CN105543396B - 鼻咽癌游离ebv-dna荧光pcr检测试剂盒及其使用方法 - Google Patents

鼻咽癌游离ebv-dna荧光pcr检测试剂盒及其使用方法 Download PDF

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Abstract

本发明实施例公开了一种鼻咽癌游离EBV‑DNA荧光PCR检测试剂盒及其使用方法，其包括核酸释放剂，标准品，PCR反应液，EBV阳性对照，EBV阴性对照，所述核酸释放剂为Tris‑HCl和/或EDTA，所述标准品为包含EBV‑EBER区域为扩增区域的质粒。本试剂盒采用温和的化学裂解液来裂解测试样本中的核酸(DNA和RNA)，直接加入PCR反应液进行扩增，不需要提取游离EBV‑DNA及离心或其它处理，转变了EBV‑cfDNA检测先需抽提纯化的思维定式，检测范围为5.00E+08copies/mL～5.00E+01copies/mL，检测下限可达50copies/mL，检测结果准确，检测灵敏度高。

Description

鼻咽癌游离EBV-DNA荧光PCR检测试剂盒及其使用方法
技术领域
本发明涉及核酸荧光PCR检测试剂盒，尤其涉及鼻咽癌游离EBV-DNA荧光PCR检测试剂盒及其使用方法，属于鼻咽癌体外诊断领域。
背景技术
鼻咽癌是华南和东南亚的高发肿瘤，具有种族和地域特性，我国主要集中在广东、广西、湖南、福建等华南省份，其发病率高达25/10万/年(25人每10万人每年)，平均死亡率达2.88/10万/年，在头颈部肿瘤中高居首位，严重危害人民生命健康。研究表明EB病毒感染与鼻咽癌密切相关。
EBV是一种疱疹类病毒，在人群的携带率高达90％，人一旦感染后，就可能终身携带，EBV主要感染人上皮细胞和B淋巴细胞。EBV可以通过唾沫传播，其感染途径一般为：首先在口咽部上皮细胞内增殖，然后感染B淋巴细胞。这些被感染的B淋巴细胞大量进入血液循环而造成全身性感染，并可长期潜伏在人体淋巴组织中，当机体免疫功能低下时，潜伏的EBV活化形成复发感染。
目前，针对鼻咽癌的临床诊断主要依靠体格检查、纤维鼻咽镜、鼻咽部CT或MRI，远处转移主要依靠PET/CT、胸腹部CT或胸片、腹部B超、骨扫描等检查手段，但其项目繁多而费用昂贵，普适性较差，在此背景下，实验室诊断成为鼻咽癌诊断重要的组成部分。根据EBV与鼻咽癌的密切关系，检测人体中EBV的存在对鼻咽癌的早期诊断有很大的价值。由于EBV分离培养困难，目前临床一般用免疫学方法和分子生物学两种方法来辅助诊断，采用酶联免疫吸附试验(ELISA)或免疫组化法检测血浆中特异性EBV抗体，用PCR技术对样本中EBV-DNA载量进行检测，以确定EBV的感染。
血浆中游离的细胞外DNA(Cell-free DNA,cfDNA)最早发现于1948年，Mandel等人在健康人和患病个体中均发现了这些游离物质的存在，从而推翻了以往认为只有细胞中才含有遗传物质的观点。1977年，Leon首次发现肿瘤患者血清游离DNA显著高于正常人，由此开辟了游离DNA与恶性肿瘤关系研究的新领域。基于以上认识，结合EB病毒在鼻咽癌病因和发病中的特殊地位，Mutirangura运用巢式PCR技术在既往EB病毒感染的健康患者和确诊鼻咽癌患者的血浆中进行游离EBV-DNA(EBV-cfDNA)检测，前者均呈阴性，而后者血浆中则发现31％的检出率，统计显示，治疗前血浆EBVDNA的浓度与肿瘤细胞凋亡呈统计学正相关，提示血浆EBVDNA主要来源于肿瘤细胞凋亡，该研究首次揭示了外周血游离EBV-DNA和鼻咽癌的关系。chan进一步证实外周血EBV-DNA的10％-90％以82-181bp的小分子片段形式存在，并且这种小片段EBV-DNA占总EBV-DNA的比例与鼻咽癌癌体的大小以及是否复发转移有关，从而认为其成因是肿瘤细胞崩解后基因组DNA发生碎裂，并释放入血。总之，目前的观点认为治疗前外周血游离EBVDNA被认为和肿瘤的坏死、调亡和增殖均相关，可以间接反映体内肿瘤的负荷；治疗后外周血游离EBVDNA与病灶残留、复发或远处转移有关。
随着研究的进步，2013版《头颈部鳞癌综合治疗：中国专家共识》将血浆EBV-DNA载量检测作为鼻咽癌诊断和分期的指标之一。研究表明，鼻咽癌患者血浆EBV-DNA主要以细胞游离DNA(EBV-cfDNA)的形式存在，并且EBV-cfDNA已成为鼻咽癌特异性肿瘤标志物。
国内已有多种基于实时荧光定量PCR技术定量检测EBVDNA的试剂盒，但是都是检测的EBV病毒粒子DNA，而不是EBV-cfDNA，并且这些试剂盒所提供的DNA提取方法主要是煮沸裂解法、酚-氯仿法和膜亲和层析，有很多不足之处：煮沸裂解法要反复加热、容易爆管产生污染；酚-氯仿法是操作繁琐，对于设备和人员操作要求高，低病毒载量的标本检出率低，且所用试剂具有一定的毒性；膜亲和层析法需高速离心，还需要频繁更换离心管，用时长，特异性较差；并且，这种方法对于片段大小在82-181bp的小分子片段，抽提效果不好。扩增区域和探针类型也有差别，这导致现有方法检测灵敏度和特异性欠佳。
虽然荧光实时定量PCR(FQ-PCR)是目前最适合也最常用的检测游离EBV-DNA的手段。然而，该技术定量结果的影响因素众多，包括游离DNA的抽提、目的基因的选取、引物和探针的设计，PCR设备、预混酶试剂的成分、循环数、标准品的选择等多个方面，需要将各个影响因素进行优化，以达到最佳的检测效果。
发明内容
本发明的目的在于解决现有EBV荧光定量PCR检测试剂盒的缺陷，提供一种操作快速、方法简便、检测灵敏度高的EBV-cfDNA荧光定量PCR检测试剂盒，应用该试剂盒，可以对血清和/或血浆样品中的EBV-cfDNA进行快速检测，为鼻咽癌的诊断和治疗疗效观察提供参考依据。
本发明实施例中提供了一种鼻咽癌游离EBV-DNA(EBV-cfDNA)荧光PCR检测试剂盒，包括以下各组分：核酸释放剂，标准品，PCR反应液，EBV阳性对照以及EBV阴性对照，其中，所述核酸释放剂为Tris-HCl和/或EDTA，其中Tris-HCl浓度为0.8mol/L～1.2mol/L，EDTA浓度为0.1mol/L～1.0mol/L；
所述标准品为包含EBV-EBER区域为扩增区域的质粒，其中，所述质粒的浓度为5.00E+07copies/mL～5.00E+04copies/mL。
优选的，上述的检测试剂盒，其中，所述PCR反应液包括用于扩增靶多核苷酸的上下游引物，以及用于靶多核苷酸检测的探针，其中，所述用于靶多核苷酸扩增的上下游引物及用于靶多核苷酸检测的探针的碱基对序列分别为：
上游引物：5'-GAGAGGCTTCCCGCCTAGA-3'；
下游引物：5'-AAATAGCGGACAAGCCGAATA-3'；
探针：5'FAM-TCTCCCAGAGGGATTAGA-BHQ13'。
优选的，上述的检测试剂盒，其中，所述用于靶多核苷酸扩增的上下游引物以及用于靶多核苷酸检测的探针的浓度分别为0.2μmol/L～0.4μmol/L和0.2μmol/L～0.4μmol/L。
优选的，上述的检测试剂盒，其中，所述PCR反应液还包括5×PCR反应缓冲液，0.8mmol/L脱氧核糖核苷三磷酸，5U/μL～8U/μL Tth DNA聚合酶和1U/μL～7U/μL H-TaqDNA聚合酶。
优选的，上述的检测试剂盒，其中，所述标准品的浓度为5.00E+04copies/mL，5.00E+05copies/mL，5.00E+06copies/mL和/或5.00E+07copies/mL。
优选的，上述的检测试剂盒，其中，所述EBV阳性对照为阴性血清稀释的B958细胞的培养上清，其浓度为1.00～5.00E+05copies/mL。
优选的，上述的检测试剂盒，其中，所述EBV阴性对照为阴性血清。
本发明实施例中还提供了使用上述的检测试剂盒用于检测样本中游离EBV-DNA的方法，其包括如下步骤：
(1)制备待测样本
制备血浆样本：选用EDTA抗凝全血，于抽血后1.5～2.5小时内在1800～2200rpm/min的条件下离心2～4分钟，吸取上清，并移至干净EP管中，在18000～22000rpm/min条件下高速离心8～12分钟去除细胞碎片，随后将上清转移于一新的EP管中备用；和/或
制备血清样本：选用新抽取的静脉血，常温放置25～35分钟后，于1800～2000rpm/min条件下离心2～4分钟，吸取上清，并移至干净EP管中备用；
(2)处理样本和配置PCR反应体系
(a)取6μL～8μL核酸释放剂和8μL～12μL步骤(1)中制备的待测样本，充分混合均匀，于室温放置3～5分钟，备用；
(b)分别取6μL～8μL核酸释放剂和6μL～10ul阴性对照，6μL～8μL核酸释放剂和6μL～10μL阳性对照以及6μL～10μL核酸释放剂和6μL～10μL标准品，充分混合均匀，于室温放置3～5分钟，备用；
(c)根据待测样本，阴性对照，阳性对照和标准品的数量，配置PCR反应液，其中，PCR反应液包括5×PCR反应缓冲液，0.8mmol/L脱氧核糖核苷三磷酸，5U/μL～8U/μL TthDNA聚合酶，1U/μL～7U/μL H-Taq DNA聚合酶，0.2μmol/L～0.4μmol/L用于扩增靶多核苷酸的上游引物以及下游引物，0.2μmol/L～0.4μmol/L用于靶多核苷酸检测的探针，其中PCR反应缓冲液包括Tris-HCl，其浓度为100mmol/L，pH8，KCl，其浓度为15mmol/L，以及MgCl2，其浓度为15mmol/L；
随后将处理好的待测样本，阴性对照，阳性对照和标准品以及PCR反应缓冲液分别加入到PCR反应板的各孔中，盖好封膜，于1000-3000rpm/min条件下离心1-3分钟，备用；
(3)荧光PCR反应与结果分析
(a)将步骤(2)制备的PCR反应板放入荧光定量PCR扩增仪的样品槽，并且按对应顺序设置待测样本名称及定量标准品浓度；
(b)选择FAM通道(Reporter:FAM,Quencher:None)为荧光检测通道，反应结束后，利用仪器自带的软件进行自动分析或者手动调节基线的开始值、结束值以及阈值线值进行分析，然后记录样本Ct值(即cycle time，指PCR反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数值)结果，根据各样本Ct值大小，判断检测结果。
鼻咽癌患者血浆中的游离EBV-DNA(EBV-cfDNA)存在于囊泡中，这些囊泡是类似细胞膜状的脂质状物质，并且直径大小在50-150nm内，通常将这些囊泡称为外泌体(exsome)。由于这种囊泡不具有EBV病毒粒子的核衣壳，所以直接使用核酸裂解剂就可以破坏其结构，使游离EBV-DNA(EBV-cfDNA)释放出来，同时由于本发明的核酸裂解剂不能破坏完整EBV病毒的核衣壳，不能获得常规的EBV病毒粒子DNA，因此可以只检测到游离的EBV-DNA，而不是病毒粒子中的EBVDA。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
(1)本发明采用温和的化学裂解液来裂解测试样本中的核酸(DNA和RNA)，不需提取游离EBV-DNA以及离心和/或其它处理，而是直接加入PCR反应液进行扩增，转变了cfDNA检测先需抽提纯化的思维定式，并且操作简便，检测结果准确；
(2)本发明采用保守区域的碱基序列作为引物和探针，特异性强；本发明试剂盒对游离EBV-DNA检测范围为5.00E+08copies/mL～5.00E+01copies/mL，检测下限可达50copies/mL，检测灵敏度高；
(3)鼻咽癌患者血浆EBV-DNA主要以EBV-cfDNA形式存在，应用该试剂盒，可以对血清、血浆样品中的EBV-cfDNA进行快速检测，并且方法简便、检测灵敏度高，为鼻咽癌的诊断和治疗疗效观察提供依据，同时能够高度预测疾病状态。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1.标准品EBV-cfDNA荧光定量PCR检测结果图；
图2.60例鼻咽癌患者血浆EBV-cfDNA荧光定量PCR检测结果图；
图3.EBV-cfDNA梯度稀释试验EBV-cfDNA荧光定量PCR检测结果图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整的描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
本实施例中提供了一种鼻咽癌游离EBV-DNA(EBV-cfDNA)荧光PCR检测试剂盒，包括以下各组分：核酸释放剂，标准品，PCR反应液，EBV阳性对照以及EBV阴性对照，其中，所述核酸释放剂为Tris-HCl和/或EDTA，其中Tris-HCl浓度为0.8mol/L～1.2mol/L，EDTA浓度为0.1mol/L～1.0mol/L；
所述标准品为包含EBV-EBER区域为扩增区域的质粒，所示质粒的浓度为5.00E+04copies/mL，5.00E+05copies/mL，5.00E+06copies/mL和/或5.00E+07copies/mL。
所述PCR反应液包括用于扩增靶多核苷酸的上下游引物，以及用于靶多核苷酸检测的探针，其中，所述用于靶多核苷酸扩增的上下游引物及用于靶多核苷酸检测的探针的碱基对序列分别为：
上游引物：5'-GAGAGGCTTCCCGCCTAGA-3'；
下游引物：5'-AAATAGCGGACAAGCCGAATA-3'；
探针：5'FAM-TCTCCCAGAGGGATTAGA-BHQ13'。
所述用于靶多核苷酸扩增的上下游引物以及用于靶多核苷酸检测的探针的浓度分别为0.2μmol/L～0.4μmol/L和0.2μmol/L～0.4μmol/L。
所述PCR反应液还包括5×PCR反应缓冲液，0.8mmol/L脱氧核糖核苷三磷酸，5U/μL～8U/μL Tth DNA聚合酶和1U/μL～7U/μL H-Taq DNA聚合酶。
所述EBV阳性对照为阴性血清稀释的B958细胞的培养上清，其浓度为1.00～5.00E+05copies/mL。
所述EBV阴性对照为阴性血清。
将浓度为5.56E+08copies/mL的标准品按照10倍倍比稀释到5.56E+01copies/mL，稀释八个梯度，并以此八个标准品样本作为定量参考品进行试验。
(1)制备待测样本
制备血浆样本：选用EDTA抗凝全血，于抽血后2小时内在2000rpm/min的条件下离心3分钟，吸取上清，并移至干净EP管中，在20000rpm/min条件下高速离心10分钟去除细胞碎片，随后将上清转移于一新的EP管中备用；和/或
制备血清样本：选用新抽取的静脉血，常温放置30分钟后，于2000rpm/min条件下离心3分钟，吸取上清，并移至干净EP管中备用；
(2)处理样本和配置PCR反应体系
(a)取6μL～8μL核酸释放剂和8μL～12μL步骤(1)中制备的待测样本，充分混合均匀，于室温放置3～5分钟，备用；
(b)分别取6μL～8μL核酸释放剂和6μL～10ul阴性对照，6μL～8μL核酸释放剂和6μL～10μL阳性对照以及6μL～10μL核酸释放剂和6μL～10μL标准品，充分混合均匀，于室温放置3～5分钟，备用；
(c)根据待测样本，阴性对照，阳性对照和标准品样本的数量，配置PCR反应液，其中，PCR反应液包括5×PCR反应缓冲液，0.8mmol/L脱氧核糖核苷三磷酸，5U/μL～8U/μL TthDNA聚合酶，1U/μL～7U/μL H-Taq DNA聚合酶，0.2μmol/L～0.4μmol/L用于扩增靶多核苷酸的上游引物以及下游引物，0.2μmol/L～0.4μmol/L用于靶多核苷酸检测的探针，其中PCR反应缓冲液包括Tris-HCl，其浓度为100mmol/L，pH8，KCl，其浓度为15mmol/L，以及MgCl2，其浓度为15mmol/L；
随后将处理好的待测样本，阴性对照，阳性对照和标准品以及PCR反应缓冲液分别加入到PCR反应板的各孔中，盖好封膜，于1000-3000rpm/min条件下离心1-3分钟，备用；
(3)荧光PCR反应与结果分析
(a)将步骤(2)制备的PCR反应板放入荧光定量PCR扩增仪的样品槽，并且按对应顺序设置待测样本名称及定量标准品浓度；
(b)选择FAM通道(Reporter:FAM,Quencher:None)为荧光检测通道，反应结束后，利用仪器自带的软件进行自动分析或者手动调节基线的开始值、结束值以及阈值线值进行分析，然后记录样本Ct值结果，根据各样本Ct值大小，判断检测结果。
荧光定量PCR反应条件为：
每个样本的Ct值与该样本的起始EBV-cfDNA载量的对数存在线性关系，起始载量越多，Ct值越小。利用已知起始载量的标准品可作出标准曲线，其中横坐标代表起始载量的对数，纵坐标是Ct值。因此，只要获得未知样品的Ct值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始载量。标准品曲线的扩增效率应该≥1.90，回归系数r2≥0.95，阴性对照Ct值为0，阳性对照值在1.00～5.00E+05copies/ml范围内，同时满足以上4个条件时，实验结果才有效。如果检测到的样本的起始EBV-cfDNA载量大于等于50copies/ml，则判断为鼻咽癌阳性，小于50copies/ml判断为鼻咽癌阴性。以上任何一个条件没有达到时，实验结果无效，重新检测。
每个浓度按照标准品处理方法处理后平行检测三次，取平均值作为实测值。以实测值的LOG10为纵坐标，理论值的LOG10为横坐标，进行线性相关分析，结果如图3所示，相关测试数据结果如下表1所示。
表1.EBV-cfDNA梯度稀释试验数据表
由表1以及图3可知，回归系数r2＝0.9985，斜率b＝1.043，在0.95～1.05范围内，截距a＝-0.195，a与8.745比较，可忽略，趋于0，则可直接判断本检测方法的检测线性范围为5.00E+08copies/mL～5.00E+01copies/mL，检测下限可达50copies/mL。
实施例2
本实施例提供一种鼻咽癌游离EBV-DNA(EBV-cfDNA)荧光PCR检测试剂盒，其组成同实施例1的试剂盒相同，用于检测已经确诊但还没有治疗的非角化型鼻咽癌患者血浆。
选择60例经病理活检为非角化型鼻咽癌患者，在放射治疗前采集EDTA-K2抗凝静脉血5ml，2小时内2000rpm/min离心3分钟，吸取1.5mL血浆于干净EP管中，高速20000rpm/min离心10分钟去除细胞碎片，转移上清于一新的EP管中备用；同样选择40份健康体检者血浆样本作对照。检测步骤和方法与实施例1相同。
血浆EBV-DNA定量结果按公式换算：C＝Q×(VDNA/VPCR)×(1/VEXT)，其中C为待测血浆EBVDNA浓度(拷贝/ml)，Q为PCR反应得到的EBVDNA浓度，VDNA为血浆抽提得到的DNA最终稀释量，VPCR为加入反应体系的点样量，VEXT为抽提DNA所用血浆体积。
检测结果如图1和图2所示，60例非角化型鼻咽癌患者血浆EBV-cfDNA载量为2.15E+03copies/ml(中位数)，检出率为100％，健康对照血浆EBV-cfDNA载量为0copies/ml(中位数)检出率为0％，说明该试剂盒具有良好的特异性以及具有很高的准确性。
实施例3
本实施例提供一种鼻咽癌游离EBV-DNA(EBV-cfDNA)荧光PCR检测试剂盒，其组成同实施例1的试剂盒相同，检测步骤和方法也与实施例1相同，对正常人血浆或血清样本，和/或HAV、HBV、HCV、HEV、HIV-1、HCMV感染患者样本进行游离EBV-DNA(EBV-cfDNA)检测。
选择非鼻咽癌患者血浆样本100例，包括正常体检者血浆样本40例，非鼻咽癌的HAV、HBV、HCV、HEV、HIV-1、HCMV感染样本各10例，结果均未检出游离EBV-DNA(EBV-cfDNA)，检测结果均为阴性，阴性符合率为100％，说明该试剂盒具有良好的特异性以及具有很高的准确性。
综上分析可知，本发明提供的鼻咽癌游离EBV-DNA(EBV-cfDNA)荧光PCR检测试剂盒仅能检测出EBV-cfDNA，而不能检测出其他病原体RNA，并且检测灵敏度、准确度和稳定性高，检测灵敏度可达50copie/mL，检测范围为5.00E+08copies/mL～5.00E+01copies/mL，为诊鼻咽癌提供可靠的实验证据。

Claims (1)

1.一种EDTA在制备囊泡核酸释放剂中的应用，其特征在于，所述囊泡核酸释放剂为EDTA；或者所述囊泡核酸释放剂为Tris-HCl和EDTA，其中Tris-HCl浓度为0.8mol/L～1.2mol/L，EDTA浓度为0.1mol/L～1.0mol/L，所述囊泡核酸释放剂用于鼻咽癌游离EBV-DNA核酸的释放。
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