸组成,其碱基包括:A(腺嘌呤)、G(鸟嘌呤)、C(胞嘧啶)、T(胸腺嘧啶)。 RNA由碱基、核糖和磷酸组成,其碱基构成与DNA不同,包括:A(腺嘌呤)、G(鸟嘌呤)、C(胞嘧啶)、U(尿嘧啶)。其次,对于人类等哺乳动物,RNA为单链,而DNA为双链,这就导致对DNA进行检测时,通常需要将DNA双链先进行高温变性解链为单链,再进行后续实验,而对RNA检测则不需要进行高温变性处理。另外,RNA可以与单链DNA互补配对,(A与T,G与C,U与A配对),这是RNA-FISH的探针设计原则。
荧光原位杂交(Fluorescence in situ hybridization,FISH)的基本原理是用荧光标记的单链核酸为探针,按照碱基互补配对的原则,与待检材料中的核酸(RNA或DNA)进行特异性结合,形成可被检测的杂交双链核酸,从而原位显示RNA或DNA的表达特征。FISH的一般流程为样本制备→探针制备→探针标记→杂交→洗脱→荧光显微镜检测→结果分析。RNA和DNA探针可以根据需求制备,也可以购买商业化探针。另外,由于DNA-FISH检测的是双链DNA,探针杂交前需要经过高温变性后,才能杂交,而RNA-FISH检测的是单链RNA,所以不需要经过此步骤。需要说明的是,无论是检测RNA和DNA,两者探针的本质都是DNA,虽然大部分研究将检测RNA的探针叫做RNA探针,但是也有研究会将检测RNA的探针叫做DNA探针或者模糊写为核酸探针,但并不代表他们可以同时检测RNA和DNA,需要注意区分。
免疫荧光(Immunofluorescence, IF)是根据抗原抗体反应的原理,先将已知的抗体标记上荧光素或可以触发荧光的物质(比如辣根过氧化物酶HRP),制成荧光抗体,与组织或细胞内的相应抗原结合,荧光素受外来激发光的照射而发生特定波长的荧光,通过荧光显微镜获取相应的图像,从而确定蛋白的表达特征,也可以进行相对定量。
酪酰胺信号放大技术(Tyramide Signal Amplification,TSA)的原理是TSA荧光化合物在辣根过氧化酶(HRP)的催化下与靶点附近的酪氨酸残基结合,生成稳定荧光化合物,将信号放大,实现对低丰度靶标的检测,而且TSA具有光、热、pH稳定性,不容易淬灭(PMID: 26160574)。其中HRP可以偶联二抗或者核酸探针,所以TSA技术可以应用在核酸和蛋白的荧光检测上。
组织或细胞内复杂的细胞相互作用的完整表征需要多组学策略。例如,检测和分析转录组学和蛋白质组学信息在询问复杂组织和揭示细胞类型特定基因表达方面具有重要意义(见vanlanddewijck等人,Nature 554(7693): 475-482 (2018);Stempl et al.,Journal of Molecular Diagnostics 14(1): 22-29(2014)),在鉴定分泌蛋白的细胞来源(见Liou et al.)。细胞报告19(7):1322-1333(2017)),以及可视化各种细胞类型的空间组织及其相互作用。为了充分准确地表征细胞和组织,需要在同一组织样本中同时检测核酸和蛋白质,例如,以空间分辨的方式同时检测。
RNAscope技术是近年来开发的一种新型RNA-FISH技术,其核心创新为其探针设计方案,即双Z探针设计。每个Z探针包含与目标RNA互补的18至25个碱基区域、间隔序列、14个碱基尾部序列。 只有当两个相邻的Z探针(与靶标特异互补的~50 个碱基)都结合在靶标上之后,其尾部序列(28个碱基)才会被信号预放大序列识别,而此序列可以结合20个信号放大序列,每个信号放大序列又可以结合20个HRP标记。所以,对于1 kb RNA 分子,可以产生多达 8000 个荧光标记[(1000/50)20/>20],极大的提高了灵敏度,而双Z探针设计同时减少了非特异结合,所以RNAscope具有高灵敏度和高特异性的优点,可以稳定而特异地检测细胞、FFPE、福尔马林固定OCT包埋的组织等多种样本中RNA的表达。其中,探针可以直接荧光标记,也可以与辣根过氧化物酶HRP偶联。另外,通过在RNAscope步骤中加入一抗和二抗孵育等步骤,目前商品化RNAscope试剂盒(323100,Advanced Cell Diagnostics)可以实现RNA和蛋白的共检测,但尚无法实现RNA、DNA、蛋白三者的共检测。
MICDDRP是基于细胞的DNA、RNA 和蛋白质多重免疫荧光检测 (multipleximmunofluorescent cell-based detection of DNA, RNA and protein)。 MICDDRP方法是近年来开发的检测病毒RNA、DNA、蛋白质的方法,其原理和步骤与RNAscope几乎完全一致,不同的是,改变了蛋白酶处理条件以及RNA探针和DNA探针的共孵育体系。由于该技术检测的是病毒单链DNA,所以并不需要进行高温变性,可以与RNA探针孵育条件很好的兼容,其本质上还是单链核酸和蛋白的共检测,与RNA与蛋白共检测没有本质区别。所以,这种技术并不能应用于人类和其他哺乳动物,因为哺乳动物的DNA为双链,在DNA探针孵育前必须进行高温变性解链处理。
RNA-FISH与DNA-FISH序贯实验理论上可以实现对RNA、DNA和蛋白的成像,但实际操作中需要先进行RNA-FISH部分,在获得相应图像后,将RNA信号用RNase处理掉,再进行DNA-FISH实验,然后再次成像,将两次的成像进行拟合,不仅步骤繁琐,耗时长,且并非真正意义的RNA、DNA、蛋白同时检测。有些研究(PMID: 27062923;PMID:34417748;PMID:21372809)虽然号称可以RNA,DNA,蛋白联合检测,但是实际上是先做RNA-FISH和IF,成像后再做DNA-FISH,此时原来的RNA-FISH和IF信号已经被破坏,对DNA-FISH信号成像后再跟原来的图像合成,这种方法不仅步骤繁琐,耗时长,且并不是真正意义的同时检测RNA,DNA和蛋白。
此外,Cardozo Gizzi等人实现了RNA-FISH和DNA-FISH的同时检测(PMID:31969721),但无法检测蛋白质。
由于RNA-FISH使用的探针也是DNA,所以虽然有些文献和专利中提到了DNA探针,但是他们并没有针对DNA进行检测,进行的还是RNA-FISH(PMID: 36825808).
另外,有些研究进行了RNA-FISH和蛋白质的联合检测,但是他们把针对整个细胞核的DAPI染色或者Hoechst 33342染色叫做DNA染色,这是针对整个细胞核的泛染,并不是针对特定DNA序列的DNA-FISH,并不是实现了RNA、DNA和蛋白的三者的靶向检测(PMID:26098021)。
总之,目前尚没有任何一个技术可以实现对人类等哺乳动物RNA, DNA和蛋白质的同时原位荧光检测。
发明内容
为了填补现有技术的空白,本发明用TSA信号放大系统(TSA染料)让RNA-FISH和蛋白免疫荧光的信号可以在DNA-FISH实验过程的高温和强酸(胃蛋白酶消化步骤)环境中保留。由于TSA染料被HRP催化后,可以稳定地结合在探针杂交或抗体结合的位点,具有耐热和耐PH的特点,而且,即使原本的RNA探针或者抗原/抗体被高温变性等步骤破坏,TSA染料依然会忠实地保留在原来结合的位置,所以可以完美的保留原来的RNA和蛋白信号。
具体的,本发明提供如下的技术方案:
本发明提供一种同时原位荧光检测RNA、DNA、蛋白质的方法,其中所述方法包括如下步骤:
(1)样本制备:包括但不限于将样品制备为石蜡切片、冰冻切片、贴壁或悬浮细胞;
(2)样本预处理;
(3)一抗孵育;
(4)RNA-FISH和RNA探针的TSA染色;
(5)二抗孵育和二抗的TSA染色;
(6)转接DNA-FISH的前处理;
(7)DNA-FISH探针杂交;
(8)DNA-FISH洗片和DAPI复染;(3)在每个组织块滴加约 1-2滴RNAscope®双氧水,在室温下孵育10分钟,然后蒸馏水清洗;
在一种实施方式中,所述步骤(1)包括:
(1)对于组织:获得组织后,先福尔马林固定,对组织进行石蜡包埋和OCT包埋,实验前新鲜制备石蜡切片和冰冻切片;
(2)对于细胞:贴壁细胞直接培养在用于细胞培养的载玻片上,然后福尔马林固定后进行后续实验;也可以消化为细胞悬液,经福尔马林固定后进行细胞涂片。对于悬浮细胞,直接将细胞用福尔马林固定,然后稀释成所需的浓度进行细胞涂片。
在一种实施方式中,所述步骤(2)包括:
(1)对于石蜡切片,在烤片机上60℃ 烤片30分钟,然后在二甲苯中浸泡两个5分钟(5min);对于冰冻切片和细胞涂片,在摇床上用PBS洗4次,每次5min。
(2) 在无水乙醇中浸泡2min,在第二个无水乙醇中重复上述操作,然后在通风橱内干燥载玻片。
(3)在每个组织块滴加约 1-2滴RNAscope®双氧水,在室温下孵育10分钟,然后蒸馏水清洗;
(4) 用镊子将载玻片架浸没到沸腾的 1X共检测靶标修复试剂中,处理10-20 分钟;
(5)立即将热载玻片架转移到盛有蒸馏水的清洗槽中,将载玻片架在蒸馏水中上下移动 3-5次,每次换新鲜的蒸馏水;
(6)用1X PBST 清洗载玻片,将载玻片架在1X PBST中上下移动 3-5次。
在一种实施方式中,所述步骤(3)包括:
(1)制备一抗工作液,根据组织大小,滴加30-100μl的一抗工作液;
(2)4℃过夜孵育。
在一种实施方式中,所述步骤(4)包括:
(1)将载玻片浸入4%多聚甲醛中孵育,然后用 PBST 清洗载玻片;
(2)在每个组织块上滴加1-2滴蛋白酶,在杂交炉内40℃孵育30 分钟;
(3)蛋白酶处理结束后,将载玻片用新鲜蒸馏水清洗两次,每次2分钟;
(4)去除载玻片上多余的液体,滴加 20-50μl探针混合物,完全覆盖样本,40℃孵育2小时;
(5)用清洗缓冲液在室温下清洗载玻片;
(6) 滴加1-2滴信号放大试剂AMP1,40℃孵育30分钟,然后用清洗缓冲液在室温下清洗载玻片;
(7)按上述步骤依次进行AMP2和AMP3的孵育,其中AMP3孵育15分钟即可;
(8)根据RNA探针所用的通道在载玻片上滴加1-2滴对应通道的RNAscope® HRP-C1/HRP-C2/HRP-C3,40℃下孵育15分钟,清洗缓冲液在室温下清洗载玻片;
(9)根据需要,在载玻片上滴加1-2滴染料工作液,40℃下孵育30分钟,清洗缓冲液在室温下清洗载玻片,此处选用TSA染料;
(10)去除载玻片上多余的液体,滴加 1-2 滴 多通道二代荧光HRP阻断剂 ,完全覆盖样本,40℃下孵育15分钟,清洗缓冲液在室温下清洗载玻;
(11)如果有多个不同通道的RNA探针,按通道重复(8)-(10)即可。
在一种实施方式中,所述步骤(5)包括:
(1)加入经RNAscope®共检测抗体稀释液稀释的HRP偶联二抗,使其完全覆盖组织,在室温下孵育载玻片30 分钟,用PBST清洗载玻片;
(2)加入20-50μl Opal染料工作液(与RNA探针所用染料的激发波长和发射波长区分开), 使其完全覆盖组织,在室温下孵育10分钟,用PBST清洗载玻片。
(3)去除载玻片上的多余液体,滴加共检测封闭液,使其完全覆盖组织,40℃孵育15分钟,用PBST清洗载玻片;
在一种实施方式中,所述步骤(6)包括:
(1)将载玻片置于固定液(甲醇;冰醋酸=3:1)中室温固定10分钟;
(2)65℃烤片机上避光烤片30分钟;
(3)将载玻片浸入2XSSC 洗5分钟;
(4)在37℃下胃蛋白酶处理8分钟,再用2XSSC洗5分钟;
(5)将玻片依次在70%、85%、100%乙醇中处理2分钟,然后晾干。
在一种实施方式中,所述步骤(7)包括:
(1)DNA探针杂交:用商品化的DNA探针或者定制的DNA探针,按探针:缓冲液=1:9配制,根据组织大小滴加4-10μl探针工作液,用盖玻片轻轻覆盖,周围用封片胶封好,在杂交仪上76℃ 9分钟,然后降温至42℃,
(2)将片子取出,平放在湿盒中,在37℃- 42℃ 孵育16小时以上。
在一种实施方式中,所述步骤(8)包括:
(1)取出载玻片,小心揭掉封片胶,置于2×SSC中1-2分钟,用镊子小心移除盖玻片,再在2×SSC中洗5分钟;
(2)浸入已在69℃水浴锅中平衡好的0.3%NP-40/0.4×SSC洗90秒;
(3)室温下在0.1%NP-40/ 2×SSC中洗1分钟;。
(4)将玻片依次在70%、85%、100%乙醇中处理2分钟,然后晾干;
(5)滴加即用型DAPI溶液,处理40秒,然后用抗荧光淬灭剂封片。
在一种优选的实施方式中,所述RNA、DNA、蛋白质来自人类或其他哺乳动物的组织或细胞样品。
相对于现有技术,本发明取得了如下有益的技术效果:
1)与原来的RNAsope相比,本发明在RNAscope联合蛋白免疫荧光的基础上,进行了改进,不仅节省了关键试剂的用量,而且可以与DNA-FISH实验程序兼容,实现了RNA、DNA、蛋白共检测。
2)与MICDDRP相比,本发明可以所有遗传物质为单链或者双链DNA物种(包括人类)的RNA、DNA、蛋白,应用前景非常广阔。而MICDDRP技术仅能应用于遗传物质为单链RNA或DNA的病毒。
3)与RNA-FISH&DNA-FISH序贯实验相比,本发明不用进行两次实验和两次成像再对图像进行拟合,而是直接一次实验实现RNA、DNA、蛋白的共检测和成像。
附图说明
附图用来提供对本发明的进一步理解,并且构成说明书的一部分,与本发明的实施例一起用于解释本发明,并不构成对本发明的限制。在附图中:
图1为一例47,XXX[18] / 46,XX[82]嵌合胎儿性腺中46,XX生殖细胞的TISF结果(石蜡切片);
图2为一例47,XXX[18] / 46,XX[82]嵌合胎儿性腺中46,XX体细胞的TISF结果(石蜡切片);
图3为一例47,XXX[18] / 46,XX[82]嵌合胎儿性腺中47,XXX体细胞的TISF结果(石蜡切片);
图4为一例47,XXX[18] / 46,XX[82]嵌合胎儿性腺中46,XX体细胞的TISF结果(冰冻切片);
图5所以为一例人类女性干细胞H9的TISF结果(细胞涂片)。
具体实施方式
以下结合附图对本发明的优选实施例进行说明,应当理解,此处所描述的优选实施例仅用于说明和解释本发明,并不用于限定本发明。
实施例
以下步骤1-24是在RNAscope试剂盒(323100,Advanced Cell Diagnostics)的基础上进行了改进,以节省试剂并和后续的DNA-FISH实验程序兼容,具体如下:
实验前的样本制备
对于组织:获得组织后,先福尔马林固定,对组织进行石蜡包埋和OCT包埋,实验前新鲜制备石蜡切片和冰冻切片;
对于细胞:贴壁细胞可以直接培养在用于细胞培养的载玻片上,然后福尔马林固定后进行后续实验;也可以消化为细胞悬液,经福尔马林固定后进行细胞涂片。对于悬浮细胞,直接将细胞用福尔马林固定,然后稀释成所需的浓度进行细胞涂片。
样本前期处理和一抗孵育:
1. 对于石蜡切片,在烤片机上60℃ 烤片30分钟,然后在通风橱内,在二甲苯中浸泡两次,每次5分钟;对于冰冻切片和细胞涂片,在摇床上用PBS洗4次,每次5分钟。
2. 在无水乙醇中浸泡2分钟,在第二个无水乙醇中重复上述操作,然后在通风橱内干燥载玻片。
3. 准备以下试剂备用:(1)0.1% Tween-20(PBST):在1L 1X磷酸盐缓冲液中加入1ml Tween-20,并确认pH值在7.2-7.4;(2)将10ml 50X RNAscope®共检测靶标修复试剂用490ml蒸馏水稀释为工作液。用锡箔纸覆盖烧杯,并使用热板将其加热至 98-102℃,维持这个温度。
4. 在每个组织块周围用Immedge™ 疏水笔(H-4000,VECTOR)画输水圈,每个组织块滴加约 1-2滴RNAscope®双氧水,在室温下孵育10分钟,然后蒸馏水清洗两次。
5. 用镊子非常缓慢地将载玻片架浸没到沸腾的 1X共检测靶标修复试剂中,处理15 分钟。
6. 立即将热载玻片架转移到盛有蒸馏水的清洗槽中,将载玻片架在蒸馏水中上下移动 3-5次,每次换新鲜的蒸馏水。
7. 用1X PBST 清洗载玻片,将载玻片架在1X PBST中上下移动 3-5次。
8. 用RNAscope®共检测抗体稀释液制备一抗工作液,根据组织大小,滴加30-100μl的抗体工作液,使其完全覆盖组织。
9. 将载玻片放入避光湿盒中,4℃过夜孵育。
RNAscope+IF+DNA-FISH探针杂交:
10. 在一抗孵育后,用 PBST 清洗载玻片 2 分钟。重复清洗一次,每次使用新鲜的 PBST。
11. 在通风橱内,将载玻片浸入4%多聚甲醛中,在室温下孵育 30 分钟。然后用PBST 清洗载玻片 2 分钟。重复清洗2次。期间打开HybEZ™杂交炉,将HybEZ™湿盒放入其中,40℃预热。
12. 在每个组织块上滴加1-2滴RNAscope® 蛋白酶Plus,放入预热的HybEZ™湿盒内,在HybEZ™杂交炉内40℃孵育30 分钟。之后所有40℃孵育的步骤,均在HybEZ™湿盒和杂交炉中完成。期间准备RNAscope洗液和探针;(1)将 RNAscope®50×清洗缓冲液在40℃下预热 10-20 分钟,然后按需用蒸馏水配置成1X清洗缓冲液;(2)用探针稀释液将探针稀释50倍,并在40℃预热至少10 分钟,然后冷却至室温。不同通道(C1,C2,C3)的探针可以混合。
13. 蛋白酶处理结束后,将载玻片用新鲜蒸馏水清洗两次,每次2分钟。
14. 去除载玻片上多余的液体,滴加 20-50μl探针混合物(根据组织和输水圈大小调整用量),完全覆盖样本,40℃孵育2小时。期间将下一步要用到的RNAscope® AMP1至于室温,之后的RNAscope部分,每个步骤都提前将下一步的试剂至于室温平衡。
15. 用RNAscope® 1×清洗缓冲液在室温下清洗载玻片2分钟,不时地晃动清洗槽。重复清洗一次。
16. 滴加1-2滴信号放大试剂RNAscope® AMP1,40℃孵育30分钟,然后用RNAscope® 1×清洗缓冲液在室温下清洗载玻片2分钟,不时地晃动清洗槽。重复清洗一次。
17. 按上述步骤依次进行AMP2和AMP3的孵育,其中AMP3孵育15分钟即可。
18. 根据RNA探针所用的通道(C1,C2,C3), 在载玻片上滴加1-2滴对应通道的RNAscope® HRP-C1/HRP-C2/HRP-C3,40℃下孵育15分钟,RNAscope® 1×清洗缓冲液在室温下清洗载玻片2分钟,不时地晃动清洗槽。重复清洗一次。
19. 根据需要,在载玻片上滴加1-2滴染料工作液,40℃下孵育30分钟,RNAscope® 1×清洗缓冲液在室温下清洗载玻片2分钟,不时地晃动清洗槽。重复清洗一次。此处选用TSA染料,可选染料如下:Opal 520 (A-520, Akoya), Opal 570 (A-570, Akoya), Opal620 (A-620, Akoya), Opal 690 (A-690, Akoya)。
20. 去除载玻片上多余的液体,滴加 1-2 滴 RNAscope® 多通道二代荧光HRP阻断剂 ,完全覆盖样本,40℃下孵育15分钟,RNAscope® 1×清洗缓冲液在室温下清洗载玻片2分钟,不时地晃动清洗槽。重复清洗一次。
21. 如果有多个不同通道的RNA探针,按通道重复18-20即可。
22. 蛋白免疫荧光二抗孵育:加入经RNAscope®共检测抗体稀释液稀释的HRP偶联二抗,使其完全覆盖组织,在室温下孵育载玻片30 分钟,用PBST清洗载玻片 2 分钟,重复清洗操作一次 。
23. 加入20-50μl Opal染料工作液(与RNA探针所用染料的激发波长和发射波长区分开), 使其完全覆盖组织,放入HybEZ™湿盒内,在室温下孵育10分钟,用PBST清洗载玻片2分钟,重复清洗操作一次 。
24. 去除载玻片上的多余液体,滴加1-2滴RNAscope®共检测封闭液,使其完全覆盖组织,40℃孵育15分钟,用PBST清洗载玻片2分钟,重复清洗操作一次。
25. 将载玻片置于固定液(甲醇;冰醋酸=3:1)中室温固定10分钟。
26. 65℃烤片机上避光烤片30分钟;
27. 将载玻片浸入2XSSC 洗5分钟
28. 在37℃下胃蛋白酶处理8分钟,再用2XSSC洗5分钟。所用试剂如下:
20×SSC:直接将一瓶商品化SSC粉末(66g)(02J10-032,Abbott)用超纯水溶解定容至250ml。或者称取88g氯化钠和44g柠檬酸钠溶解定容至500ml。
2×SSC∶ 取20×SSC液50ml,用超纯水定容至500ml,摇匀,用1M NaOH和1MHCl调节PH至7.0-7.3。
1M HCl:取8.2ml浓盐酸,加超纯水定容至100ml
0.01 M HCl:取 0.5 mL 1 M HCl,加入超纯水定容至 50 mL
20 mg/mL 胃蛋白酶:1g胃酶干粉溶于50mL 0.01M HCl中,充分混匀溶解,分装,-20 ℃保存备用
胃蛋白酶工作液(现用现配):40ml超纯水(提前预热到37℃)+400μl 1M HCl+100μl 20mg/ml的胃蛋白酶。
29. 将玻片依次在70%、85%、100%乙醇中处理2分钟,然后晾干。
30. DNA探针杂交:用商品化的DNA探针(Abbott)或者定制的DNA探针,按探针:缓冲液=1:9配制,根据组织大小滴加4-10μl探针工作液,用盖玻片轻轻覆盖,周围用封片胶封好,在杂交仪上76℃ 9分钟,然后降温至42℃,
31. 将片子取出,平放在湿盒中,在37℃- 42℃ 孵育16小时以上。
洗片、DAPI染核及观察结果:
32. 取出载玻片,小心揭掉封片胶,置于2×SSC中1-2分钟,用镊子小心移除盖玻片,再在2×SSC中洗5分钟。
33. 浸入已在69℃水浴锅中平衡好的0.3%NP-40/0.4×SSC洗90秒。
0.3%NP-40/0.4XSSC洗液:400ml超纯水 + 8ml 20×SSC + 1.2ml NP-40原液(07J05-001,Vysis),用1M NaOH调节pH至7.0-7.3。一般溶液偏酸,先加150μl NaOH调节,再10-20μl一点点加。
34. 室温下在0.1%NP-40/ 2×SSC中洗1分钟。
0.1%NP-40/2XSSC洗液:400mL 2×SSC + 400μl NP-40原液(07J05-001,Vysis),1M NaOH调节 pH至7.0-7.3。
35. 将玻片依次在70%、85%、100%乙醇中处理2分钟,然后晾干。
36. 滴加即用型DAPI溶液,处理40秒,然后用抗荧光淬灭剂(P10144,Invitrogen)封片。
37. 用荧光共聚焦显微镜观察结果(在本申请中以五例样本的检测结果为例):
样品1. 图1中所示为一例47,XXX[18] / 46,XX[82]嵌合胎儿性腺中46,XX生殖细胞的TISF结果(石蜡切片),其中XIST是启动XCI的长链非编码RNA,HUWE1是X连锁基因,chrX代表X染色体,由X染色体着丝粒探针(05J10-23, Vysis)指示。DDX4是生殖细胞特异标记蛋白。
如图1所示,在生殖细胞中(DDX4阳性细胞),XIST呈弱的、分散的点状分布,不能聚集在X染色体上,所以不能介导XCI,导致X连锁基因HUWE1双等位基因表达(两条X染色体附近都有HUWE1信号),且表达量较高,至少检测到10个以上的HUWE1信号。
样品2. 图2中所示为一例47,XXX[18] / 46,XX[82]嵌合胎儿性腺中46,XX体细胞的TISF结果(石蜡切片),其中XIST是启动XCI的长链非编码RNA,HUWE1是X连锁基因,chrX代表X染色体,由X染色体着丝粒探针(05J10-23, Vysis)指示。DDX4是生殖细胞特异标记蛋白。
如图2所示,在性腺体细胞中(DDX4阴性细胞),XIST在其中一条X染色体上呈聚集的云状分布,介导了这条X染色体的失活,导致X连锁基因HUWE1只在另一条没有XIST云的X染色体附近单等位基因表达,且表达量较低,只检测到1个HUWE1信号。
样品3. 图3中所示为一例47,XXX[18] / 46,XX[82]嵌合胎儿性腺中47,XXX体细胞的TISF结果(石蜡切片),其中XIST是启动XCI的长链非编码RNA,HUWE1是X连锁基因,chrX代表X染色体,由X染色体着丝粒探针(05J10-23, Vysis)指示。DDX4是生殖细胞特异标记蛋白。
如图3所示,在47,XXX性腺体细胞中(DDX4阴性且3个chrX信号的细胞),XIST在其中两条X染色体上呈聚集的云状分布,介导了这两条X染色体的失活,导致X连锁基因HUWE1只在没有XIST云的X染色体附近单等位基因表达,HUWE1表达量介于图3和图4之间。
样品4. 图4所示为一例47,XXX[18] / 46,XX[82]嵌合胎儿性腺中46,XX体细胞的TISF结果(冰冻切片)。其中XIST是启动XCI的长链非编码RNA,chrX代表X染色体,由X染色体着丝粒探针(05J10-23, Vysis)指示,H3K27me3是维持XCI的标志性组蛋白修饰。
如图4所示,长链非编码RNA XIST呈聚集的分布,并且与其中一条X染色体共定位,同时,其中一条X染色体上还富集抑制性组蛋白修饰H3K27me3,并与XIST共定位,这些结果都指示了46,XX性腺体细胞中,有一条X染色体发生了失活。
样品5. 图5所以为一例人类女性干细胞H9的TISF结果(细胞涂片)。其中XIST是启动XCI的长链非编码RNA,XACT是拮抗XIST的长链非编码RNA,chrX代表X染色体,由X染色体着丝粒探针(05J10-23, Vysis)指示,H3K27me3是维持XCI的标志性组蛋白修饰。
如图5所示人类女性干细胞中,XIST丢失,H3K27me3没有在X染色体富集,提示两条X染色体没有发生失活。其中一条X染色体附近有XACT表达,提示没有失活的X染色体(Xa),而另外一条X染色体没有XACT表达,提示另一条X染色染色体可能处于Xa和“侵蚀”的X染色体(Xe)的过渡状态。
图1到图5展示了TISF技术在人类生殖细胞和干细胞发育领域的应用,揭示了与X染色体失活(X chromosome inactivation, XCI)相关分子的原位表达特征。
显然,本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样,倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内,则本发明也意图包含这些改动和变型在内。
Claims (10)
1.一种同时原位荧光检测RNA、DNA、蛋白质的方法,其特征在于,所述方法包括如下步骤:
(1)样本制备:包括但不限于将样品制备为石蜡切片、冰冻切片、贴壁或悬浮细胞;
(2)样本预处理;
(3)一抗孵育;
(4)RNA-FISH和RNA探针的TSA染色;
(5)二抗孵育和二抗的TSA染色;
(6)转接DNA-FISH的前处理;
(7)DNA-FISH探针杂交;
(8)DNA-FISH洗片和DAPI复染;
(9)RNA/DNA/蛋白共同荧光成像。
2.如权利要求1所述的方法,其特征在于,所述步骤(1)包括:
(a)对于组织:获得组织后,先福尔马林固定,对组织进行石蜡包埋和OCT包埋,实验前新鲜制备石蜡切片和冰冻切片;
(b)对于细胞:贴壁细胞直接培养在用于细胞培养的载玻片上,然后福尔马林固定后进行后续实验;也可以消化为细胞悬液,经福尔马林固定后进行细胞涂片,对于悬浮细胞,直接将细胞用福尔马林固定,然后稀释成所需的浓度进行细胞涂片。
3.如权利要求1所述的方法,其特征在于,所述步骤(2)包括:
(a)对于石蜡切片,在烤片机上60℃ 烤片30分钟,然后在二甲苯中浸泡两个5分钟;对于冰冻切片和细胞涂片,在摇床上用PBS洗4次,每次5分钟;
(b) 在无水乙醇中浸泡2分钟,在第二个无水乙醇中重复上述操作,然后在通风橱内干燥载玻片;
(c)在每个组织块滴加约 1-2滴RNAscope®双氧水,在室温下孵育10分钟,然后蒸馏水清洗;
(d) 用镊子将载玻片架浸没到沸腾的 1X共检测靶标修复试剂中,处理10-20 分钟;
(e)立即将热载玻片架转移到盛有蒸馏水的清洗槽中,将载玻片架在蒸馏水中上下移动 3-5次,每次换新鲜的蒸馏水;
(f)用1X PBST 清洗载玻片,将载玻片架在1X PBST中上下移动 3-5次。
4.如权利要求1所述的方法,其特征在于,所述步骤(3)包括:
(a)制备一抗工作液,根据组织大小,滴加30-100μl的一抗工作液;
(b)4℃过夜孵育。
5.如权利要求1所述的方法,其特征在于,所述步骤(4)包括:
(a)将载玻片浸入4%多聚甲醛中孵育,然后用 PBST 清洗载玻片;
(b)在每个组织块上滴加1-2滴蛋白酶,在杂交炉内40℃孵育30 分钟;
(c)蛋白酶处理结束后,将载玻片用新鲜蒸馏水清洗两次,每次2分钟;
(d)去除载玻片上多余的液体,滴加 20-50μl探针混合物,完全覆盖样本,40℃孵育2小时;
(e)用清洗缓冲液在室温下清洗载玻片;
(f) 滴加1-2滴信号放大试剂AMP1,40℃孵育30分钟,然后用清洗缓冲液在室温下清洗载玻片;
(g)按上述步骤依次进行AMP2和AMP3的孵育,其中AMP3孵育15分钟即可;
(h)根据RNA探针所用的通道在载玻片上滴加1-2滴对应通道的RNAscope® HRP-C1/HRP-C2/HRP-C3,40℃下孵育15分钟,清洗缓冲液在室温下清洗载玻片;
(i)根据需要,在载玻片上滴加1-2滴染料工作液,40℃下孵育30分钟,清洗缓冲液在室温下清洗载玻片,此处选用TSA染料;
(j)去除载玻片上多余的液体,滴加 1-2 滴 多通道二代荧光HRP阻断剂 ,完全覆盖样本,40℃下孵育15分钟,清洗缓冲液在室温下清洗载玻;
(k)如果有多个不同通道的RNA探针,按通道重复(8)-(10)即可。
6.如权利要求1所述的方法,其特征在于,所述步骤(5)包括:
(a)加入经RNAscope®共检测抗体稀释液稀释的HRP偶联二抗,使其完全覆盖组织,在室温下孵育载玻片30 分钟,用PBST清洗载玻片;
(b)加入20-50μl Opal染料工作液, 使其完全覆盖组织,在室温下孵育10分钟,用PBST清洗载玻片;
(c)去除载玻片上的多余液体,滴加共检测封闭液,使其完全覆盖组织,40℃孵育15分钟,用PBST清洗载玻片。
7.如权利要求1所述的方法,其特征在于,所述步骤(6)包括:
(a)将载玻片置于固定液中室温固定10分钟,固定液配比为甲醇:冰醋酸=3:1;
(b)65℃烤片机上避光烤片30分钟;
(c)将载玻片浸入2XSSC 洗5分钟;
(d)在37℃下胃蛋白酶处理8分钟,再用2XSSC洗5分钟;
(e)将玻片依次在70%、85%、100%乙醇中处理2分钟,然后晾干。
8.如权利要求1所述的方法,其特征在于,所述步骤(7)包括:
(a)DNA探针杂交:用商品化的DNA探针或者定制的DNA探针,按探针:缓冲液=1:9配制,根据组织大小滴加4-10μl探针工作液,用盖玻片轻轻覆盖,周围用封片胶封好,在杂交仪上76℃ 9分钟,然后降温至42℃,
(b)将片子取出,平放在湿盒中,在37℃- 42℃ 孵育16小时以上。
9.如权利要求1所述的方法,其特征在于,所述步骤(8)包括:
(a)取出载玻片,小心揭掉封片胶,置于2×SSC中1-2分钟,用镊子小心移除盖玻片,再在2×SSC中洗5分钟;
(b)浸入已在69℃水浴锅中平衡好的0.3%NP-40/0.4×SSC洗90秒;
(c)室温下在0.1%NP-40/ 2×SSC中洗1分钟;
(d)将玻片依次在70%、85%、100%乙醇中处理2分钟,然后晾干;
(e)滴加即用型DAPI溶液,处理40秒,然后用抗荧光淬灭剂封片。
10.如权利要求1-8任一所述的方法,其特征在于,所述RNA、DNA、蛋白质来自人类或其他哺乳动物的组织或细胞样品。
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