CN101580883B

CN101580883B - 呼吸道合胞病毒实时荧光pcr检测试剂盒

Info

Publication number: CN101580883B
Application number: CN200810028076XA
Authority: CN
Inventors: 何瑰; 王方金; 李明; 程钢; 何蕴韶
Original assignee: Guangdong Da'an Clinical Examination Center Co Ltd
Current assignee: Guangzhou Daan Center For Clinical Laboratory Co ltd
Priority date: 2008-05-14
Filing date: 2008-05-14
Publication date: 2012-05-30
Anticipated expiration: 2028-05-14
Also published as: CN101580883A

Abstract

本发明涉及实时荧光PCR试剂盒，特别是涉及利用实时荧光PCR技术检测呼吸道合胞病毒(Respiratory Sycytial Virus，RSV)的试剂盒。试剂盒通过对样本中的呼吸道合胞病毒进行定量检测，可广泛应用于呼吸道合胞病毒感染的辅助诊断。

Description

呼吸道合胞病毒实时荧光PCR检测试剂盒

技术领域

背景技术

呼吸道合胞病毒(Respiratory Sycytial Virus，RSV)是引起婴幼儿下呼吸道感染最常见的病毒，主要通过呼吸道侵入人体，并通过空气(飞沫、尘埃)传播，病毒主要在鼻咽上皮细胞中增殖。呼吸道合胞病毒是5岁以内儿童病毒性肺炎的最主要病原体，也是婴儿猝死的病因之一。儿童对RSV普遍易感，且再感染率很高。成人急性感染也很常见，老年人可引起严重肺炎，并发展为成人呼吸窘迫综合征(ARDS)。RSV感染症状主要包括咳嗽、鼻塞、流涕、咽喉不适等呼吸道局部症状和发热、乏力、头痛、肌肉酸痛等全身症状。婴幼儿常伴发热，气急。X线胸片常显示明显的支气管肺炎和/或毛细支气管炎表现。在成人和年长儿，感染可能不明显或仅表现为无热性上呼吸道感染(普通感冒)。多种病毒性肺炎之间依靠临床症状几乎无法区别。

目前临床使用的商品化试剂盒主要采用免疫学方法进行检测，如鼻咽分泌物等标本中特异抗原检测或是血清中抗体检测。常见的快速胶体金法检测时间短，但灵敏度低；免疫荧光法进行抗原检测时对于低浓度感染样本的检测效果不理想[Casiano-Colon，A.E.，B.B.Hulbert，et al.(2003).″Lack of sensitivity of rapid antigen tests for the diagnosisof respiratory syncytial virus infection in adults.″J Clin Virol 28(2)：169-74.Rabagliati，R.，M.Serri，et al.(2007).″[Utility of real time polymerase chainreaction in the diagnosis of respiratory syncytial virus infection among adultpatients].″Rev Chilena Infectol 24(6)：441-5.]，需经病毒培养后再进行检测，且对于操作人员要求较高，存在非特异染色等问题。病毒培养又需要有活病毒存在才能实现，且操作繁琐。有研究表明，检测了儿童血清RSV特异免疫球蛋白G，M，A，其灵敏度远低于病毒分离和抗原检测[Meddens，M.J.，P.Herbrink，et al.(1990).″Serodiagnosis ofrespiratory syncytial virus(RSV)infection in children as measured by detection ofRSV-specific immunoglobulins G，M，and A with enzyme-linked immunosorbent assay.″J Clin Microbiol 28(1)：152-5.]。

利用PCR方法可以直接检测病毒核酸，灵敏度更高。2008年1月，FDA通过第一个利用多重PCR方法，基于Luminex xTAG^TM技术，检测包括呼吸道合胞病毒在内的多种呼吸道病毒核酸检测试剂盒(xTAG^TM RVP试剂盒)[Mahony，J.，S.Chong，et al.(2007).″Development ofa respiratory virus panel test for detect ion of twenty human respiratory viruses byuse of multiplex PCR and a fluid microbead-based assay.″J Clin Microbiol 45(9)：2965-70]，该方法主要是在提取病毒核酸RNA或/和DNA后，经混合逆转录，再使用14对病毒特异引物进行多重PCR；扩增产物经处理，与含有tag序列的21对引物再进行多重靶特异引物延伸(TSPE)反应；其后，TSPE产物与标记有anti-tag序列的带不同荧光微球反应，通过Luminex100流式细胞检测仪进行检测，记录并分析得到结果。

实时荧光定量PCR技术是上世纪90年代中期基于传统的PCR技术发展起来的。与传统的PCR技术(终点检测)相比，实时定量监测方法不仅实现了低拷贝数靶多核苷酸的定量分析，而且还具有特异性和精确度更强、自动化程度更高以及污染的可能性更小等优点，已在多个领域得到应用。一步法RT-PCR只要加入RNA和特异性引物即可实现在同一反应管内连续进行RNA→cDNA→PCR反应，中途不需加入任何试剂，在处理大量样品时易于操作，有助于减少残余污染，因为在cDNA合成和扩增之间不需要打开管盖。一步法可以得到更高的灵敏度，最低可以达到0.1pg总RNA，与上述技术相比，操作更简单，只需2小时即可完成全部检测。

本发明设计的试剂盒通过对RSV核酸进行直接检测和定量研究，有利于加深对这种病毒的认识，不仅对于了解患病程度、预测、评价治疗效果有十分重要意义，而且使得病毒感染发病机制的研究进入量化阶段，为新药的研究与试用提供极为重要的研究手段。

发明内容

本发明的目的在于提供一种实时荧光RT-PCR一步法检测呼吸道合胞病毒的试剂盒(下面简称一步法试剂盒)，该试剂盒包括：(1)RNA提取试剂、RT-PCR反应液、RT-PCR反应酶系、经焦炭酸乙二脂(DEPC)处理的纯水、定量参考品、阴性质控品、阳性质控品，和(2)分隔并集中包装这些试剂瓶或管的包装盒。

为了解决上述任务，本发明的具体技术路线为：

(1)针对呼吸道合胞病毒保守序列设计的能够与靶多核苷酸结合的寡核苷酸引物和寡核苷酸探针。

(2)寡核苷酸探针标记荧光发生基团，使所说的荧光发生基团与被扩增的靶多聚核苷酸间接结合。

(3)适宜于RT-PCR扩增的反应体系和荧光检测体系。核酸扩增反应体系包括逆转录酶、耐热DNA聚合酶、2’-脱氧核苷三磷酸、能够与双链靶多聚核苷酸的第一条链结合的正向引物、能够与双链靶多聚核苷酸的第二条链结合的反向引物、能够与靶多聚核苷酸结合并且两末端分别结合有荧光发生基团和荧光淬灭基团的寡核苷酸探针、含有镁离子的缓冲液。

(4)从待测样本中提取RNA，加入前述的反应体系中，直接经一步法RT-PCR扩增。

(5)确定荧光发生基团所产生的荧光量，分析循环扩增后产生的荧光量以确定靶多核苷酸的存在及定量。并将已确定的样品中靶多核苷酸的阈循环次数与标准溶液中已知量靶多核苷酸的阈循环次数相比较，以计算出样品中靶多核苷酸的量。

根据本发明一个优选的实施方案，其中一步法试剂盒的RT-PCR反应液由5×RT-PCR缓冲液、正向引物、反向引物、寡核苷酸探针、DEPC水组成，其特征在于用于靶多核苷酸扩增的正向和反向引物的序列分别是5’-TGGAAACATACGTGAACAAGC-3’(SEQ ID NO：1)和5’-ACATGGGCACCCATATTGTA-3’(SEQ ID NO：2)，用于靶多核苷酸扩增和监测体系的寡核苷酸探针的序列是5’X-TCCACATACACAGCTGCTGTTCAAT-Y 3’(SEQ ID NO：3)，其中X/Y表示荧光标记检测体系，包括能够与靶多核苷酸结合并且两末端分别结合有荧光发生基团和荧光淬灭基团的寡核苷酸探针。RT-PCR反应酶系包含逆转录酶mMLV、Taq酶和RNA酶抑制剂(RNasin)。

根据本发明另一个优选的实施方案，其中经焦炭酸乙二脂(DEPC)处理的纯水用于病毒核酸溶解或者无RNase相关试剂的配制。

本发明所述的一步法试剂盒中的定量参考品用于制备标准曲线。通过将样品中靶多核苷酸的阈循环次数与已知量靶多核苷酸的阈循环次数相比较，计算出样品中靶多核苷酸的量。其中定量参考品为体外转录RNA或经灭活的利用空斑减数实验定量的病毒培养液。

建立体外转录RNA的技术路线如下：使用引物5’-TTGGAAGGGAATGATAGTGAC-3’(SEQ IDNO：4)和引物5’-ATTTGCTGGGCATTTGTG-3’(SEQ ID NO：5)定性扩增病毒核酸，扩增产物纯化后克隆至pGEM-T载体中，阳性克隆测序确定目的片段是否正确插入并确定插入方向。提取重组质粒pGEM-T-hMPV质粒进行酶切反应，割胶纯化后得到模板，用于体外转录。体外转录后消化DNA模板，进行RNA纯化，得到RSV-RNA。建立标准曲线的方法如下：紫外分光光度计测定A260，对RSV-RNA进行定量，使用DEPC处理水依次进行10倍稀释，浓度范围为10³～10⁷拷贝/ml，制备定量参考品，各浓度梯度RNA同时进行一步法检测，计算并绘出标准曲线，通过比较待测样品和定量参考品的循环域值实现对待测样品的起始拷贝数进行定量。

其中，定量参考品包含下列序列或80％同源的核苷酸序列：

TTGGAAGGGAATGATAGTGACAATGATCTATCACTTGAAGATTTCTGATTAGTTACAAATCTGCACTTCAACACACAACACCAACAGAAGACCAACAAACAAACCAACCCACTCATCCAACCAAACATCCATCCGCCAATCAGCCAAACAGCCAACAAAACAACCAGCCAATCCAAAACCAGCCACCTGGAAAAAATCGACAATATAGTTACAAAAAAAGAAAAGGGTGGGGCAAATATGGAAACATACGTGAACAAGCTTCACGAAGGCTCCACATACACAGCTGCTGTTCAATACAATGTCCTAGAAAAAGACGATGACCCTGCATCACTTACAATATGGGTGCCCATGTTCCAATCATCTATGCCAGCAGATTTACTTATAAAAGAACTAGCTAATGTCAACATACTAGTGAAACAAATATCCACACCCAAGGGACCTTCACTAAGAGTCATGATAAACTCAAGAAGTGCATTGCTAGCACAAATGCCCAGCAAAT。

建立定量灭活病毒培养液的技术路线如下：病毒株，呼吸道合胞病毒标准病毒株A型(Long株/CCTCC编号：GDV052)购自武汉中国典型培养物保藏中心；细胞株：Hela细胞。细胞培养病毒增毒扩增，空斑减数实验进行PFU测定，染色，计算，确定病毒浓度。建立标准曲线的方法如下：根据病毒定量结果，使用DEPC处理水依次进行10倍稀释，浓度范围为10³～10⁷PFU/ml，制备定量参考品，使用各浓度梯度病毒液与待测样本同时进行核酸提取，并进行一步法检测，计算并绘出标准曲线，通过比较待测样品和定量参考品的循环域值实现对待测样品的起始拷贝数进行定量。

本发明所述的一步法试剂盒中的阴性质控品为生理盐水、正常人或其它病毒感染的鼻咽分泌物样本，阳性质控品为体外转录RNA或RSV阳性的鼻咽分泌物样本，用于实际检测中的质量控制。

根据本发明提供的一步法试剂盒，对呼吸道合胞病毒进行检测，该方法包括下列步骤：

用RNA提取试剂进行阴、阳性质控品、或/和定量参考品、待测样本(痰液、鼻咽抽提液或咽拭子抽提液)的RNA提取。RNA提取试剂除本发明提及的方法外，还可以使用其它成熟的RNA提取方法和试剂盒。

将提取的RNA和定量参考品加入到含有RT-PCR反应液和RT-PCR反应酶系的RT-PCR反应管中，进行RT-PCR扩增，使用荧光定量PCR检测仪进行检测。

利用定量参考品制备的标准曲线通过软件分析确定待测样品对应的浓度。

根据本发明提供的用于呼吸道合胞病毒检测的一步法试剂盒，其定量的机理为有一条两端标记有荧光基团和淬灭基团的特异性荧光探针，它设计为与目标序列上游引物和下游引物之间的序列配对。荧光基团连接在探针的5’末端，而淬灭基团则在3’末端。当完整的探针与目标序列配对时，荧光基团发射的荧光因与3’端的淬灭基团接近而被淬灭。但在进行延伸反应时，聚合酶的5’外切酶活性将探针进行酶切，使得荧光基团与淬灭基团分离。随着扩增循环数的增加，释放出来的荧光基团不断积累。因此荧光强度与扩增产物的数量呈正比关系。对呼吸道合胞病毒的定量可以与定量参考品的循环域值(CT，Threshold cycle)比较得出，利用定量参考品制备的标准曲线，直接得到待测样本的起始浓度。

本发明所述的一步法试剂盒，除使用空斑减数方法直接对病毒细胞培养液进行定量外，还提供另一方法：使用体外转录RSV-RNA定量后制备标准曲线，用于待测样本的核酸绝对定量；此外，针对呼吸道合胞病毒检测中的特殊性，对反应体系中引物探针浓度、Mg²⁺浓度，退火温度等均进行了优化，结合荧光定量RT-PCR技术，用于呼吸道合胞病毒的定量检测，通过优化方案，反复实验，建立了定量检测呼吸道合胞病毒的方法，并研制出用于呼吸道合胞病毒核酸定量检测的试剂盒，其中一步法试剂盒检测标本的灵敏度至少可达到5×10²PFU/ml。

本发明与现有技术相比，具有下列优点：

(1)灵敏度更高；

(2)全封闭反应，提取病毒RNA后，直接用于RT-PCR检测，避免了污染发生；

(3)检测速度快，整个过程仅需2小时；

(4)操作简单，可控性强，可进行大批量样品检测，有利于产业化。

附图说明

图1显示一步法试剂盒检测呼吸道合胞病毒的条件设置。

图2显示一步法试剂盒检测呼吸道合胞病毒时不同浓度样本的扩增曲线，三个标本的Ct值均小于27，扩增曲线为S形，均能够判定为阳性。

图3显示一步法试剂盒五个阴性标本的扩增曲线，均不具S形特征，能够判定为阴性。

图4显示一步法试剂盒两个阴性标本的扩增曲线，与荧光检测阈值线没有交点，能够判定为阴性。

图5显示一步法试剂盒定量检测时的扩增曲线，针对模板数为10³～10⁷PFU/ml进行RT-PCR分析。

图6显示一步法试剂盒定量检测时Std curve窗口下的标准曲线，绘制得到的标准曲线相关系数达到0.991。

图7显示阳性质控品扩增曲线。图示扩增曲线为S型曲线，且CT值＜27，说明检测体系有效扩增了呼吸道合胞病毒核酸。

图8显示阴性质控品扩增曲线。图示扩增曲线为较平直的折线，与荧光检测阈值线没有交点，且曲线不呈S型，说明检测过程中没有呼吸道合胞病毒核酸的污染。

具体实施方式

下列实施例旨在举例说明而不是限制本发明。

实施例1：呼吸道合胞病毒的一步法试剂盒检测方法

(1)标本采集、运送和保存

由临床医师根据实际情况进行标本采集。常见标本采集方式有以下几种：拭子浸入4-5ml采样液中，密封送检；痰标本采集后应立即送检，或保存于-20℃待测。可检测的标本包括，痰液、咽拭子和支气管肺泡灌洗液。采集方法如下：①痰液：自然咳痰或诱导吸痰(如，氧气正压法、一次性婴儿吸痰管法和雾化蒸气吸入法)，吸取痰液，密封送检；②鼻咽拭子：用拭子擦拭双侧咽扁桃体及咽后壁，避免接触舌部、或沿平行鼻甲的方向将拭子插入鼻腔，在一定深度时停留几秒钟以蘸取分泌物.两侧鼻腔均应取样，将拭子浸入4-5ml采样液中，密封送检；③支气管肺泡灌洗液：由临床医生收集支气管肺泡灌洗液约1ml，密封送检。标本可立即用于测试，也可以保存于-70℃待测，保存期为6个月。标本运送采用0℃冰壶

(2)核酸提取

向新的经高压灭菌处理过的1.5ml离心管中加入10μl充分混匀的RNA提取液A(为DEPC·H₂O稀释，并高压灭菌后的10％SiO₂；RNA提取液A易沉淀，取样前需用移液器反复吸打混匀后吸取)。然后加入200μl的RNA提取液B(为异硫氰酸胍碱溶液)充分混匀。室温放置5分钟后，8000转/分(rpm)离心1分钟，弃上清；重复加入200μl的RNA提取液B充分混匀，8000转/分(rpm)离心1分钟，弃上清；用75％的预冷乙醇(用DEPC水配制)洗沉淀两次(取75％乙醇400μl洗沉淀，充分震荡混匀，8000转/分(rpm)离心1分钟后去上清后再用75％乙醇400μl洗一次)，65℃干燥并沉淀5分钟。其中，配制75％乙醇时须使用试剂盒中提供的焦碳酸二乙酯处理的纯水(DEPC H₂O)。

在沉淀管加入25μl DEPC水，混悬沉淀物。处理过的样品可直接用于后续RT-PCR检测或于-20℃保存。若保存一个月以上，最好存于-70℃。

RNA提取试剂除本发明提及的方法外，还可以使用其他成熟的RNA提取方法和试剂。

(3)RT-PCR检测

取10ul上述核酸溶液加入至RT-PCR反应液中，3000rpm离心2分钟，荧光定量PCR上机。RT-PCR循环条件是：40℃30分钟→94度3分钟→(预扩增步骤)93度45秒，55度60秒，10个循环→93度30秒，55度(读荧光)45秒，进行30个循环；或40℃30分钟→93度30秒，55度(读荧光)45秒，进行40个循环(参见附图1)。选择荧光定量PCR仪上FAM/TAMRA通道进行荧光信号检测。

(4)结果分析

根据扩增曲线设置Baseline的start值、stop值以及Threshold的Value值(start值可以在1～10、stop值可以在5～20、Value值可以在0.01～0.2范围选择)，在Analysis菜单下选择Analyze自动分析结果。

(5)结果判定

扩增曲线呈S形，且CT值小于37(或增加预扩增步骤时为27)，待检样本判为呼吸道合胞病毒阳性(参见附图2)；

扩增曲线不呈S形，或CT值大于37(或增加预扩增步骤时为27)，待检样本判为呼吸道合胞病毒阴性(参见附图3和附图4)。

实施例2：呼吸道合胞病毒核酸定量检测试剂盒中定量参考品和质控品的配制及使用

呼吸道合胞病毒核酸定量检测试剂盒中定量参考品为体外转录RNA或灭活定量病毒细胞培养液，用于制备标准曲线，对待检样本进行准确定量，体外转录RNA可直接用于RT-PCR检测，而灭活定量病毒细胞培养液操作方法同待检样本；质控品包括阳性质控品和阴性质控品，用于临床试验中质量控制，操作方法同待检样本。

经一步法扩增后，保存检测数据文件。根据分析后图像调节分析参数使标准曲线(Stdcurve)窗口下的标准曲线图达到最佳(即相关性(correlation)数值＜-0.95)。最后由仪器自动分析装置计算出未知标本的测定数值(Qty)，即标本中呼吸道合胞病毒的RNA含量。其中一步法定量参考品制备的标准曲线的扩增曲线参见附图5，其标准曲线相关信息参见附图6。

质量控制标准：要求在一次实验中同时满足以下条件——阳性质控品为阳性(参见附图7)、阴性质控品为阴性(参见附图8)、定量参考品制备得到的标准曲线相关系数大于0.95；否则，结果无效，需重新检测。

以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明的保护范围。

序列表

<110>中山大学达安基因股份有限公司

<120>呼吸道合胞病毒实时荧光PCR检测试剂盒

<140>

<141>

<160>5

<210>1

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>根据特定核苷酸序列设计，以用作PCR扩增的引物。

<400>1

tggaaacatacgtgaacaagc

<210>2

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>根据特定核苷酸序列设计，以用作PCR扩增的引物。

<400>2

acatgggcacccatattgta

<210>3

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>根据特定核苷酸序列设计，以用作PCR扩增的探针。

<400>3

tccacatacacagctgctgttcaat

<210>4

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>根据特定核苷酸序列设计，以用作PCR扩增的引物。

<400>4

ttggaagggaatgatagtgac

<210>5

<211>18

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>根据特定核苷酸序列设计，以用作PCR扩增的引物。

<400>5

atttgctgggcatttgtg

Claims

1.一种实时荧光RT-PCR一步法检测呼吸道合胞病毒的试剂盒，该试剂盒包括：(1)RNA提取试剂、RT-PCR反应液、RT-PCR反应酶系、经焦炭酸乙二脂(DEPC)处理的纯水、定量参考品、阴性质控品、阳性质控品，和(2)分隔并集中包装这些试剂瓶或管的包装盒，其中RT-PCR反应液由5×RT-PCR缓冲液、正向引物、反向引物、带有荧光发生基团和荧光淬灭基团的寡核苷酸探针、DEPC水组成，其特征在于用于靶多核苷酸扩增的正向和反向引物的序列分别是5’-TGGAAACATACGTGAACAAGC-3’和5’-ACATGGGCACCCATATTGTA-3’。

2.根据权利要求1的试剂盒，其特征还在于用于靶多核苷酸扩增和监测体系的寡核苷酸探针的序列是5’X-TCCACATACACAGCTGCTGTTCAAT-Y 3’，其中X/Y表示荧光标记检测体系，包括能够与靶多核苷酸结合并且两末端分别结合有荧光发生基团和荧光淬灭基团的寡核苷酸探针。

3.根据权利要求1的试剂盒，其特征还在于阴性质控品为生理盐水或正常人鼻咽分泌物样本，阳性质控品为呼吸道合胞病毒阳性的鼻咽分泌物样本。

4.根据权利要求1的试剂盒，其特征还在于RT-PCR反应酶系包含逆转录酶mMLV、Taq酶和RNA酶抑制剂。