CN114214456A

CN114214456A - 一种鉴别诊断ebv感染细胞亚型的方法及其应用

Info

Publication number: CN114214456A
Application number: CN202111511189.7A
Authority: CN
Inventors: 舒逸; 苏虹宇; 邹琳; 傅国; 何晓燕
Original assignee: SHANGHAI CHILDREN'S HOSPITAL; Childrens Hospital of Chongqing Medical University
Current assignee: SHANGHAI CHILDREN'S HOSPITAL; Childrens Hospital of Chongqing Medical University
Priority date: 2021-12-03
Filing date: 2021-12-03
Publication date: 2022-03-22

Abstract

本发明属于医学术领域，具体公开了一种鉴别诊断EBV感染细胞亚型的方法及其应用，包括如下步骤：用荧光标记淋巴细胞特异性抗体对细胞进行染色，然后运用FISH探针特异性识别细胞内EBV感染特征性RNA：EBERs，接着通过流式细胞术检测EBV感染细胞亚群，来鉴别EBV感染的细胞亚型。本发明将流式细胞术与原位荧光杂交术联用，建立了一种能直接、快速、便利、可靠地检测和鉴别临床外周血标本中淋巴细胞的EBV感染细胞亚型的方法，具有极高的临床应用价值。

Description

一种鉴别诊断EBV感染细胞亚型的方法及其应用

技术领域

本发明涉及医学技术领域，特别是涉及一种鉴别诊断EBV感染细胞亚型的方法及其应用。

背景技术

EBV(Epstein-Barr Virus,EBV)病毒是一种4型疱疹病毒，也是第一个被发现与肿瘤相关的病毒。该病毒在人群中感染率达到90％，但大多表现为无症状感染者。人体中EBV主要的靶细胞为B细胞及口腔上皮细胞，此外少量T细胞，NK细胞等也可感染EBV。通常，EBV通过CD21进入B细胞后复制增殖，产生表面抗原，该过程被机体免疫系统识别，产生特异性CD8+T细胞，杀伤活动性感染B细胞，控制病毒扩增。少数携带静止期感染EBV的B细胞未被T细胞识别杀伤，形成潜伏感染。而当机体初次感染EBV时，会产生强烈的免疫反应，通过大量产生CD8+T细胞，杀伤活动性感染B细胞，形成传染性单核细胞增多症(InfectiousMononucleosis,IM)。而在免疫力低下及缺失的患者中，EBV感染B细胞，T细胞及NK细胞后可介导细胞恶变，促进宿主细胞异常增殖，形成恶性增殖性疾病，如伯基特淋巴瘤(Burkitt’sLymphoma,BL)、霍奇金淋巴瘤(Hodgkin Lymphoma,HL)、原发性中枢神经系统淋巴瘤(Primary central nervous system lymphoma,PCNSL)、T/NK细胞型慢性活动性EBV感染(Chronic active Epstein-Barr virus infection of T/NK-cell type,CAEBV of T/NK-cell type)、噬血细胞性淋巴组织细胞增生症(Hemophagocytie lymphohistiocytosis,HLH)、严重蚊虫叮咬过敏(Severe mosquito bite allergy,SMBA)、种痘水疱病样淋巴组织增生性疾病(Hydroa vacciniforme,HV)等。由于在EBV感染引起疾病初期，机体均有EBV病毒载量增多，淋巴样细胞增生，常规的PCR检测及血液学抗体检测只能判断病人体内总的EBV-DNA载量，难以鉴别EBV感染细胞亚型。目前临床常用的EBV感染细胞亚群鉴定是基于细胞分选技术上的PCR检测或者组织活检，这些方法成本高，仪器要求高，耗时长，难以快速便利的获得实验结果；并且细胞分选会因为感染细胞或者血浆EBV-DNA污染未感染细胞而导致假阳性结果，灵敏度差；组织活检常常不便取材，难以满足临床检测需要。

因此，新型的能快速便捷的鉴定EBV感染细胞亚群的方法亟待进一步研发。

发明内容

鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种鉴别诊断EBV感染细胞亚型的方法，将荧光原位杂交技术(Fluorescence in situ hybridization,FISH)与流式细胞术(Flow cytometry)相结合，建立一种流式-荧光原位杂交(Flow-FISH)方法，通过直接检测患者外周血，快速便利地鉴别EBV感染细胞亚型，为临床诊断提供更好的建议，也为研究EBV发病机制提供新的思路。

为实现上述目的及其他相关目的，本发明第一方面提供一种鉴别诊断EBV感染细胞亚型的方法，包括如下步骤：用荧光标记淋巴细胞特异性抗体对细胞进行染色，然后运用FISH探针特异性识别细胞内EBV感染特征性RNA：EBERs，接着通过流式细胞术检测EBV感染细胞亚群，来鉴别EBV感染的细胞亚型。

进一步，所述方法包括以下步骤：

(1)表面抗体孵育：在细胞中加入荧光标记淋巴细胞特异性抗体，混匀后避光孵育；

(2)细胞固定破膜：向膜染后的细胞中加入固定破膜液，对细胞进行固定破膜；

(3)探针孵育：将EBERs探针与荧光原位杂交液混合后，加入细胞液中，避光孵育；

(4)探针孵育后洗涤：探针孵育结束后，对细胞进行洗涤；

(5)用流式细胞仪进行检测，鉴别EBV感染的细胞亚型。

进一步，所述细胞为外周血单个核细胞(PBMCs)。

进一步，所述外周血单个核细胞(PBMCs)的提取方法为：取新鲜全血，采用聚蔗糖-泛影葡胺(Ficoll-Hypaque)分离法提取得到外周血单个核细胞。

进一步，所述荧光标记淋巴细胞特异性抗体选自anti-CD3-BV421、anti-CD16/56-PE、anti-CD19-APC中的至少一种。进一步，所述EBERs包括EBER1和EBER2，EBER1核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，EBER2核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

进一步，步骤(1)中，每0.5×10⁶～1×10⁶细胞需加入2uL每种抗体。

进一步，步骤(1)中，在室温下进行孵育，孵育时间为30～40min。

进一步，步骤(2)中，所述固定破膜液由PBS缓冲液配制而成，包括多聚甲醛和Tween-20；优选地，所述固定破膜液中多聚甲醛的浓度为4％，Tween-20浓度为0.05～0.2％，更优选为0.2％。

进一步，步骤(2)中，每0.5×10⁶～1×10⁶细胞需加入1mL固定破膜液。

进一步，步骤(2)中，固定破膜液加入细胞中后摇匀，在室温下避光静置10～15min，进行固定破膜。

进一步，步骤(2)中，固定破膜条件为：0.2％的Tween-20溶液，室温，破膜10～15min；优选地，破膜条件为：0.2％的Tween-20溶液，室温，破膜15min。

进一步，所述Tween-20溶液由Tween-20加入多聚甲醛固定液中配制而成；优选地，所述多聚甲醛固定液为4％多聚甲醛固定液。

进一步，步骤(3)中，所述EBERs探针为：四条长度为30-50bp与EBERs RNA互补的被5-FAM标记的寡核苷酸探针混合溶液。

进一步，步骤(3)中，所述荧光原位杂交液20％(wt/vol)甲酰胺和7％(wt/vol)硫酸葡聚糖。

进一步，步骤(3)中，所述荧光原位杂交液由甲酰胺和硫酸葡聚糖加入SSC缓冲液中配制而成；优选地，所述SSC缓冲液为2xSSC缓冲液。

进一步，步骤(3)中，所述EBERs探针与荧光原位杂交液的用量比为0.5～5.0μg/mL。

进一步，步骤(3)中，孵育温度为37℃，孵育时间为14～16h。

进一步，步骤(4)中，在46℃条件下对细胞进行清洗。

进一步，步骤(4)中，洗涤方式为：使用1mL含0.1％Tween-20的4xSSC缓冲液洗涤5min，重复3次；再依次用2xSSC、1xSSC、PBS缓冲液分别洗涤一次，每次5min。

本发明第二方面还提供根据第一方面所述的方法在鉴别诊断EBV感染细胞亚型上的应用。

本发明第三方面提供一种流式-荧光原位杂交固定破膜液，所述固定破膜液由PBS缓冲液配制而成，包括多聚甲醛和Tween-20。

进一步，所述固定破膜液包括0.05～0.2％Tween-20和4％多聚甲醛；优选地，所述固定破膜液包括0.2％Tween-20和4％多聚甲醛。

进一步，所述流式-荧光原位杂交试剂盒用于检测EBER。

本发明第四方面提供一种荧光原位杂交液，包括20％(wt/vol)甲酰胺和7％(wt/vol)硫酸葡聚糖。

进一步，所述荧光原位杂交液由甲酰胺和硫酸葡聚糖加入SSC缓冲液中配制而成。

进一步，所述SSC缓冲液为2xSSC缓冲液。

本发明第五方面提供一种流式-荧光原文杂交试剂盒，包括如第三方面所述的流式-荧光原位杂交破膜液以及如第四方面所述的荧光原位杂交液。

进一步，所述流式-荧光原位杂交试剂盒用于检测EBERs。

本发明第六方面提供如第五方面所述的流式-荧光原文杂交试剂盒在检测EBERs上的应用。

如上所述，本发明的鉴别诊断EBV感染细胞亚型的方法及其应用，具有以下有益效果：

本发明优化了适用于流式细胞术检测胞内RNA用途细胞破膜固定剂，还优化了适用于流式细胞术检测胞内RNA用途荧光原位杂交液，并通过联用流式细胞术(Flowcytometry)与原位荧光杂交术(Fluorescence in situ hybridization,FISH)，建立了一种能够检测临床病人标本中不同亚型淋巴细胞内EBV感染特征性RNA-EBER的实验方法。

本发明采用的细胞固定破膜剂Tween-20可以在很好的维持细胞形态前提下允许探针进入，既不会影响细胞状态也不会影响表面抗原，且破膜效果优于市售破膜剂；荧光原位杂交液可维持血液标本中细胞形态完整；流式荧光标记淋巴细胞特异性抗体能与细胞膜表面抗原决定簇特异性结合，进而保证FISH探针与细胞膜内靶mRNA结合的高灵敏性及高特异性。

本发明是一种新型的无创检测方法，通过Flow-FISH联用技术能直接、快速、便利、可靠地检测和鉴别临床外周血标本中淋巴细胞的EBV感染细胞亚型，具有极高的临床应用价值。

附图说明

图1显示为本发明实施例1中EBV+/EBV-细胞系中EBERs的表达情况。

图2显示为本发明实施例1中Flow-FISH技术对EBV+/EBV-细胞系中EBV感染鉴定结果。

图3显示为本发明实施例1中Flow-FISH技术对临床外周血标本中EBV感染鉴定结果。

图4显示为本发明实施例2中不同破膜剂(TritonX-100、Saponin、Tween-20以及Thermo Fisher成品破膜试剂盒)对细胞形态及抗体结合的影响。

图5显示为本发明实施例2中Saponin对细胞形态及抗体结合的影响。

图6显示为本发明实施例2中不同浓度的Tween-20对细胞形态及抗体结合的影响。

图7显示为本发明实施例2中不同浓度Tween-20对细胞形态及抗体结合的影响。

图8显示为本发明实施例2中经不同浓度Tween-20处理后的细胞在共聚焦显微镜图。

图9显示为本发明实施例3中优化后和传统原位荧光杂交液对细胞形态、抗体结合及探针结合的影响。

具体实施方式

以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。

流式细胞术(Flow cytometry)基于鞘液流技术与荧光光学技术，结合荧光标记抗体，可识别细胞形态特征及表面特异性标志物，以对细胞进行鉴定；其灵敏度高，特异性好，操作简单，可同时对标本中各细胞亚型进行实时鉴定。针对细胞内RNA的细胞荧光原位杂交(Fluorescence in situ hybridization,FISH)，可通过多条针对同一分子的荧光探针，对细胞内的RNA进行原位检测。

通过Flow-FISH联用技术，本发明建立了一种鉴别诊断EBV感染细胞亚型的方法：通过FISH探针特异性识别细胞内EBV感染特征性RNA：EBERs，结合荧光标记淋巴细胞特异性抗体染色，流式细胞术检测EBV感染细胞亚群，鉴别EBV感染的细胞类型。

下面具体的例举实施例以详细说明本发明。同样应理解，以下实施例只用于对本发明进行具体的说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，本领域的技术人员根据本发明的上述内容作出的一些非本质的改进和调整均属于本发明的保护范围。下述示例具体的工艺参数等也仅是合适范围中的一个示例，即本领域技术人员可以通过本文的说明做合适的范围内选择，而并非要限定于下文示例的具体数值。

实施例1

Flow-FISH技术在细胞系及临床患者中的应用

本实施例将流式细胞术与荧光原位杂交结合起来，以EBERs为目的RNA，与EBERs探针进行杂交，同时检测EBERs及表面抗原的表达情况来鉴别感染病毒的细胞亚型。具体实验过程如下：

1、研究对象

本实施例的研究对象为体外培养的EBV阴性和EBV阳性人细胞系，以及临床患者外周血标本。

(1)EBV阴性(EBV-)细胞系：人B淋巴细胞白血病细胞系Sup-B15，人急性T细胞细胞白血病细胞系Molt-4。

EBV阳性(EBV+)细胞系：绒猴EB病毒转化白细胞系B95-8，人Burkitt’s瘤细胞系Raji。

上述细胞系特征及来源如表2所示。

表1.EBV阴性/阳性细胞系特征

细胞	细胞来源	EBV	厂家
				RAJI	人Burkitt’s瘤细胞	+	上海中乔新舟
B95-8	绒猴EB病毒转化白细胞	+	上海中乔新舟
				SUP-B15	人PH+急淋白血病细胞系	-	中国科学院细胞库
MOLT4	人急性淋巴母细胞性白血病细胞	-	中国科学院细胞库

(2)临床患者：于重庆医科大学附属儿童医院招募5名EBV感染患者作为实验组，以及一名EBV-DNA载量低于检测下限(EBV-DNA载量为阴性)的患者作为健康对照组。

在收集入组患者之前，根据EBV-DNA载量值，制定入组标准：EBV-DNA载量高于400；患者疾病由医院儿科医生结合其他临床检验指标进行确认；排除标准：①不愿意加入本研究的患者；②患有免疫缺陷的患者；③信息缺失者；④其他非EBV感染患者。

临床患者的资料收集：收集患者一般情况，包括患者病历号、姓名、性别、EBV-DNA载量值等。上述患者的临床特征如表3所示。

表2.患者的临床特征

临床患者的样本收集：收集到实验组与健康对照组的1～2mL外周血后提取单个核细胞，并立即进行实验。

2、EBERs核苷酸序列

EBER1(SEQ ID NO.1)：

AGGACCTACGCTGCCCTAGAGGTTTTGCTAGGGAGGAGACGTGTGTGGCTGTAGCCACCCGTCCCGGGTACAAGTCCCGGGTGGTGAGGACGGTGTCTGTGGTTGTCTTCCCAGACTCTGCTTTCTGCCGTCTTCGGTCAAGTACCAGCTGGTGGTCCGCATGTTTT。

EBER2(SEQ ID NO.2)：

AGGACAGCCGTTGCCCTAGTGGTTTCGGACACACCGCCAACGCTCAGTGCGGTGCTACCGACCCGAGGTCAAGTCCCGGGGGAGGAGAAGAGAGGCTTCCCGCCTAGAGCATTTGCAAGTCAGGATTCTCTAATCCCTCTGGGAGAAGGGTATTCGGCTTGTCCGCTATTTTT。

EBERs探针：四条长度为30-50bp与EBERs RNA互补的被5-FAM标记的寡核苷酸探针混合溶液。EBERs探针购自于丹麦DAKO公司，货号：Y5200。

3、实验试剂及其配制和处理方法

(1)本实施例实验中所使用的PBS缓冲液均含2％BSA。

(2)固定破膜液：16％多聚甲醛与PBS缓冲液按照1：3的体积比稀释成4％多聚甲醛，加入Tween-20使其浓度为0.2％。

(3)杂交洗液：175.3g NaCl、88.2g柠檬酸钠用超纯水定容到1L，PH调为7.0，再用超纯水将20xSSC稀释到4x、2x、1x，并向4xSSC中加入Tween-20，配制得到含0.1％Tween-20的4xSSC。

(4)荧光原位杂交液：将甲酰胺和硫酸葡聚糖加入2x SSC缓冲液中配制而成，甲酰胺和硫酸葡聚糖浓度分别为20％(wt/vol)、7％(wt/vol)。

(5)EBER PAN Probe/Flourescein为成品试剂盒(Dako-Y5200)。

(6)抗体：anti-CD3-BV421、anti-CD16/56-PE、anti-CD19-APC，均购自于美国Becton,Dickinson and Company。

(7)实验所涉及的试剂均需去酶。

4、实验方法

(1)外周血单个核细胞(PBMCs)的提取：

取1～2mL新鲜全血采用聚蔗糖-泛影葡胺(Ficoll-Hypaque)分离法提取外周血单个核细胞。

(2)表面抗体孵育：

在PBMCs细胞中各加入2uL anti-CD3-BV421、anti-CD16/56-PE、anti-CD19-APC抗体混匀避光室温孵育30～40min。

(3)细胞固定破膜：

将膜染后的细胞加入1mL固定破膜液，摇匀室温避光静置10～15min。

(4)探针孵育：

EBERs探针使用的是商品化探针，为5-FAM标记的寡核苷酸探针，购自于DAKO，加入25uL含探针的杂交液(含30％甲酰胺和10％硫酸葡聚糖)，再加入8uL的2xSSC，将杂交液稀释到原来浓度的70％之后，加入细胞液中，37℃，避光孵育14h～16h。

(5)探针孵育后洗涤：

在46℃条件下对细胞进行清洗，具体为：使用1mL含0.1％Tween-20的4xSSC洗涤5min，重复3次；再依次用2xSSC、1xSSC、PBS分别洗涤一次。

(6)用流式细胞仪检测，对细胞进行分析和分选。

(7)mRNA表达的qRT-PCR检测：

收取5×10⁵～1×10⁶细胞，加入1mL Trizol试剂，吹打细胞沉淀直至细胞完全裂解；然后苯酚/氯仿萃取法提取得到总RNA，逆转录为cDNA；以cDNA为模板，以GAPDH(甘油醛-3-磷酸脱氢酶，glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase)为内参，采用qRT-PCR检测EBER1/EBER2的表达情况。

5、实验结果

(1)表3显示了qRT-PCR检测得到的GAPDH(内参)与EBER1/2(目的)的引物序列。

表3.内参和目的引物序列

(2)EBERs在EBV+/EBV-细胞系中的表达情况如图1所示。图1表明，EBERs特异性表达于EBV+的细胞系。

(3)Flow-FISH对EBV+/EBV-细胞系中EBV感染鉴定结果如图2所示。图2表明，Flow-FISH技术能鉴别EBV+和EBV-细胞系。

(4)Flow-FISH对临床外周血标本中EBV感染鉴定结果如图3所示。图3表明，Flow-FISH技术能很好地鉴别诊断出临床患者外周血单个核细胞(PBMCs)中EBV感染的细胞亚型。

实施例2

正常情况下，荧光标记的探针无法通过完整的细胞膜进入细胞内，用流式细胞仪测定细胞核内RNA，需先利用破膜剂破坏细胞膜的完整性，产生可供探针通过的小孔。破膜效果的好坏将直接影响荧光染色和结果分析。

基于此，参照实施例1的实验方法，本实施例探索了适用于流式-荧光原位杂交的固定破膜剂类型，实验方法及过程如下：

1、通过对不同的破膜剂：0.2％TritonX-100、0.2％Saponin、0.2％Tween-20、以及Thermo Fisher市售成品破膜试剂盒(TritonX-100、Saponin均购自于sigma-aldrich西格玛奥德里奇(上海)贸易有限公司；Tween-20购自于北京索莱宝科技有限公司)进行实验对比。

其中，各破膜剂的工作原理为：

Saponin：选择性与细胞膜胆固醇作用，将胆固醇从细胞膜上移除，从而形成孔洞；但是因为是可逆，所以效果不是很好，并且不能破核膜。

TritonX-100和Tween-20：非选择性，同时与蛋白质、脂质作用形成孔洞，并有可能将蛋白质、脂质从细胞膜上移除；因为为非选择性，可能会导致蛋白和脂质丢失，并且效果强，所以对时间和浓度要求很高。

实验结果如图4和图5所示，将四种破膜剂进行对比，发现0.2％Saponin和0.2％tween-20效果好，对细胞状态影响最小；但是使用0.2％Saponin对外周血单个核细胞进行处理后与EBERs探针进行杂交后发现假阳性情况，可能是因为Saponin为可修复破膜剂，探针进入胞内后不易洗脱掉。因此最后选择Tween-20作为破膜剂。

2、将PBMCs进行膜染后再进行破膜，发现Tween-20对膜染几乎不产生影响。

提取单个核细胞对其表面抗原进行标记，使用含不同浓度(0％、0.1％、0.2％)Tween-20的固定破膜液处理，经流式细胞仪检测发现(如图6所示)，所有浓度的Tween-20均不会对细胞表面抗原产生影响。

3、为了对Tween-20的破膜效力进行验证，采用不同浓度Tween-20以不同时间对PBMCs进行处理，并经流式细胞仪进行检测，具体实验方法为：提取单个核细胞提取对其表面抗原进行标记，使用400uL含不同浓度Tween-20的固定破膜液处理，再加入2uL AnnexinV，室温孵育30min后进行流式细胞仪检测。

实验结果如图7和表4所示。图7中，0％是指含有0％Tween-20，0％是指0％Tween-20，0.05％-15min是指含有0.05％Tween-20处理15min，0.1％-15min是指含有0.1％Tween-20处理15min，0.2％-15min是指含有0.2％Tween-20处理15min

表4.不同浓度Tween-20对荧光强度的影响统计图

由图7和表4可以知晓，经流式细胞仪检测后发现0.2％Tween-20破膜15min后，细胞膜已经可以产生足够的孔允许Annexin V进入胞内，同时在共聚焦显微镜下进行了观察，如图8所示，实验结果表明，以0.2％Tween-20作用15min作为破膜条件，在此条件下能很好的维持细胞形态，以及在基本不对表面抗原造成损伤的同时能允许探针进入。

因此，最终选择以0.2％Tween-20作为破膜剂，4℃破膜10～15min，效果最好，在此条件下细胞整体状态最好，能很好地分群以及便于荧光标记的探针进入。

实施例3

目前市场上没有专门争对流式-荧光原位杂交的试剂盒，都是含有针对传统荧光原位杂交设计的杂交液(包括30％甲酰胺和10％硫酸葡聚糖)，该试剂盒对细胞状态要求不高，为了提高探针荧光强度通常使用高浓度杂交液，但是这对细胞状态影响很大，将其应用在本发明的方法中无法使用流式细胞仪进行检测。因此，本实施例对含有探针的杂交液中主要成分(甲酰胺和硫酸葡聚糖)浓度进行了探索，以找出适用于流式-荧光原位杂交的杂交液浓度。

本实施例采用的杂交液主要成分为甲酰胺和硫酸葡聚糖。其中，甲酰胺降低了核酸链结合的自由能，使杂交在较低温度下进行而不丧失特异性，从而提高了组织结构的保存。硫酸葡聚糖是一种无水葡萄糖聚合物，它在反应中吸收水分子以减少游离水；这迫使探针和目标更紧密地结合在一起，这种效应被称为分子拥挤，它提高了探针和目标的杂交率，同时还能改善荧光信号。

本实施例使用的甲酰胺、硫酸葡聚糖均购自于sigma-aldrich西格玛奥德里奇(上海)贸易有限公司。

为了探索杂交液中两种主要成分(甲酰胺和硫酸葡聚糖)对细胞形态以及探针荧光强度的影响，参照实施例1的实验方法，在对细胞进行膜染之后，用h-18s探针(购自于广州锐博生物技术有限公司)对人PBMCs进行实验，以h-18s探针溶于传统杂交液浓度(30％甲酰胺和10％硫酸葡聚糖)以及优化后杂交液浓度(20％甲酰胺和7％硫酸葡聚糖)，以h-18s探针溶于PBS中作为对照组。

优化后荧光原位杂交液和传统荧光原位杂交液对细胞形态、抗体结合及探针结合的作用如图9所示。图9表明，传统的高浓度杂交液处理后细胞形态被破坏，而优化后的杂交液处理后细胞形态完整，表面抗原完整，杂交效率没有明显降低，优化后杂交液浓度对细胞形态以及表面抗原的影响都很小，能够使用流式细胞仪进行后续检测。

同时，本实施例还对甲酰胺和硫酸葡聚糖对探针荧光的影响进行了探索，以2x柠檬酸钠溶液加h-18s探针为实验对照，以h-18s探针溶于传统杂交液浓度(30％甲酰胺和10％硫酸葡聚糖)以及优化后杂交液浓度(20％甲酰胺和7％硫酸葡聚糖)，使用流式细胞仪检测其h-18s荧光强度，实验结果表明优化后的杂交液也能加强探针荧光强度，适用于流式细胞仪检测；而且，从表5可以看出，优化后杂交液与传统杂交液对荧光强度影响无显著差异。

表5.传统和优化后杂交液对荧光强度影响的统计表

上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。

SEQUENCE LISTING

<110> 重庆医科大学附属儿童医院，上海市儿童医院

<120> 一种鉴别诊断EBV感染细胞亚型的方法及其应用

<130> PYZYK2111239-HZ

<160> 8

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 167

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> EBER1

<400> 1

aggacctacg ctgccctaga ggttttgcta gggaggagac gtgtgtggct gtagccaccc 60

gtcccgggta caagtcccgg gtggtgagga cggtgtctgt ggttgtcttc ccagactctg 120

ctttctgccg tcttcggtca agtaccagct ggtggtccgc atgtttt 167

<210> 2

<211> 173

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> EBER2

<400> 2

aggacagccg ttgccctagt ggtttcggac acaccgccaa cgctcagtgc ggtgctaccg 60

acccgaggtc aagtcccggg ggaggagaag agaggcttcc cgcctagagc atttgcaagt 120

caggattctc taatccctct gggagaaggg tattcggctt gtccgctatt ttt 173

<210> 3

<211> 24

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> GAPDH Forward

<400> 3

cagcgacacc cactcctcca cctt 24

<210> 4

<211> 24

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> GAPDH Reverse

<400> 4

catgaggtcc accaccctgt tgct 24

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> EBER1 Forward

<400> 5

ttgctaggga ggagacgtgt 20

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> EBER1 Reverse

<400> 6

agacaaccac agacaccgtc 20

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> EBER2 Forward

<400> 7

gttgccctag tggtttcgga 20

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> EBER2 Reverse

<400> 8

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Claims

1.一种鉴别诊断EBV感染细胞亚型的方法，其特征在于，包括如下步骤：用荧光标记淋巴细胞特异性抗体对细胞进行染色，然后运用FISH探针特异性识别细胞内EBV感染特征性RNA：EBERs，接着通过流式细胞术检测EBV感染细胞亚群，来鉴别EBV感染的细胞亚型。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述方法包括以下步骤：

(4)探针孵育后洗涤：探针孵育结束后，对细胞进行洗涤；

(5)用流式细胞仪进行检测，鉴别EBV感染的细胞亚型。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述细胞为外周血单个核细胞PBMCs；所述荧光标记淋巴细胞特异性抗体选自anti-CD3-BV421、anti-CD16/56-PE、anti-CD19-APC中的至少一种；

所述EBERs包括EBER1和EBER2，EBER1核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，EBER2核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：步骤(1)中，在室温下进行孵育，孵育时间为30～40min；

和/或，步骤(2)中，所述固定破膜液由PBS缓冲液配制而成，包括多聚甲醛和Tween-20；

和/或，步骤(2)中，固定破膜液加入细胞中后摇匀，在室温下避光静置10～15min，进行固定破膜；

和/或，步骤(3)中，所述EBERs探针包括四条长度为30-50bp与EBERs RNA互补的被5-FAM标记的寡核苷酸探针；

和/或，步骤(3)中，所述荧光原位杂交液包括20％(wt/vol)甲酰胺和7％(wt/vol)硫酸葡聚糖。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述固定破膜液中多聚甲醛的浓度为4％，Tween-20浓度为0.05～0.2％。

6.根据权利要求1～5任一项所述的方法在鉴别诊断EBV感染细胞亚型上的应用。

7.一种流式-荧光原位杂交固定破膜液，其特征在于：所述固定破膜液由PBS缓冲液配制而成，包括多聚甲醛和Tween-20。

8.根据权利要求7所述的流式-荧光原位杂交固定破膜液，其特征在于：所述固定破膜液包括0.05～0.2％Tween-20和4％多聚甲醛。

9.一种荧光原位杂交液，其特征在于：包括20％(wt/vol)甲酰胺和7％(wt/vol)硫酸葡聚糖。

10.一种流式-荧光原文杂交试剂盒，包括如权利要求7～8任一项所述的流式-荧光原位杂交破膜液以及如权利要求9所述的荧光原位杂交液。