CN115287336A - 一种检测人淋巴细胞eb病毒感染和免疫检查点表达水平的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种检测人淋巴细胞EB病毒感染和免疫检查点表达水平的方法,其包括:使用具有第一荧光标记的流式抗体标记细胞表面的免疫检查点,然后具用第二荧光标记的EBER探针与细胞内EBER进行杂交,获得的杂交体经分支DNA技术使信号扩增,再由流式细胞仪检测EB病毒感染的淋巴细胞亚群,并对比EB病毒阴性淋巴细胞亚群和EB病毒阳性淋巴细胞亚群免疫检查点表达水平。采用上述检测方法,不但能够区分EBER阳性淋巴细胞亚群和EBER阴性淋巴细胞亚群,还能同时检测两个细胞亚群中PD‑1、PD‑L1的表达水平,在显著提高了检测效率的同时还使检测具有更高的敏感度、特异性。
Description
技术领域
本发明涉及医学技术领域,具体而言,涉及一种检测人淋巴细胞EB病毒感染和免疫检查点表达水平的方法。
背景技术
EB病毒(EBV)是一种疱疹病毒,与多种血液系统疾病密切相关,如传染性单核细胞增多症(IM)、慢性活动性EBV感染(CAEBV)、伯基特淋巴瘤(BL)、霍奇金淋巴瘤(HL)、非霍奇金淋巴瘤(NHL)、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、EBV相关噬血细胞综合征(EBV-HLH)、移植后淋巴增殖性疾病(PTLD)。目前医学界公认的判断组织是否存在EBV感染的标准方式是EBV编码的小RNA(EBV-encoded RNA,EBER)原位杂交。其原理主要是在处理过后的肿瘤组织石蜡切片上依次滴加地高辛标记的EBER探针、辣根过氧化物酶标记的抗地高辛抗体、DAB显色液后进行苏木精染色,最后由病理科医生阅片,以肿瘤细胞棕黄色核染色显色区域≥5%为阳性,否则为阴性。
随着化疗手段的更新及小分子靶向治疗的应用,EBV相关血液疾病病人的生存期得到明显延长,但是复发难治比例仍然很高,因此寻找新的治疗方法对于此类复发难治类病人的生存至关重要。免疫检查点(immune checkpoint,IC)是免疫细胞上的抑制性受体,主要包括PD-1、CTLA-4、LAG-3、TIM-3、VISTA和TIGIT等。正常情况下,IC参与维持免疫耐受,当机体发生肿瘤时,许多恶性肿瘤细胞和肿瘤微环境中的非肿瘤细胞表达IC配体,与免疫细胞表面的IC受体结合,抑制免疫细胞对肿瘤细胞的杀伤作用,帮助肿瘤细胞免疫逃逸。研究表明,IC高表达与血液疾病预后不良相关,而EBV能够诱导多种IC分子表达。与EBV阴性(EBV-)的血液疾病病人相比,EBV阳性(EBV+)的血液疾病病人PD-L1基因突变率显著增高,CTLA-4、LAG3、TIM3和TIGIT的转录及表达水平也显著增高。近年来免疫检查点抑制剂(ICIs),如抗PD-1抗体——纳武单抗在部分血液肿瘤疾病中取得了较好的疗效,然而对于未经选择或选择不够精准的病人群体来说,ICIs的疗效大打折扣。
截至目前,免疫组织化学是临床上判断PD-1、PD-L1等IC分子表达情况的主要手段。其原理主要是在处理过后的肿瘤石蜡组织切片上依次滴加抗PD-1单抗(或抗PD-L1单抗)、二抗、DAB显色液后进行苏木精染色,最后由病理科医生阅片,以肿瘤浸润淋巴细胞出现细胞膜或细胞浆棕黄色显色认为是PD-1(或PD-L1)阳性表达。PD-1(或PD-L1)阳性细胞占比评分标准为:随机选取10个高倍镜视野(10×40),每个视野内观察100个细胞,显微镜下计数出现细胞膜或细胞浆棕黄色着色的细胞数目。阳性细胞率=细胞膜或细胞浆阳性细胞数目/总观察的细胞数×100%。阳性判读:以细胞膜棕黄色显色≥5%为阳性,否则为阴性。此外,已有文献报道了一种使用流式细胞术-荧光原位杂交联用技术(Flow-FISH)鉴定人外周血淋巴细胞中EBV感染细胞亚群的技术,进一步为临床前实验奠定了基础。
但是,采用EBER原位杂交和PD-1、PD-L1免疫组织化学这两种检测方法存在以下缺陷:(1)需要对病人进行穿刺病理活检,存在创伤大、风险高、病人接受困难等缺点,实际临床应用中并不可取;(2)需要进行脱蜡、水化、消化等一系列操作,程序繁琐,耗时久,效率低;(3)判读结果不稳定。样本类型(新鲜标本还是蜡块切片)、样本来源(原发部位还是转移部位)、肿瘤取样位置、病理科医生的判读经验等都会导致检测结果存在一定的差异。而Flow-FISH技术检测EBV阴性细胞系的EBER阳性率>1%,在鉴别EBER阴性细胞和EBER阳性细胞方面的特异度仍有待提升。
鉴于此,特提出本发明。
发明内容
本发明的目的在于提供一种检测人淋巴细胞EB病毒感染和免疫检查点表达水平的方法,将EBER原位杂交、分支DNA技术和流式细胞术结合,不但能够区分EBER阳性淋巴细胞亚群和EBER阴性淋巴细胞亚群,还能同时检测两个细胞亚群中PD-1、PD-L1的表达水平,在显著提高了检测效率的同时还使检测具有更高的敏感度、特异性。
本发明是这样实现的:
本发明提供了一种检测人淋巴细胞EB病毒感染和免疫检查点表达水平的方法,其包括使用具有第一荧光标记的流式抗体标记细胞表面的免疫检查点,然后具用第二荧光标记的EBER探针与细胞内EBER进行杂交,获得的杂交体经分支DNA技术使信号扩增,再由流式细胞仪检测EBV感染细胞亚群,并对比EBV阳性细胞亚群和EBV阴性淋巴细胞亚群的免疫检查点表达水平。
在可选的实施方式中,细胞包括外周血单个核细胞和骨髓单个核细胞;
免疫检查点包括PD-1和PD-L1。
在可选的实施方式中,流式抗体标记细胞表面的免疫检查点时,反应条件为:2-8℃中避光反应30-40分钟。
在可选的实施方式中,EBER探针与细胞内EBER杂交时,反应条件为:35-40℃中孵育2-2.5小时。
在可选的实施方式中,第一荧光标记与第二荧光标记不同。
在可选的实施方式中,分支DNA技术包括依次进行的预放大杂交、放大杂交和标记探针杂交步骤。
在可选的实施方式中,预放大杂交步骤中反应条件为:35-40℃中孵育1.5-2h。
在可选的实施方式中,放大杂交步骤中反应条件为35-40℃中孵育1.5-2h。
在可选的实施方式中,标记探针杂交步骤中反应条件为35-40℃中孵育1-1.5h。
在可选的实施方式中,上述检测方法还包括:在EBER探针与细胞内EBER进行杂交前,对细胞进行固定和透化;固定包括第一次固定和第二次固定。
在可选的实施方式中,第一次固定的条件为:温度为2-8℃,时间为30-40分钟。
在可选的实施方式中,第二次固定的条件为:室温下避光孵育60-70分钟。
本发明具有以下有益效果:
(1)本发明通过将EBER原位杂交、分支DNA技术和流式细胞术结合,能够同时检测人血液中淋巴细胞EBER阳性率和PD-1、PD-L1等IC分子表达水平,并在单细胞水平上将EBV感染情况和PD-1、PD-L1表达水平严格对应起来,对探索EBV致病机制、评估病人疾病严重程度、指导临床靶向用药和判断预后来说都具有重要的意义。
(2)本发明的检测方法包括分支DNA技术,相对于现有技术中采用的流式-荧光原位杂交,本发明能够使靶RNA转录本的信号扩增8000-16000倍,因此在检测EBER杂交体时的敏感度、特异性都明显优于流式-荧光原位杂交。
(3)相较于耗时数天的EBER原位杂交和PD-1、PD-L1免疫组化,本发明检测完成仅需两天,能够明显提高临床诊疗效率。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案,下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍,应当理解,以下附图仅示出了本发明的某些实施例,因此不应被看作是对范围的限定,对于本领域普通技术人员来讲,在不付出创造性劳动的前提下,还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1为实施例1中健康人外周血淋巴细胞中PD-1、PD-L1阳性百分比分析流式图;
图2为实施例2中CAEBV病人外周血淋巴细胞中PD-1、PD-L1阳性百分比分析流式图;
图3为实施例3中检测EBV阴性细胞系和EBV阳性细胞系的EBER阳性率分析流式图;
图4为对比例1中CAEBV病人淋巴结PD-1免疫组化图;
图5为对比例1中CAEBV病人淋巴结PD-L1免疫组化图;
图6为对比例2中CAEBV病人淋巴结EBER原位杂交的结果图;
图7为对比例3中Flow-FISH检测EBV阴性细胞系和EBV阳性细胞系的EBER阳性率分析流式图。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚,下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者,按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者,均为可以通过市售购买获得的常规产品。
荧光原位杂交技术是一种重要的非放射性原位杂交技术,原理是利用报告分子(如生物素、地高辛等)标记核酸探针,然后将探针与染色体或DNA纤维切片上的靶DNA杂交,若两者同源互补,即可形成靶DNA与核酸探针的杂交体。此时可利用该报告分子与荧光素标记的特异亲和素之间的免疫化学反应,经荧光检测体系在镜下对待DNA进行定性、定量或相对定位分析。
分支DNA测定技术基于其独特的信号放大系统,即分支DNA信号放大系统,这是一个人工合成的分支DNA,分支DNA的分支可结合多个酶标记物,从而将捕获的靶标信号放大,以便进行检测。
流式细胞术是对悬液中的单细胞或其他生物粒子,通过检测标记的荧光信号,实现高速、逐一的细胞定量分析和分选的技术。
本发明通过将EBER原位杂交、分支DNA技术和流式细胞术联用,建立了一种检测人淋巴细胞EB病毒感染和免疫检查点表达水平的方法,其包括使用具有第一荧光标记的流式抗体标记细胞表面的免疫检查点,然后具用第二荧光标记的EBER探针与细胞内EBER进行杂交,获得的杂交体经分支DNA技术使信号扩增,再由流式细胞仪检测EBV感染细胞亚群,并对比EBV阳性细胞亚群和EBV阴性淋巴细胞亚群的免疫检查点表达水平,根据检测结果获得EBV感染与人淋巴细胞表面PD-1、PD-L1表达水平的关系。
具体地,本发明提供的一种检测人淋巴细胞EB病毒感染和免疫检查点表达水平的方法的步骤包括:
(1)向单个核细胞中加入具有第一荧光标记的流式抗体进行流式染色。其中流式抗体包括BV421-抗PD-1荧光单抗、BB515-抗PD-L1荧光单抗;反应条件为:2-8℃中避光反应30-40分钟。
在本发明中,用流式抗体染色的免疫检查点包括PD-1、PD-L1,但是并不局限于上述免疫检查点,还可以根据检测需要,选择其他免疫检查点,比如:PD-L2、B7-H3、B7-H4、CTLA-4、LAG-3、TIM-3、CEACAM-1、HMGB1、GAL-9、VISTA、TIGIT、CD155、CD112、BTLA、HVEM。
在一些实施例中,第一荧光标记包括BV421、BB515、APC。
(2)将进行了流式染色后的细胞进行固定和透化。
其中,对细胞的固定分为第一次固定和第二次固定。固定和透化的顺序依次为:第一次固定、透化和第二次固定。
第一次固定的条件为:温度为2-8℃,时间为30-40分钟。
第二次固定的条件为:室温下避光孵育60-70分钟。
(3)在细胞固定和透化后,将其与具有第二荧光标记的EBER探针杂交。其中,杂交的条件为35-40℃中孵育2-2.5小时。
需要注意的是,由于同时采用了具有第一荧光标记的流式抗体和具有第二荧光标记EBER探针,为了能把EBER阳性淋巴细胞亚群和EBER阴性淋巴细胞亚群与PD-1、PD-L1染色结果区分开,本发明中的第一荧光标记和第二荧光标记不同。例如:第一荧光标记为BV421和BB515,那么第二荧光标记则为除BV421和BB515之外的其他荧光标记;如果第二荧光标记为APC,那么第一荧光标记则为除APC之外的其他荧光标记。
(4)在与EBER探针杂交后,对获得的杂交体进行信号预放大杂交。其中预放大杂交的条件为:在35-40℃中孵育1.5-2h。
(5)在经过信号预放大杂交后,对杂交体进行信号放大杂交。其中放大杂交的条件为:在35-40℃中孵育1.5-2h。
(6)在经过信号放大杂交后,将杂交体与标记探针杂交。其中,杂交体与标记探针杂交的条件为35-40℃中孵育1-1.5h。
(7)将获得的杂交体在流式细胞仪上检测。
(8)数据分析,使用Flowjo软件对流式结果进行分析。
以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。
实施例1
本实施例提供了一种检测人淋巴细胞EB病毒感染和免疫检查点表达水平的方法,其中采用的试剂盒包括:Thermo Fisher公司的RNA Assay(Cat#88-18005)和Cat#278976-000,Cat#278976-000试剂盒中包括APC荧光标记的EBER探针,Cat#88-18005中包括抗体染色、固定、透化、探针杂交、信号放大、洗涤以及保存所需的试剂。
(1)分离单个核细胞:以一名健康人外周血为样本,向抗凝管中的外周血标本(单次检测总血量≥5mL)中加入等体积的无菌(1×)PBS,使用移液枪轻轻吹打混匀后,将稀释后的血液样品缓慢滴加至等体积的Ficoll单个核细胞分离液(GE生物公司,货号17-5442-02)上,注意不要破坏液面。每4ml稀释后的血液标本缓慢滴加在3mL的Ficoll液上,然后室温400g离心30分钟。离心后液体将由上至下分为4层:血浆和血小板层、单个核细胞层(白膜层)、Ficoll液层、粒细胞和红细胞层。吸取白膜层至新的离心管,加入等体积(1×)PBS吹打混匀,室温下400g离心10分钟后弃上清。重复洗一次。
(2)重悬细胞:将PrimeFlow试剂盒中的Wash Buffer预热至室温,该缓冲液首先用于步骤8。
(3)抗体染色:100μL Flow Cytometry Staining Buffer重悬1-5×106个细胞于试剂盒提供的1.5mL EP管中。使用BV421抗PD-1荧光单抗(BD生物公司,货号9150628)、BB515抗PD-L1荧光单抗(BD生物公司,货号1152578)进行流式染色,2-8℃中避光染色30-40分钟。
由于EBER探针为APC荧光,因此首次检测时,每个人的血液样品一共分成5个管:空白管、BV421-抗PD-1单染管单染管、BB515-抗PD-L1单染管、APC单染管、多染管,用于调节电压及补偿。确定好电压及补偿后,之后的检测中可不设单染管,只设定空白管、多染管。向各管中加入1mL Flow Cytometry Staining Buffer,500g离心5分钟,离心后弃上清,在剩余体积中重悬细胞。
(4)固定:将Fixation Buffer 1A和Fixation Buffer 1B等体积混合,制备Fixation Buffer 1。轻轻混匀。向各管中加入1mL Fixation Buffer 1,2-8℃固定30-40分钟。800g离心5分钟,弃上清。
(5)制备透化液:用DEPC水将(10×)Permeabilization Buffer稀释至(1×)Permeabilization Buffer,以1/100稀释度加入(100×)RNase抑制剂。
(6)透化:第(4)步完成后,每管加入1mL透化液,800g离心5分钟,弃上清。重复洗一次。
(7)固定:将125μL(8×)Fixation Buffer 2与875μL Wash Buffer混合,制备成(1×)Fixation Buffer 2。向各管中加入1mL(1×)Fixation Buffer 2,室温避光孵育60-70分钟。800g离心5分钟,弃上清,管中留100μL液体。
(8)洗涤:每管加入1mL Wash Buffer,室温800g离心5分钟,弃上清,管中留100μL液体。重复洗1次。
(9)EBER探针杂交前准备:室温解冻(20×)EBER探针,同时将Target ProbeDilution预热至40℃。用Target Probe Dilution将EBER探针稀释至1/20。
(10)EBER探针杂交:仅在每个多染管中加入100μL稀释的EBER探针,35-40℃孵育2-2.5小时。1小时后将EP管轻轻颠倒混匀。孵育完成后,每管加入1mL Wash Buffer,室温800g离心5分钟,弃上清,管中留100μL液体。
(11)过夜保存:将10μL(100×)RNase抑制剂与990μL Wash Buffer混合,制备成(1×)RNase抑制剂。向每管中加入1mL(1×)RNase抑制剂,室温800g离心5分钟,弃上清,管中留100μL液体。2-8℃避光储存过夜。
(12)信号放大:将样品和Wash Buffer预热至室温,PreAmp Mix、AmpMix和LabelProbes Diluent预热至40℃。每管加入100μL PreAmp Mix,35-40℃孵育1-1.5小时。每管中加入1mL Wash Buffer,室温800g离心5分钟。弃上清,管中留100μL液体,共清洗3次。
(13)信号放大:每管加入100μL Amp Mix,35-40℃孵育1.5-2小时。4℃解冻(100×)Label Probes。孵育完成后,每管中加入1mL Wash Buffer,室温800g离心5分钟。弃上清,管中留100μL液体,共清洗2次。
(14)孵育标记探针:用Label Probes Diluent将(100×)Label Probes稀释成(1×)Label Probes。每管中加入100μL(1×)Label Probes,35-40℃孵育1-1.5小时。孵育完成后,每管中加入1mL Wash Buffer,室温800g离心5分钟。弃上清,管中留100μL液体,共清洗2次。
(15)洗涤:每管加入1mL Storage Buffer或Flow Cytometry Staining Buffer,室温800g离心5分钟,弃上清。
(16)上机检测:用移液枪将样品转移至流式管中,加入适当体积的StorageBuffer或Flow Cytometry Staining Buffer,轻轻吹打混匀,在多参数流式细胞仪上检测样本。
(17)数据分析:使用Flowjo软件对流式结果进行分析,据空白管、单染管设立阴、阳性界线。首先圈住淋巴细胞群(图1.A),双击后以EBER-APC为横坐标,PD-1-BV421为纵坐标,左上象限为淋巴细胞中EBER(-)PD-1(+)细胞,右上象限为淋巴细胞中EBER(+)PD-1(+)细胞(图1.B)。计算并对比EBER阴性细胞亚群和EBER阳性细胞亚群中PD-1(+)细胞的占比。PD-L1分析方法相同(图1.C)。统计结果如表1所示。
(18)结果判读:分析不同人的样本时,均以其本身的空白管作为阴、阳性界线依据。EBER阳性细胞的判断:横坐标为EBER-APC,线左侧为EBER阴性细胞亚群,线右侧为EBER阳性细胞亚群。PD-1或PD-L1阳性细胞的判断:纵坐标为PD-1-BV421(或PD-L1-BB515),根据空白管细胞分布进行划阴、阳性分界线,线下侧为PD-1阴性细胞(或PD-L1阴性细胞),线上侧为PD-1阳性细胞(或PD-L1阳性细胞)。
表1健康人EBER阴性细胞和EBER阳性细胞中PD-1阳性细胞和PD-L1阳性细胞百分比
实施例2
本实施例与实施例1的检测方法相同,区别在于检测的对象为首都医科大学附属北京友谊医院血液内科的1例确诊为EBV感染的病人。该病人为:男,50岁,入院检查EBV-DNA结果为:血浆<5.0E+02拷贝/mL,PBMC2.3E+04拷贝/mL,结合其他检查诊断为CAEBV。流式结果如图2所示,根据流式结果获得的统计数据如表2所示。
表2 CAEBV病人EBER阴性细胞和EBER阳性细胞中PD-1阳性细胞和PD-L1阳性细胞百分比
从图2和表2中可以得出,该病人外周血淋巴细胞中EBER阳性细胞百分比:1.37%;外周血EBER阳性淋巴细胞中PD-1阳性细胞百分比:1.24%;外周血EBER阳性淋巴细胞中PD-L1阳性细胞百分比:4.31%。
实施例3
本实施例与实施例1的检测方法相同,区别在于检测的对象为EBV阴性细胞系、EBV阳性细胞系,具体地,EBV阴性细胞系为人慢性髓原白血病细胞K562(普诺赛生物公司,货号CL-0130),EBV阳性细胞系为人Burkitt’s瘤细胞系RAJI(普诺赛生物公司,货号CL-0189)。
流式结果如图3所示,从图中可以得出,EBV阴性细胞系K562的EBER阳性率:0.1%;EBV阳性细胞系RAJI的EBER阳性率:94.2%。
对比例1
以实施例2中病例为样本,对其进行右侧腋窝淋巴结穿刺活检。
穿刺活检步骤如下:在B超定位下找到右侧腋窝淋巴结,选中穿刺部位,进行消毒、铺巾,进行定位周围的局部浸润麻醉,切开皮肤约0.3-0.5cm,将穿刺针沿定位方向进行穿刺,得到组织。本次穿刺取出灰白色组织2条,长10-15mm,直径1mm。抽出穿刺针,将穿刺得到的组织进行病理活检,最后用无菌敷料压迫穿刺部位进行止血。将条状组织放于福尔马林液中进行固定,取出后进行免疫组化。
免疫组化步骤如下:将条状组织从福尔马林液中取出,自然晾干,加抗PD-1一抗或抗PD-L1一抗,37℃孵育5-10分钟,用PBS缓冲液冲洗3次,每次5-10秒;加入聚合物增强剂,37℃孵育5分钟,PBS清洗3次,每次5-10秒;加二抗,37℃孵育5分钟,PBS清洗3次,每次5-10秒;DAB 37℃染色1分钟,用双蒸水冲洗3次,每次5-10秒;HE复染15秒,45℃水浴15秒返蓝,封片后镜下观察。
其免疫组化结果如图4和图5所示,其中,图4为CAEBV病人淋巴结PD-1免疫组化图;图5为CAEBV病人淋巴结PD-L1免疫组化图。
对比例2
以实施例2中病例为样本,对其进行EBER原位杂交。
穿刺活检步骤如下:在B超定位下找到右侧腋窝淋巴结,选中穿刺部位,进行消毒、铺巾,进行定位周围的局部浸润麻醉,切开皮肤约0.3-0.5cm,将穿刺针沿定位方向进行穿刺,得到组织。本次穿刺取出灰白色组织2条,长10-15mm,直径1mm。抽出穿刺针,将穿刺得到的组织进行病理活检,最后用无菌敷料压迫穿刺部位进行止血。将条状组织放于福尔马林液中进行固定,取出后进行EBER原位杂交。
EBER原位杂交步骤如下:将条状组织从福尔马林液中取出,石蜡包埋,4-6微米石蜡切片在56-60℃烤片2-16小时;经新鲜二甲苯脱蜡,10分钟每次,共脱蜡2次;将切片放置于新鲜100%乙醇中5分钟,经空气干燥5-10分钟后进行酶处理;将切片放置于37℃中,每张切片加入300-400微升胃酶消化液孵育30分钟,逐级酒精脱水(70%、95%、100%),每个梯度放置1分钟经空气干燥后进行杂交;混匀EBER探针溶液,在每张切片上滴加10-20微升的探针,加盖盖玻片,37℃孵育2小时后将切片浸入PBS缓冲液中10分钟,直到盖玻片自然脱落;用PBS缓冲液清洗3次,每次2分钟,清洗后擦干;切片上加入辣根过氧化物酶标记的抗地高辛抗体,37℃孵育30分钟,PBS缓冲液清洗3次,每次1分钟;用双蒸水冲洗切片1次,每次1分钟;待切片干燥后,滴加DAB工作液,显色5-15分钟,用双蒸水冲洗切片3次,每次1分钟;封片,镜下观察。
原位杂交的结果如图6所示,从图中可以得出,CAEBV病人右腋窝淋巴结切片中高倍镜视野下有40个EBER阳性细胞。
对比文件3
Flow-FISH检测EBV阴性细胞系、EBV阳性细胞系,具体的操作步骤参考:2022年3月苏虹宇等发表在中国实验血液学杂志上的《应用流式-荧光原位杂交协助鉴别诊断EB病毒感染的淋巴细胞亚群》,其中,EBV阴性细胞系为人B淋巴细胞白血病细胞系SUP-B15(重庆医科大学附属儿童医院临床分子医学中心苏虹宇实验室库存),EBV阳性细胞系为人Burkitt’s瘤细胞系RAJI(上海中乔新舟生物公司,货号ZQ0084)。
流式结果如图7所示,从图中可以得出,EBV阴性细胞系SUP-B15的EBER阳性率:3.05%;EBV阳性细胞系RAJI的EBER阳性率:91.8%。
通过实施例3与对比例3相比,本发明采用的检测方法在鉴别EBER阴性细胞和EBER阳性细胞方面敏感度更高。
与对比例1-3相比,实施例1-3在单细胞水平上明确了EBV感染与人PD-1、PD-L1表达水平的关系,对进一步探索EBV致病机制意义重大。如实施例2中CAEBV病人的检测结果显示,相较于EBER阴性的淋巴细胞,EBER阳性的淋巴细胞中PD-L1阳性率增高,PD-1阳性率下降,表明EBV可能通过上调宿主细胞表面PD-L1表达来抑制宿主细胞免疫功能。而EBER原位杂交和PD-1、PD-L1免疫组化仅能在组织水平上大致反映EBV感染和PD-1、PD-L1表达水平的相关性,无法明确判断二者因果关系。
同时,本发明检测出的EBER阳性率可精确到0.01%(如CAEBV病人外周血淋巴细胞中EBER阳性细胞占比为1.37%)。而EBER原位杂交只能精确到个位数(如CAEBV病人右腋窝淋巴结切片中高倍镜视野下有40个EBER阳性细胞)。本发明因具有独特的分支DNA技术,相较于Flow-FISH敏感性更高,如实施例3中本发明检测EBV阳性细胞系RAJI的EBER阳性率为94.2%,而对比例3中Flow-FISH检测EBV阳性细胞系RAJI的EBER阳性率为91.8%。
此外,本发明只需要少量体液标本即可检测EBV感染和多种IC分子,检测过程仅需2天。而EBER原位杂交和PD-1、PD-L1免疫组化依赖于组织活检,创伤较大,病人接受度低,且操作复杂,耗时久。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已,并不用于限制本发明,对于本领域的技术人员来说,本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内,所作的任何修改、等同替换、改进等,均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种检测人淋巴细胞EB病毒感染和免疫检查点表达水平的方法,其特征在于,包括:使用具有第一荧光标记的流式抗体标记细胞表面的免疫检查点,然后具用第二荧光标记的EBER探针与细胞内EBER进行杂交,获得的杂交体经分支DNA技术使信号扩增,再由流式细胞仪检测EB病毒感染的淋巴细胞亚群,并对比EB病毒阴性淋巴细胞亚群和EB病毒阳性淋巴细胞亚群免疫检查点表达水平。
2.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述细胞包括外周血单个核细胞和骨髓单个核细胞;
所述免疫检查点包括PD-1和PD-L1。
3.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述流式抗体标记细胞表面的免疫检查点时,反应条件为:2-8℃中避光反应30-40分钟。
4.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述EBER探针与细胞内EBER杂交时,反应条件为:35-40℃中孵育2-2.5小时。
5.根据权利要求1-4任一项所述的方法,其特征在于,所述第一荧光标记与第二荧光标记不同。
6.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述分支DNA技术包括依次进行的预放大杂交、放大杂交和标记探针杂交步骤。
7.根据权利要求6所述的方法,其特征在于,所述预放大杂交步骤中反应条件为:35-40℃中孵育1.5-2h。
8.根据权利要求6所述的方法,其特征在于,所述放大杂交步骤中反应条件为35-40℃中孵育1.5-2h。
9.根据权利要求6所述的方法,其特征在于,所述标记探针杂交步骤中反应条件为35-40℃中孵育1-1.5h。
10.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述方法还包括:在EBER探针与细胞内EBER进行杂交前,对细胞进行固定和透化;所述固定包括第一次固定和第二次固定;
优选地,所述第一次固定的条件为:温度为2-8℃,时间为30-40分钟;
优选地,所述第二次固定的条件为:室温下避光孵育60-70分钟。
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