TWI399437B - 用於檢測鼻咽癌之免疫聚合酶連鎖反應方法及其套組 - Google Patents

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Description

用於檢測鼻咽癌之免疫聚合酶連鎖反應方法及其套組
本發明係有關於一種用於檢測鼻咽癌之免疫聚合酶連鎖反應方法及其套組，尤其是一種檢測鼻咽癌標記分子之免疫聚合酶連鎖反應之方法及其檢測套組。
隨著醫藥科技進步及國人生活形態的改變，台灣地區主要死因已由急性傳染病轉變為慢性疾病，且由行政院衛生署之統計可知癌症自民國七十一年即躍居國人十大死因之首，其標準化死亡率及發生率也逐年呈現上升趨勢。癌症死亡率如此高的原因是大部分的人在癌症症狀出現後才去就醫，這時多半已是末期，癌細胞早已轉移至全身，此時已不易完全殺死癌細胞，所以癌症若能早期診斷，對於病患的治療與癒後會有莫大的幫助。
癌症篩檢的目的，是希望應用一些快速有效的方法，從人群中篩選出無症狀的早期癌症病人，以達早期治療與控制並防止癌症惡化。篩檢應具備以下特點：如具高靈敏度、安全且易被群眾所接受，其中以靈敏度較為來的重要，因為不具靈敏度的話就不能做為篩選癌症的平台。任何檢測都有它的侷限性，如抽血檢測也可作為癌症的一個參考指標，但篩檢並非診斷，若篩檢結果為陽性，還必須以其他檢查項目(超音波、電腦斷層、切片等功能性檢查)做進一步的診斷與確認。
鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma,簡稱NPC)是華人特有的疾病，也常列名於國人的十大癌症死亡原因之內，是一種普遍的頭頸部癌症，一旦癌細胞增生擴散到其他重要的器官，就會導致病人的死亡。且各年齡層皆有可能罹患，但以四十至五十歲之壯年期為高峰，所以對於病人本身、病人家庭及社會皆造成嚴重影響。從臨床研究發現早期鼻咽癌(I、II期)的五年生存率(89.7%、75.9%)遠比晚期(III、IV期)(51.3%、22.2%)高，所以只要早期發現，早期治療，其治癒率是可以提高的。然而目前，由於民眾缺乏對鼻咽癌防治的知識，且鼻咽癌的早期症狀並無特異性，原發部位又較隱蔽。因此，鼻咽癌的早期診斷率仍不理想。
鼻咽部位於鼻腔後方之顱底和口咽之上方，上面為顱底骨；下通口咽、口腔；前入鼻腔鼻竇；後貼頸部椎骨；左右通往中耳。因為鼻咽部經由豐富之淋巴管與咽後淋巴結及其他頸部淋巴結相通，所以當鼻咽腫瘤逐漸增大或擴展至周圍組織時，將引起下列可能的病徵。(1)鼻部症狀：包括鼻塞、濃鼻涕、惡臭分泌物等，主要是由於鼻咽腫瘤阻塞鼻後孔，鼻腔或因腫瘤潰爛而產生。(2)耳部症狀：如耳閉塞感、耳鳴，甚至聽力障礙之發生。(3)頸部腫塊：為百分之七十以上患者的初發症狀，除少部分患者因淋巴核突然增大或有感染外，大部分患者並無痛楚感覺。(4)頭痛：非特異性之疼痛，尤其是持續、單側性頭痛。(5)神經症狀：鼻咽癌在顱底發生，很容易蔓延到側咽部而引起三叉神經之障礙如面麻、面痛等。若侵入海綿狀竇，則先引起外旋神經障礙，而有複視的症狀發生。(6)其他：如牙關緊閉、體力下降、消瘦等。
因為鼻咽癌的早期症狀十分不明顯，常與感冒、鼻炎等相似，而易被忽略，且症狀也不具特異性。因此大多數病人經醫師診斷後，確定罹患鼻咽癌時，腫瘤已是第三、四期了，此時癌症細胞已擴散到其他重要的器官，所以治療很困難，因此死亡率極高。
鼻咽癌之成因，至今仍不清楚，但大多的研究報告指出，可能與遺傳因子、環境因子、EB病毒感染有密切關係。
(1)遺傳因子：鼻咽癌其發生率有地理上及種族上的差異，以中國東南沿海地區、台灣、新加坡等地較為盛行。即使是移民到歐美地區的華人或後代，其鼻咽癌的發生率還是高於當地白人，這說明了鼻咽癌與遺傳因子的相關性。目前研究發現人類白血球抗原(Human leukocyte antigen,HLA)的類型與鼻咽癌的發生有關係。如果一個人的HLA為A2 B46 DR9 時，罹患鼻咽癌比其他人高2.3倍。
(2)環境因子：從香港的研究中發現，鼻咽癌之發生與香港人習慣以鹹魚餵養小孩有關，因為鹹魚含有較多的亞硝胺(nitrosamine)。台灣之流行病學之研究結果，認為鼻咽癌之發生和工作環境之通氣不良，含有木屑等有關。且最近的研究發現，吸菸愈久者，罹患鼻咽癌的機會愈大。
(3)EB病毒感染：早期由血清學之研究，發現鼻咽癌病人的血清中可偵測到一種名叫Epstein－Barr病毒(EB,EBV)的抗體，因而顯示曾受EB病毒的感染。且近幾年來，利用分子生物學的技術，在大部分鼻咽癌的檢體都可測到EB病毒的DNA、RNA以及EBV蛋白。這些蛋白包括第一型核蛋白抗原(EBNA－1)、第一型潛伏膜蛋白(LMP1)及第二型潛伏膜蛋白(LMP2)的存在。另外，也有研究指出，在鼻咽癌病人的體內，自初發症狀至確實診斷之時間拖得越久者，抗體量越高。腫瘤愈大，抗體量愈高，放射治療後，未再復發者，抗體量偏低；但會復發的病人，抗體量不降低，而復發時，其量可升高。因此更進一步地證實Epstein－Barr病毒和鼻咽癌之密切關係。
由於鼻咽癌是鼻咽部上皮組織的一種惡性腫瘤，因其位置隱密，所以不易早期診斷，其診斷方法：在臨床上若遇到30~50歲有血涕、鼻塞、頭痛、單側性耳鳴耳聾，頸部腫塊等症狀的患者，首先應考慮鼻咽癌的可能性，並積極進行全面檢查。以下為目前臨床會使用之檢查方法，然而現在使用的各種檢測方法均有某種程度之缺點：鼻咽鏡檢查：鼻咽鏡分為兩種，1.常規之鼻後反射鏡，醫師以一面小圓鏡自口腔伸入口咽反射鼻咽之影像而檢查。其優點為：迅速、可立即檢查不需特殊昂貴器材；但也有許多缺點：部份病患因嘔吐反射較強，或因口咽解剖構造狹窄，無法伸入反射鏡。影像為反射影像，解析度較差，無法判定細微變化。2.鼻咽內視鏡，是一種造價昂貴之纖維內視鏡。經由局部麻醉後，醫師由鼻孔伸入直接達到鼻咽腔檢查病變。其優點為：解析度高、不易遺漏細微病變、較少死角，且不因病患的嘔吐反射影響檢查品質，花費時間約5－10分鐘。而缺點有：較費時、費用高，成本約1600元。利用鼻咽鏡可在鼻咽腔頂部或側壁可見局部增生性結節或局部充血、糜爛以及潰瘍、出血、粗糙等，可取活檢體以明確診斷。
活體組織檢查：鼻咽部腫物及頸部腫大的淋巴結均做活體組織檢查，主要是做活體切片檢查(biopsy)，再以顯微鏡進行組織結構和細胞學(architecture and cytology)的形態變異性分析為主。但在切取組織診斷病理時，卻有下列缺點：(a)活體切片屬侵入式檢查，會破壞組織結構，更嚴重者會引起其他副作用。另外，可取得檢體數目有限，取出之組織一旦發生形態及細胞學上的變異，更會造成診斷上的困難；(b)由於許多疾病其病態組織的分布並不均勻，再加上缺少明顯可見的特徵，所以組織取樣時只能隨機取樣。這種單憑視覺引導的組織取樣，卻容易造成明顯的取樣誤差；(c)由於組織病理診斷在結果的詮釋上，會因為病理學家在主觀認定上的不同，而產生稍微不同的結果；(d)組織病理診斷的完成，不僅所需的費用較高而且耗時，因此無法成為一種即時的診斷工具，以便在治療疾病時作為治療成效評估的標準。
鼻咽部脫落細胞學檢查：由鼻咽部作組織刮片或負壓吸引分泌物，塗片檢查癌細胞，陽性率可達70~90%。適用於病變淺表的無症狀的癌前病變或病變範圍不清的早期癌，適用於篩選檢查。然後對陽性及可疑病例再進一步作活檢確診。但60%的口腔早期鱗狀癌變細胞直接突破基底膜向下浸潤，而表層上皮正常，脫落細胞學檢查常呈陰性結果。
X光線檢查：1.提供X光線平片，每例患者均應常規作鼻咽側位照片和顱底照片。觀察鼻咽後頂壁的軟組織陰影，黏膜下浸潤擴張和顱底骨質的破壞情況。2. X線鋇膠漿造影，用鋇膠漿滴入鼻腔內，對黏膜下病變。造影比鼻鏡更清楚，可發現鼻咽鏡下不能發現的較小原發癌和黏膜下浸潤。X線檢查所提供的是各種組織的重疊的印象，圖像的空間分辨率及各組織間的對比度均低於電腦斷層檢查。
電腦斷層檢查(CT)：電腦斷層檢查可顯示鼻咽部小的軟組織隆起，幫助確定活檢方向和部位，有利於早期診斷。對於確定臨床分期以及制定治療方案都極為重要。電腦斷層檢查檢查必須注射顯影劑，可能造成噁心、嘔吐，嚴重的話也可能造成過敏休克致死，另外，其一次檢查的輻射劑量，是胸部X光的3－4倍，超過輻射安全建議量。
EB病毒血清學檢測：癌細胞本身會分泌一些分子，因此可從血液中篩選這些分子，以評估癌症存在與否。進行這項檢驗只要抽血，並無副作用，是目前較方便、迅速及舒適的方法。在傳統上是使用間接螢光染色法(IFA)或酵素免疫分析法(Enzyme－linked immunosorbent assay,ELISA)來檢測EB病毒殼抗原的IgA抗體(IgA/VCA)和早期抗原的IgA抗體(IgA/EA)濃度，文獻指出，前者敏感性高，準確性較低；而後者恰與之相反，但IFA不但操作過程步驟繁複，耗費時間與人力。結果須由醫檢師藉螢光顯微鏡一片一片主觀的判讀，易有相當大的誤差，且無法同時篩檢大量的檢體。
除此之外，由於鼻咽癌多為未分化型的鱗狀上皮細胞癌，極易發生頸部淋巴結轉移和遠處轉移，且遠處轉移又比鼻咽部或頸部淋巴復發更常見，所以往往導致鼻咽癌治療的失敗。當癌症愈末期愈易發生遠處轉移，但一般在診斷或手術前，遠處轉移已進行，只是數量並不多，以目前現有的檢查，甚至更精密的磁振造影和核子醫學掃描，都因靈敏度有限而無法偵測到。且因鼻咽癌原發部位鄰近顱底和其他的重要器官，並沒有足夠的安全範圍可供切除，所以若利用手術是難以將癌細胞切除乾淨，而大都採用放射治療。一旦遠處轉移，目前並無有效治療法，若不治療，患者平均只能存活4至6個月，即使加上化學治療，患者存活時間也只有12個月。要提高治癒率，只有發展更敏感又能早期診斷的偵測方法，期望癌細胞尚侷限於鼻咽部時立即進行治療，此時鼻咽癌的治癒率是相當高的。
目前已有許多研究證實鼻咽癌與EB病毒是有相關性的，例如：在鼻咽癌患者血液中可偵測到EB病毒的抗體含量遠超過一般人，且利用分子生物學技術發現，在鼻咽癌腫瘤細胞中可觀察到EB病毒的DNA、RNA和蛋白存在，所以EB病毒基因或蛋白是可作為偵測鼻咽癌腫瘤標記。篩檢既為早期診斷鼻咽癌的重要手段，因此篩檢的方法應具備簡單、安全、費用低廉且易為群眾接受的特性。
現階段常規應用於鼻咽癌篩檢的指標有EB病毒殼抗原抗體IgA(VCA/IgA)、早期抗原抗體IgA(EA/IgA)，其中VCA/IgA檢測常規使用酵素免疫分析法，其靈敏度可高達約90%。因此，VCA/IgA可作為一個粗篩的指標，但其缺點是與鼻咽癌的特異性較差。反之，EA/IgA與鼻咽癌的特異性較好，但因為其靈敏度較差，所以不適宜作為初篩的方法。
綜上所述，目前各式的檢驗方法均有不同的缺點，亟需開發一種新穎之檢測方法，以期及早發現鼻咽癌而進行治療。
職是之故，本發明鑑於現階段檢測鼻咽癌方法之缺失，提出一種新穎之用於檢測鼻咽癌標記分子之免疫聚合酶連鎖反應方法及其檢測套組。以下為本發明之簡要說明。
本發明係提供一種用於檢測鼻咽癌之免疫聚合酶連鎖反應之方法及其套組，尤其是一種檢測早期鼻咽癌標記分子之免疫聚合酶連鎖反應之方法及其檢測套組，以解決臨床上不易早期檢測鼻咽癌之問題。本發明係結合免疫檢驗法以及聚合酶連鎖反應，以應用於鼻咽癌之早期檢測。
本發明之一目的在於提供一種用於檢測鼻咽癌標記分子之免疫聚合酶連鎖反應之方法，包括：(1)提供一表面固定有複數個標記分子之一基材；(2)提供一待檢測患者之血清，並置於該基材表面反應；(3)加入一反應溶液進行培養，該反應溶液具有生物素標定之對人類抗體專一性之二級抗體；(4)加入一含有一連接分子以及一生物素標定之標的DNA序列之溶液；(5)進行聚合酶連鎖反應；以及(6)偵測標的DNA序列片段是否存在。
依據本發明之一實施例，該鼻咽癌標記分子係為EB病毒分子。
較佳地，該EB病毒分子係為核心抗原(EBNA)、潛伏蛋白(LMP)或早期蛋白(EA)。
較佳地，其中該EB病毒分子係為核心抗原1(EBNA1)。
依據本發明之另一實施例，該基材係為有機或無機基材。
依據本發明之另一實施例，該基材係為玻璃基材。
較佳地，該玻璃基材係經過矽氧烷偶合劑改質。
更佳地，該矽氧烷偶合劑係為γ －環氧丙氧基丙基三甲基矽烷(GPTS)。
依據本發明之另一實施例，該人類抗體係為IgA或IgG。
依據本發明之另一實施例，該人類抗體係為IgA。
依據本發明之另一實施例，該二級抗體係為對人類抗體之山羊抗體。
較佳地，該二級抗體之濃度為0.075至0.5微克/毫升(μ g/ml)。
更佳地，該二級抗體之濃度為0.075至0.25微克/毫升(μ g/ml)。
依據本發明之另一實施例，該連接分子係為鏈黴親合素(streptavidin)。
較佳地，該鏈黴親合素之濃度為1至1000毫微克/毫升(ng/ml)。
更佳地，該鏈黴親合素之濃度為100毫微克/毫升(ng/ml)。
依據本發明之另一實施例，該生物素標定之標的DNA序列之濃度為0.001至1000毫微克/毫升(ng/ml)。
更佳地，該生物素標定之標的DNA序列之濃度為0.1至1毫微克/毫升(ng/ml)。
依據本發明之另一實施例，其中步驟(6)係透過膠體電泳偵測該標的DNA序列片段是否存在。
本發明之另一目的在於提供一種利用如申請專利範圍第1項所述之方法，以偵測早期鼻咽癌標記分子之檢測套組。
本發明係以免疫聚合酶連鎖反應(Immuno－PCR)作為檢測平台，首先在基材上固定上特定的抗原當作鼻咽癌標記分子，例如：早期蛋白(EA)、核心抗原(EBNA)或潛伏膜蛋白(LMP)，這些抗原可捕捉血清中相對應的抗體(anti－EA IgA、anti－EBNA1 IgA或anti－LMP1 IgA)，接下來再加入抗體－DNA複合物與之反應，最後利用PCR將DNA放大，擴增訊號值以提升靈敏度。
EB病毒其基本結構含核樣物、衣殼和囊膜三部分。核樣物含線性DNA，衣殼為由162個殼顆粒組成，囊膜由感染細胞的核膜組成，其上有病毒編碼的膜糖蛋白，有識別淋巴細胞上的EB病毒受體、及與細胞融合等功能。EB病毒喜好侵犯淋巴球，特別是B淋巴球，可促使正常的B細胞轉型為不死的(immortal)淋巴芽球狀細胞株(lymphoblastoid cell lines,LCLs)。除了B細胞，EB病毒也會感染上皮與T細胞，但感染除途徑皆不明確。
當EB病毒感染宿主細胞後會脫去核殼釋出線狀基因體到細胞核內，而線狀的基因體會利用末端重複序列連接成環狀基因體，以兩種途徑進行複製。一為潛伏性感染(latent infection)，病毒遺傳體以環狀游離態(episome)存在，並與細胞同步複製，但此時病毒只表現少數的病毒蛋白，以減少病毒顆粒的產生及被體內免疫系統察覺的危機。另一途徑為溶裂性感染(lytic infection)，病毒遺傳體以滾輪(rolling circle)形式複製，不再受限於細胞週期，此時大量病毒顆粒被製造且病毒基因表現大幅上升，最後造成感染細胞的溶解(lysis)。
一般被感染細胞，包括B淋巴細胞株及鼻咽癌細胞等，大部分是以潛伏感染狀態存在。被病毒感染的細胞具有EB病毒的基本基因組，會表現出11種基因，包括六種核抗原(Epstein－Barr virus nuclear antigen,EBNAs)：EBNA1、EBNA2、EBNA3、EBNA4、EBNA5和EBNA6；三種潛伏膜蛋白(latent membrane protein,LMPs)：LMP1、LMP2A和LMP2B；以及兩種小分子的RNAs(Epstein－Barr virus－encoded RNAs,EBERs)：EBER1和EBER2。鼻咽癌患者之EBNA、膜抗原(Membrane Antigen,MA)、病毒被膜抗原(Virus Capsid Antigen,VCA)、早期蛋白(EA)均產生相應的IgG和IgA抗體，研究這些抗原及其抗體，對闡明EB病毒與鼻咽癌關係及其早期診斷有重要意義。EB病毒的抗原主要是根據不同的表現階段可被分成三類：(1)潛伏期抗原(latent phase antigen)：細胞被感染後在潛伏期所製造出來的抗原，包括核心抗原(EBNAs)和潛伏膜蛋白(LMPs)，潛伏期抗原存在可顯示出EB病毒基因的存在。潛伏期的抗原將提供細胞毒殺T細胞的膜上標靶。
(2)早期抗原(early antigen)：在病毒核酸複製之前合成的病毒蛋白質，稱為早期蛋白，是一種功能性蛋白質，能抑制宿主細胞自身的代謝過程，並提供病毒核酸複製所需要的DNA聚合酶、RNA聚合酶和逆轉錄酶等，並非病毒的結構性蛋白。
(3)晚期抗原(late antigen)：晚期抗原是病毒的結構性蛋白，是EB病毒的外殼(capsid)和莢膜(envelope)的結構蛋白，他們處於病毒複製的細胞中，且大量存在。
EB病毒在感染細胞內所合成的蛋白中，有兩種具致癌潛力的蛋白，一個為潛伏性膜蛋白第一型(LMP1)，另一個為核蛋白第一型(EBNA1)。目前的研究已得知，這兩種蛋白都可影響到細胞的正常功能，成為癌細胞，且不斷的增多。臨床上，在絕大部分的鼻咽癌患者組織內可偵測到上述兩種蛋白。
本發明係結合免疫檢驗法以及聚合酶連鎖反應，應用於鼻咽癌之早期檢測。本發明提供之一種用於檢測鼻咽癌標記分子之免疫聚合酶連鎖反應之方法，係以免疫聚合酶連鎖反應方法作為檢測平台：主要架構為在基材上固定上作為鼻咽癌標記分子之特定抗原，例如：早期蛋白(EA)、核心抗原1(EBNA1)或潛伏膜蛋白1(LMP1)，這些抗原可捕捉患者血清中相對應之抗體(anti－EA IgA、anti－EBNA1 IgA或anti－LMP1 IgA)，接下來再加入二級抗體－DNA複合物與之反應；本發明係使用對抗人類之山羊抗體(anti－human IgA)作為生物素標定之二級抗體，最後利用PCR將DNA片段放大，擴增訊號值以提升靈敏度，可望作為未來鼻咽癌診斷與癒後追蹤之工具。
本發明所提供之用於檢測鼻咽癌標記分子之免疫聚合酶連鎖反應之方法，將可由以下的實施例說明而得到充分瞭解，並使得具有本技術領域之通常知識者可以據以完成之，然本發明之實施型態並不限制於下列實施例中。
實施例一：基材表面活化與改質
因為蛋白質穩定性較差，不易長時間維持其生化活性，且易受實驗條件(溶劑種類、溫度、pH值等)的影響而造成蛋白質構型改變或變性而失去活性，所以需進行基材的化學改質或額外添加試劑，以維持蛋白質結構與其生化活性。依據基材與被固定分子的特性，可選擇適合的固定化方法。其基本步驟為(a)活化基材：基材表面經過化學改質後產生特定官能基，此官能基可與蛋白質產生鍵結。(b)蛋白質固定：蛋白質利用本身胺基酸的官能基(胺基、羧基)與活化後的基材鍵結。
可適用於本發明之基材係包括有機或無機基材，只要其表面可固定生物活性分子即可；本實施例所使用之固體基材為玻璃，其優點是玻璃表面無滲透作用，因此樣品需要量低，但因玻璃表面無適當的化學活性點，如－OH、－NH2 、－COOH等官能基，所具有的官能基化學活性很低，使固定率下降。對於化學惰性的玻璃而言，可用矽氧烷試劑反應，使表面具有各種官能基；本實施例所使用者為γ－環氧丙氧基丙基三甲基矽烷(3－glycidoxypropyltrimethoxysilane,GPTS)，其尾端帶有環氧基，相較於帶有其他官能基的矽氧烷，利用帶有環氧基的矽氧烷改質後的玻璃具有較好的結果，可得到高靈敏性、好的信號－背景比且製備簡易，另外因為帶有高反應性的環氧基，表面不僅可與胺基反應也可以與其他親合性官能基反應。
首先將玻璃基材(例如，玻璃珠)放入酒精中清洗後，浸泡於酸洗液(piranha solution：70% H2 SO4 ＋30% H2 O2 )中進行表面活化(反應1小時)，隨後於超音波中震盪清洗15分鐘，以去離子水清洗，最後以氮氣吹亁。
再將γ－環氧丙氧基丙基三甲基矽烷(GPTS)溶於甲苯中，配製成2.5%的γ－環氧丙氧基丙基三甲基矽烷溶液。
將玻璃基材浸泡於配製好的γ－環氧丙氧基丙基三甲基矽烷溶液中，於60℃反應4小時。反應完成後，於95%酒精中清洗3次，抽亁一晚，再放入烘箱中進行交聯反應，備用。
所製備之改質玻璃基材，可利用水接觸角、原子力顯微鏡與X射線光電子能譜儀等確認玻璃基材是否被改質成功。如靜態接觸角量測玻璃改質前後表面的水接觸角，觀察玻璃表面經由改質過程中其表面性質的變化，發現經過矽氧烷表面修飾的玻璃上，因為表面上有一層有機分子，其碳氫鏈及末端的環氧基極性小於羥基，所以在其上的水滴表面接觸角較大，由此可以間接推知玻璃表面上有機修飾分子的存在。
實施例二：固定標記分子
請參照第1圖，係為本發明之流程示意圖。如步驟101所示，先將50微升(μL)的EBNA1蛋白質(10微克/毫升,μg/mL)加至先前改質之玻璃基材上，於37℃下反應4小時。以緩衝溶液(10 mM Tris,pH 7.3,150 mM NaCl)洗去未結合的抗原及雜質。再依步驟102，加入阻隔液(10 mM Tris/HCl,pH 7.6,6%脫脂奶粉、0.2% NaN3 、0.05% Tween－20以及5 mM EDTA)，於37℃下反應1小時後，以緩衝溶液潤洗。
實施例三：免疫結合反應
參照第1圖步驟103，加入稀釋的待測血清，於37℃下反應1小時。血清中的特異抗體與固定於基材表面之抗原結合，形成固相抗原抗體複合物。經緩衝溶液清洗後，基材上只留下特異性抗體，血清中的其他成份將在清洗過程中被洗去；隨後加入50微升(濃度為0.25 μ g/ml)生物素標記的抗體，於37℃下作用1小時(步驟104)。
再次以緩衝溶液清洗後，加入鏈黴親合素(濃度為100 ng/ml)，於室溫下培育30分鐘(如步驟105所示)。洗滌後，如步驟106所示，加入生物素標定DNA片段(1 ng/ml)，於室溫下作用30分鐘。經徹底清洗，其生物素標定DNA片段的量應與標本中受檢抗體的量成正比。
實施例四：聚合酶連鎖反應
針對本實施例所使用之生物素標定DNA片段，加入SEQ ID NO：1以及SEQ ID NO：2之引子對序列，如待測樣本具有生物素標定DNA片段，經由PCR反應放大後，將得到235鹼基對(base－pair)大小之DNA片段。於PCR試管中加入50微升的50 mM KCl(溶於10 mM Tris/HCl,pH 8.3,1 mM Mg2＋ )、50 μM的dNTP溶液(PCR Master Mix,GeneMark)、各50 pmole之引子對、以及反應完成的玻璃珠，均勻混合後，置入PCR Thermocycler(Corbett Life Science,Australia)進行PCR反應(步驟107)。PCR反應設定為95℃、5分鐘變性(denature)；隨後進行30次的循環，94℃、30秒變性，55℃、30秒降溫接合(annealing)，72℃、30秒延展(extension)；接著以72℃持續反應15分鐘，降溫至4℃備用。
反應完成後，QIAGEN Gel/PCR DNA Fragments Extraction Kit(Qiagen,USA)純化反應產物，並保存於－20℃。以微量吸管取出10微升反應產物，於含有ethidium bromide的1.5%洋菜膠體進行電泳分析(步驟108)。於PCR反應混合物中加入DNA與離子水一起進行反應，以作為正、負對照組；結果係如第2圖所示。
為了比較本發明之方法與傳統免疫偵測反應方法的偵測範圍，將待測血清進行連續稀釋，以評估本發明之方法的偵測能力。一般而言，利用現有之酵素免疫分析法，在血清稀釋至2000倍後，其吸光值就比較不出鼻咽癌患者與正常人間的差異性。第2圖係為本發明之方法來偵測三位鼻咽癌患者的連續稀釋血清，結果顯示三位鼻咽癌患者在血清稀釋1000倍後，就有訊號的產生，且有的患者甚至是稀釋到15000倍仍有訊號的產生，可明顯比較出正常人與病人間的差異性；可知本發明之方法相較於傳統之免疫偵測方法，具有較高之靈敏度。
以上所述僅為本發明之較佳實施例而已，並非用以限定本發明之申請專利範圍；凡其它未脫離本發明所揭示之精神下所完成之等效改變或修飾，均應包含在下述之申請專利範圍內。
101．．．固定標記分子
102．．．阻隔液
103．．．稀釋後檢體
104．．．生物素標定二級抗體
105．．．鏈黴親合素
106．．．生物素標定DNA片段
107．．．PCR
108．．．電泳分析
第1圖係為本發明之檢測鼻咽癌標記分子之免疫聚合酶連鎖反應方法之流程示意圖。
第2圖係為依據本發明之一較佳實施例檢測不同鼻咽癌患者之結果電泳分析圖。
<110> 國立臺灣大學<120> 用於檢測鼻咽癌之免疫聚合酶連鎖反應方法及其套組<160> 2 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> 人工序列<400> 1<210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> 人工序列<400> 1
101．．．固定標記分子
102．．．阻隔液
103．．．稀釋後檢體
104．．．生物素標定二級抗體
105．．．鏈黴親合素
106．．．生物素標定DNA片段
107．．．PCR
108．．．電泳分析

Claims (3)

  1. 一種使用於檢測華人早期鼻咽癌標記分子之鼻咽癌核心抗原1的免疫聚合酶連鎖反應的方法，至少包含：提供一表面固定有50微升核心抗原1(濃度為10微克/毫升)之一改質玻璃基材，該核心抗原1於37℃下反應4小時，其中該改質玻璃基材係經過一γ-環氧丙氧基丙基三甲基矽烷所改質；加入一阻隔液，該阻隔液含有10 mM Tris/HCl、pH 7.6、6%脫脂奶粉、0.2% NaN3 、0.05% Tween-20以及5 mM EDTA等成份；加入一稀釋的待測血清，於37℃下反應1小時；加入一50微升(濃度為0.25微克/毫升)生物素標記的抗體，於37℃下反應1小時；加入一鏈黴親合素(濃度為100微克/毫升)，於一室溫下培育30分鐘；加入一生物素標定一DNA片段(1微克/毫升)，於該室溫下作用30分鐘；加入一SEQ ID NO：1以及一SEQ ID NO：2之引子對序列，以進行一聚合酶連鎖反應；以及透過一電泳分析偵測一標的DNA序列片段是否存在，藉以形成該種用於檢測早期鼻咽癌標記分子之鼻咽癌核心抗原1的該免疫聚合酶連鎖反應的方法。
  2. 如申請專利範圍第1項所述之使用於檢測華人早期鼻咽癌標記分子之鼻咽癌核心抗原1的免疫聚合酶連鎖反應 的方法，其中該核心抗原1更包含潛伏蛋白(LMP)或早期蛋白(EA)。
  3. 一種如申請專利範圍第1項之方法，其係用以偵測早期鼻咽癌標記分子之鼻咽癌核心抗原1。
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盧香吟（指導教授 林峰輝 ），Immuno-PCR 於鼻咽癌早期診斷應用之研究，臺灣大學醫學工程學研究所碩士論文，中文電子學位論文服務20060727公開/國家圖書館20071008編目錄後上架公開。 *

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