CN103642945B - 一种含内参照的高灵敏Epstein-Barr病毒荧光定量PCR试剂盒 - Google Patents
一种含内参照的高灵敏Epstein-Barr病毒荧光定量PCR试剂盒 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及一种利用荧光PCR技术定量检测Epstein‑Barr病毒（EBV）核酸的试剂盒。它采用一对引物扩增EBV特异性核酸序列，并通过荧光探针定量检测EBV DNA；同时用人内源性基因特异性引物和荧光探针检测内参照DNA。本发明通过单管双波长荧光PCR技术同时检测EBV和内参照核酸的存在，能定量检测全血、血浆、鼻咽分泌物样品中EBV DNA，通过内参照核酸的检测结果判断样品是否存在PCR抑制剂或检测误操作引起的模板丢失。试剂盒操作简便快速、定量结果灵敏准确，可广泛应用于临床EBV病毒感染的定量检测。
Description
技术领域
本发明涉及一种含内参照的Epstein-Barr病毒（EBV）单管双波长荧光定量PCR检测试剂盒。
背景技术
Epstein-Barr 病毒（ EBV）是英国病毒学家于1964年从Burkitt淋巴瘤细胞系中分离到的病毒，为疱疹病毒科嗜淋巴细胞病毒属的DNA病毒。它在人群中具有广泛的传染性，传播途径主要为唾液，也可经输血传染，大多数人的初次感染发生在幼儿时期，且多数感染后无明显症状，或引起轻症咽炎和上呼吸道感染，但终生携带病毒，据研究95% 以上成人有该病毒携带。本病毒是传染性单核细胞增多症的病原，尤为重要的是，由于它与在我国南方发病率相当高的鼻咽癌以及非洲儿童淋巴瘤、的发生有密切的相关性，被列为可能致癌的人类肿瘤病毒之一。当机体免疫功能低下时，潜伏在体内淋巴组织中的EBV再度活跃而形成复发感染，临床症状以发热、咽喉痛、肝脾和淋巴结肿大、外周血淋巴细胞增多并出现单核样异型淋巴细胞等为其特征。由于其症状、体征的多样化和不典型病例在临床上逐渐增多，给诊断治疗带来一定困难。因此，准确的检测EBV感染，以区别其它感染原因(巨细胞病毒、腺病毒、肺炎支原体、风疹病毒均可有类似症状)所致疾病，就显得非常重要。
目前临床上检测EBV的方法有病毒分离、血清学试验、抗体检测、荧光定量PCR等。对于EBV急性感染如传染性单核细胞增多症，最早出现于临床标本中的是病原体本身，采用实时荧光PCR进行检测全血、血浆等类型标本，可以在感染的早期明确病因，相对其它检测方法具有检测窗口期短的优势；对鼻咽癌患者样本进行荧光PCR检测还能对病毒核酸进行定量分析，具有检测灵敏度高、特异性强的优点（Jebbink J et al, J Mol Diagn, 2003，5：15-20；曹素梅等，癌症，2002，21：328-329）。 但是目前用于EBV荧光定量检测的方法均没有使用内参照监控核酸提取扩增中可能的PCR抑制物（Hill CE et al，Am J Clin Pathol，2006，125：665-67；刘涤瑕等，现代检验医学杂志，2009，24：93-95；专利CN201110165106、CN201110373390、CN201110177104），当全血、血浆或鼻咽拭子中的PCR抑制物带入扩增反应检测时，容易造成病毒核酸定量结果不准备甚至出现“假阴性”现象，影响病毒感染后的药物治疗。
发明内容
本发明提供一种单管检测Epstein-Barr病毒（EBV）核酸的荧光定量PCR试剂盒，其特征在于，所述试剂盒反应体系同时采用一对EBV特异性引物和荧光探针、一对内参照特异性引物和荧光探针，EBV上下游引物具有SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2的序列，EBV荧光探针具有SEQ ID NO：3序列且其5’端标记FAM荧光基团；内参照上下游引物具有SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：5的序列，内参照荧光探针具有SEQ ID NO：6序列且其5’端标记HEX或JOE或VIC荧光基团；上述引物探针序列也可以是和上述序列同源性大于85%以上的序列。本发明引入的内参照可以用于监控PCR扩增中可能的反应抑制物或从提取到或者全过程的误操作，可通过稀释提取的模板或改进样本处理方法复检获得正确结果，从而避免检测结果出现假阴性的作用，确定样本是否存在EBV病毒核酸和准确载量，适合临床推广使用。
技术方案
通过对GenBank中EBV病毒和人内源性管家（House-keeping）基因序列查询，用Vector NTI、Oligo等软件对各种来源的基因序列进行比对设计，按照TaqMan荧光PCR设计的原则，优选了一对EBV特异性引物和荧光探针扩增EBV中高度保守、多拷贝重复基因（BamHI-W）上的115bp片段，一对人GAPDH（Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase）基因特异性引物和荧光探针扩增其保守区域144bp片段，6条引物和探针核苷酸序列（5’ ->3’）如下：
EBV上游引物：CCCATAgACTCCCATgTAAgC，序列记为SEQ ID NO：1。
EBV下游引物：CCCTggACATCTggACAAAg ，序列记为SEQ ID NO：2。
EBV荧光探针：CgAgTAggTgCCTCCAgAgCC ，序列记为SEQ ID NO：3，其中探针5’端标记FAM（6-carboxy-fluorescein）荧光基团、3’端标记TAMRA（5-Carboxy-tetramethyl-rhodamine）或BHQ-1（Black hole quencher 1）淬灭基团。
内参照上游引物：TgCTTTTAACTCTggTAAAgTgg ，序列记为SEQ ID NO：4。
内参照下游引物：ATgACAAgCTTCCCgTTCTC ，序列记为SEQ ID NO：5。
内参照荧光探针：TTgTTgCCATCAATgACCCCTTCA，序列记为SEQ ID NO：6，其中探针5’端标记JOE（5-dichloro-dimethoxy-fluorescein）或HEX（5-hexachloro-fluorescein）或VIC荧光基团、3’端标记TAMRA或BHQ-1淬灭基团。
EBV检测靶序列选择病毒基因组中的多拷贝重复序列基因，有利于提高试剂盒检测灵敏度；上述引物探针序列也可以是和上述序列同源性大于85%以上的序列。
所述扩增反应体系各成分组成如下：10mM Tris-HCl（pH8.3）、50mM KCl、0.2mMdNTPs、1.5～5 mM MgCl2、各0.1～0.5μM EBV和内参照引物和荧光探针（SEQ ID NO：1～6）、1～5 U Taq DNA聚合酶和0.01～1 U UNG酶，提取的模板10μl，总反应体积30μl。更具体的，扩增反应液各成分终浓度为：Tris-HCl（pH8.3）10 mM、KCl 50 mM、dATP、dGTP、dCTP、dUTP各0.2 mM、MgCl2 3.5 mM、EBV引物和荧光探针各0.3 μM、内参照引物和荧光探针各0.15 μM、Taq DNA聚合酶2 U、UNG酶0.5 U。
所述EBV荧光定量PCR试剂盒使用扩增程序如下：50℃ 2min、94℃ 5min后按照94℃ 10sec、60℃ 45sec循环扩增45次，循环步骤中60℃时采集FAM和JOE波长荧光信号。
所述EBV荧光定量PCR试剂盒包括1个阴性对照、5个线性梯度浓度的EBV核酸定量校准品，5个校准品EBV浓度分别为2.0x107 copy/ml、2.0x106 copy/ml、2.0x105 copy/ml、2.0x104 copy/ml、2.0x103 copy/ml，校准品为含有EBV病毒扩增片段的人工构建培养的假病毒，这5个呈浓度梯度的校准品在使用时用于制备EBV DNA定量标准曲线。
所述EBV荧光定量PCR试剂盒还包括基于磁珠法核酸梯度的病毒DNA提取试剂，在核酸提取仪上实现样本核酸自动化提取。
通过上述设计优选获得的一对EBV引物和荧光探针、一对内参照引物和荧光探针，本发明提供了实时荧光定量PCR检测的试剂盒，优化了PCR反应体系和扩增程序。当然本研究领域技术人员根据荧光PCR的一般要求可以调整PCR反应体系和程序，也同样能实现检测的目的。
有益效果
本发明根据上述设计的引物探针和技术方案，通过优化反应体系和扩增条件研制成EBV核酸荧光PCR定量检测试剂盒，其主要特点如下：
（1）设计的EBV引物探针检测病毒中的多拷贝重复序列基因，提高了试剂盒检测灵敏度。
（2）引入的内参照能监控反应体系中是否存在因PCR抑制物等引起的假阴性，可以避免检测结果不准确造成的误诊。
（3）试剂盒使用了非竞争性内参，EBV和内参照基因序列特异、两种荧光探针采用不同荧光基团标记，荧光信号之间不会相互干扰，保证了检测特异性。
（4）扩增体系中的dUTP－UNG酶系统更进一步避免了因扩增产物污染导致的结果假阳性。
（5）试剂盒采用磁珠法自动化提取样本核酸、单管同时检测EBV和内参照，操作简便快速，可在2小时内报告检测结果。
试剂盒的上述特点，均为采用特异性设计的EBV和内参照引物探针并与荧光PCR技术组合应用而直接引起。从原理上说，本发明试剂盒在EBV病原体临床样本检测中通过对实时荧光PCR扩增两个通道荧光信号的分析，判断EBV核酸特异性片段的存在和病毒载量，本发明的技术方案设计合理，可以广泛应用于临床EBV病毒感染的定量检测。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以通过技术常识对本发明作各种技术性改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
实施例1：EBV核酸荧光PCR定量检测试剂盒引物探针的设计
根据NCBI GenBank数据库中查询的EBV、GAPDH基因序列，采用Vector NTI、Oligo等引物设计软件，优选获得的引物探针序列如表1所示，EBV引物扩增的是该病毒BamHI-W基因上115bp片段、内参照引物扩增的是人GAPDH基因上的144bp片段。
表1 设计的试剂盒EBV和内参照检测引物探针
以上引物探针委托上海生工生物工程技术服务有限公司合成。
实施例2：EBV核酸荧光PCR定量检测试剂盒配制
试剂盒反应缓冲液为自行配制，按表2各组分浓度和体积配制32人份试剂盒反应缓冲液，配制的反应缓冲液每个反应分装用量为20μl，加入模板10μl后总反应体积为30μl。
表2 试剂盒反应缓冲液配制各组分体积
| 组分 | 初始浓度 | 反应终浓度（30μl） | 32人份体积（μl） |
| Tris-HCl(pH8.3) | 1000mM | 10mM | 9.6 |
| KCl | 500mM | 50mM | 96 |
| dATP | 100mM | 0.2mM | 1.92 |
| dGTP | 100mM | 0.2mM | 1.92 |
| dCTP | 100mM | 0.2mM | 1.92 |
| dUTP | 100mM | 0.2mM | 1.92 |
| MgCl<sub>2</sub> | 50mM | 3.5mM | 67.2 |
| EBV上游引物 | 10μM | 0.3μM | 28.8 |
| EBV下游引物 | 10μM | 0.3μM | 28.8 |
| EBV荧光探针 | 10μM | 0.3μM | 28.8 |
| 内参照上游引物 | 5μM | 0.15μM | 28.8 |
| 内参照下游引物 | 5μM | 0.15μM | 28.8 |
| 内参照荧光探针 | 5μM | 0.15μM | 28.8 |
| Taq酶 | 5U/μl | 2U/反应 | 12.8 |
| UNG酶 | 1U/μl | 0.5U/反应 | 16 |
| 水 | -- | -- | 257.92 |
| 总体积 | -- | -- | 640 |
试剂盒阴性对照采用正常人阴性血浆，5个定量标准品为含有EBV扩增片段的人工构建培养假病毒，培养灭活后的假病毒浓度为2x109 copy/ml，用正常人阴性血浆稀释到5个浓度作为试剂盒定量校准品：2.0x107 copy/ml、2.0x106 copy/ml、2.0x105 copy/ml、2.0x104 copy/ml、2.0x103 copy/ml。
试剂盒病毒DNA提取试剂采用上海星耀医学科技发展有限公司生产的磁珠法病毒DNA提取试剂盒，它包括磁珠、裂解液、蛋白酶K、清洗缓冲液、洗脱缓冲液5个组分，使用时试剂盒阴性对照、定量校准品、标本均采用该试剂盒提取核酸。
试剂盒扩增程序为：50℃ 2min、94℃ 5min后按照94℃ 10sec、60℃ 45sec循环扩增45次，循环步骤中60℃时采集FAM和JOE通道荧光信号。
通过上述配制的EBV核酸荧光PCR定量检测试剂盒包括三部分：病毒DNA提取部分（上海星耀医学科技发展有限公司，室温保存和运输）、核酸扩增部分（反应缓冲液，-20℃保存和运输）与质控品部分（1个阴性对照与5个定量校准品，-20℃保存和运输）。
实施例3：试剂盒检测灵敏度的测定
（1）EBV DNA提取
取经临床鉴定、浓度已知的EBV病毒阳性血浆（5x104 copy/ml），采用正常人阴性血浆10倍连续梯度稀释到5x103 copy/ml、5x102 copy/ml、5x101 copy/ml，吸取上述病毒稀释液、试剂盒阴性对照、5个定量校准品各400μl，一起采用实施例2中的磁珠法病毒DNA提取试剂在核酸提取仪上进行病毒DNA提取，最后每个样品获得的核酸各50 μl。
（2）荧光PCR检测
将实施例2中试剂盒扩增部分（反应缓冲液）从-20℃冰箱取出冻融、混匀、短暂离心，按20μl/人份将反应缓冲液分装到PCR反应管中，然后分别加入上述提取的试剂盒阴性对照、定量校准品、以及病毒稀释液提取的模板各10 μl。每个反应管体积为30μl，将上述反应管放到ABI7500荧光PCR仪上，设定每个反应管样本类型并设置定量校准品浓度值，按照50℃反应2分钟，然后94℃保温5分钟，再按 94℃10秒→60℃45秒 循环45次（在60℃采集FAM、JOE荧光通道的信号）的反应程序运行。扩增结束后按照仪器软件和试剂盒说明书分析判断实验结果。
（3）结果分析
试剂盒对5x103 copy/ml、5x102 copy/ml、5x101 copy/ml浓度的样品分别检测5次结果均为阳性，因此可以确定试剂盒检测灵敏度可以达到5x101 copy/ml。
实施例4：试剂盒在儿童EBV感染、鼻咽癌患者标本EBV检测中的应用
（1）EBV DNA提取
取临床收集的EBV感染儿童咽拭子标本5个、鼻咽癌患者全血和血浆各5个，与试剂盒阴性对照、5个定量校准品一起采用实施例2中的磁珠法病毒DNA提取试剂在核酸提取仪上进行病毒DNA提取，每个样品取样体积400μl，提取后获得核酸各50 μl。
（2）荧光PCR检测
将实施例2中试剂盒扩增部分（反应缓冲液）从-20℃冰箱取出冻融、混匀、短暂离心，按20μl/人份将反应缓冲液分装到PCR反应管中，然后分别加入上述提取的试剂盒阴性对照、定量校准品、以及15个标本提取的模板各10 μl。每个反应管体积为30μl，将上述反应管放到ABI7500荧光PCR仪上，设定每个反应管样本类型并设置定量校准品浓度值，按照50℃反应2分钟，然后94℃保温5分钟，再按 94℃10秒→60℃45秒 循环45次（在60℃采集FAM、JOE荧光通道的信号）的反应程序运行。扩增结束后按照仪器软件和试剂盒说明书分析判断实验结果。
（3）结果分析
采用本发明试剂盒，5个定量校准品与15个临床标本荧光PCR检测EBV核酸结果如表3所示，5个定量校准品在FAM通道检测EBV线性良好、相关系数大于0.99，JOE通道检测Ct值相对稳定、均为内参照阳性；15个标本除了全血4号标本FAM和JOE通道检测双阴性外，其余5个儿童咽拭子分泌物标本、4个鼻咽癌全血标本以及5个标本两个通道检测均为阳性，EBV病毒载量在101～107 copy/ml之间。
对于FAM和JOE双通道检测结果为阴性的4号全血标本，用病毒DNA提取试剂盒中洗脱缓冲液将4号全血标本提取的核酸稀释10倍后复检，结果JOE通道内参照阳性、FAM通道EBV DNA浓度为3.46x103 copy/ml，说明该标本中可能含有PCR抑制物，试剂盒内参照具有监控结果假阴性的作用。
表3试剂盒荧光PCR检测EBV标本结果
注：表中FAM行数值是EBV病毒的载量（copy/ml）、JOE行数值是内参照Ct值（有Ct值为内参照阳性）、undet表示结果阴性。
核苷酸序列表
SEQUENCE LISTING
<110> 上海星耀医学科技发展有限公司
上海复星医药（集团）股份有限公司
吴大治, 夏懿, 吴梅
<120> 一种含内参照的高灵敏Epstein-Barr病毒荧光定量PCR试剂盒
<130> EBVIC
<160> 6
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> Hepatitis B virus
<220>
<221> SEQ_ID_NO:1
<222> (1)..(21)
<400> 1
cccatagact cccatgtaag c 21
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> Hepatitis B virus
<220>
<221> SEQ_ID_NO:2
<222> (1)..(20)
<400> 2
ccctggacat ctggacaaag 20
<210> 3
<211> 23
<212> DNA
<213> Hepatitis B virus
<220>
<221> SEQ_ID_NO:3
<222> (1)..(23)
<223> b=FAM;d=TAMRA or BHQ-1
<400> 3
bcgagtaggt gcctccagag ccd 23
<210> 4
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<220>
<221> SEQ_ID_NO:4
<222> (1)..(23)
<400> 4
tgcttttaac tctggtaaag tgg 23
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<220>
<221> SEQ_ID_NO:5
<222> (1)..(20)
<400> 5
atgacaagct tcccgttctc 20
<210> 6
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Artificial Sequence
<220>
<221> SEQ_IC_NO:6
<222> (1)..(26)
<223> b=JOE or HEX or VIC;d=TAMRA or BHQ-1
<400> 6
bttgttgcca tcaatgaccc cttcad 26
Claims (6)
1.一种单管检测Epstein-Barr病毒（EBV）核酸的荧光定量PCR试剂盒，其特征在于，所述试剂盒反应体系同时采用一对EBV特异性引物和荧光探针、一对内参照特异性引物和荧光探针，EBV上下游引物序列为SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2，EBV荧光探针序列为SEQ IDNO：3且其5’端标记FAM荧光基团；内参照上下游引物序列为SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：5，内参照荧光探针序列为SEQ ID NO：6且其5’端标记JOE或HEX或VIC荧光基团。
2.如权利要求1所述的EBV荧光定量PCR试剂盒，所述扩增反应体系各成分组成如下：10mM pH8.3的 Tris-HCl、50mM KCl、0.2mM dNTPs、1.5～5 mM MgCl2、各0.1～0.5μM具有上述SEQ ID NO：1～6 序列的EBV和内参照引物和荧光探针、1～5 U Taq DNA聚合酶和0.01～1 U UNG酶，提取的模板10μl，以及一定体积的水使得总反应体积为30μl。
3.如权利要求2所述的EBV荧光定量PCR试剂盒，其扩增反应液各成分终浓度为：pH8.3的 Tris-HCl 10 mM，KCl 50 mM，dATP、dGTP、dCTP、dUTP各0.2 mM，MgCl2 3.5 mM，EBV引物和荧光探针各0.3 μM，内参照引物和荧光探针各0.15 μM，Taq DNA聚合酶2 U，UNG酶0.5 U。
4.如权利要求1所述的EBV荧光定量PCR试剂盒，使用的扩增程序如下：50℃ 2min、94℃5min后按照94℃ 10sec、60℃ 45sec循环扩增45次，循环步骤中60℃时采集FAM和JOE波长荧光信号。
5.如权利要求1所述的EBV荧光定量PCR试剂盒，包括1个阴性对照、5个浓度梯度的EBV核酸定量校准品，5个校准品EBV浓度分别为2.0x107 copy/ml、2.0x106 copy/ml、2.0x105copy/ml、2.0x104 copy/ml、2.0x103 copy/ml。
6.如权利要求1所述的EBV荧光定量PCR试剂盒，还包括病毒DNA提取试剂。
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