CN104195266B - 检测小儿肺炎三种病原体的四重荧光定量pcr试剂盒 - Google Patents

检测小儿肺炎三种病原体的四重荧光定量pcr试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明公开了检测小儿肺炎三种病原体及内参的四重荧光定量PCR试剂盒，由DNA提取液、四重荧光PCR反应液、内参溶液、阴性质控品、强阳性质控品、弱阳性质控品、五个阳性定量标准品组成。本发明采用AllGlo探针技术，设计了四对特异引物和相应的探针，应用四重荧光定量PCR技术同时检测三种病原体和内参，优化反应条件，建立一种基于AllGlo探针技术的单管四重PCR同时检测三种病原体和内参的方法。本发明设计合理，操作简单快速，灵敏度高，特异性、重复性好，结果准确可靠，为小儿急性呼吸道感染引起的肺炎的早期诊断和防治、阻断传染源、减少EBV、MP、HCMV感染及混合感染、监测临床疗效提供可能。

Description

检测小儿肺炎三种病原体的四重荧光定量PCR试剂盒
技术领域
本发明属于生物技术，涉及检测小儿肺炎三种病原体的四重荧光定量PCR试剂盒，尤其涉及检测肺炎支原体、人巨细胞病毒、EB病毒四重荧光定量PCR试剂盒，具体地说，本发明涉及应用四重实时荧光定量PCR技术在一个PCR反应管中快速、平行地同时定量检测三种病原体（EBV、MP、HCMV）和内参（GAPDH，作为质控）的试剂盒。
背景技术
急性呼吸道感染（ARI）引起的肺炎是儿童常见病、多发病。近年来随着各种抗生素的广泛应用，呼吸道细菌感染有所降低，而病毒、肺炎支原体感染呈上升趋势，约占80％，严重威胁儿童的健康。研究表明，同一患儿可兼有两种或两种以上病原体的感染，各种病原体之间可能存在着相互激活作用，致使一种病原体感染后易招致另一种或多种病原体同时感染，其确切机制尚待研究。人群中MP、EBV、CMV感染非常普遍。
EB病毒是一种嗜淋巴细胞的DNA病毒，属于疱疹病毒属。EBV感染是儿童常见的一种病毒感染，我国3—5岁儿童感染率达90％以上，发病不受区域、季节等环境因素影响，传播途径主要为口—口传播。发病后可出现典型的传染性单核细胞增多症，也可出现其他复杂的临床表现或隐性感染。但是目前临床上发现，EB病毒感染可累及全身各个系统，引起疾病多样。有学者甚至认为，目前EB病毒感染在儿童中以呼吸道感染最多见（40.5%），其次才为传染性单核细胞增多症（17.9%）。
肺炎支原体（MP）肺炎是学龄儿童常见的呼吸道感染性疾病，儿童中的发病率有上升趋势。MP是一种介于细菌和病毒之间的胸膜肺炎样病原微生物，无细胞壁，主要经呼吸道传播。可引起散发或小的流行，具有起病急、进展快、病程长的特点，目前在儿科呼吸道感染中，支原体肺炎越来越受到重视，国内资料统计，其发病率约占10％一30％，国外有文献报道为50％，流行年可达30％，流行周期由4年一次趋向2—6年一次流行。
巨细胞病毒肺炎是由巨细胞病毒（CMV）引起的先天或后天获得性感染并出现肺炎相应症状、体征的疾病。CMV属于疱疹病毒科，双链线状DNA病毒，一旦感染机体将长期处于带毒状态，在免疫系统低下或不成熟时，病毒不断复制。CMV感染在我国广泛流行，且多在婴幼儿时期发病，初次感染大多在2岁以下，肺脏是婴幼儿CMV感染的重要靶器。CMV存在于所有体液（血液、唾液、乳汁、子宫颈分泌物、尿液等）中，可通过水平一垂直途径传播。目前CMV已成为小儿肺炎的主要病原之一。
近年，以上三种病原体感染引起的肺炎发病率逐渐增加，并常表现为合并感染，其临床表现复杂多样，易误诊和漏诊，实验室检查是应用于其合并感染的主要检查手段，并具有一定的价值。尤其是肺炎支原体合并EB病毒感染，研究表明，肺炎支原体合并EB病毒感染具有肺外并发症发生率高，肝脏、心肌和血液系统损伤严重等特点，两种微生物感染相互作用，导致疾病进一步进展，从而使实验室检查改变更为明显。因此临床上对发热、剧烈咳嗽伴淋巴结肿大，血常规异常淋巴细胞增高的患儿和重症MP感染的患儿以及对大环内酯类抗生素治疗反应不佳的患儿要高度警惕MP感染所致传染性单核细胞增多症，要考虑有EB病毒混合感染的可能，及早进行多病原联合检测明确诊断。对于病情重、病程长、临床迁延不愈者要注意多种病原的混合感染。另外文献资料证实CMV相关性肺炎常合并其他病原体混合感染和肺外脏器损害，以并发MP感染多见。因此，同时快速准确的对EBV、MP、HCMV联合检测意义重大。
EBV、MP、HCMV感染引起的肺炎临床对其病原学诊断仍主要依靠实验室检查。病毒（支原体）培养阳性是诊断的金标准，但鉴于其生长缓慢且从临床样本中进行分离培养相当困难（培养要求高，耗时长），不适用于该类病原体感染的诊断，因而限制了其在临床的应用。近几年来特殊病毒、变异病毒及支原体引起的呼吸道感染在增高，且病情特殊、发病严重，死亡率增高，婴幼儿肺炎也呈上升趋势，为了能够对病原体进行早期诊断，尽早地使用恰当的药物进行治疗，用可靠而敏感的临床诊断进行证实是必须的。目前，临床多采用血清特异性抗体检测或靶DNA扩增法的PCR方法检测其感染。其中血清特异性抗体检测由于检测方便，目前在许多医疗机构普遍采用，但由于方法的局限性常有假阳性发生，是非特异性实验，敏感性特异性均较差，且漏诊率较高，不近人意。而荧光定量PCR检测方法具有敏感性高、特异性强、快速简便、准确可靠、成本低、可以定量等诸多优点，在近几年已成为EBV、MP、HCMV感染的首选诊断方法。但是，目前报道的荧光定量PCR检测未实现单管同时定量检测以上3种引起小儿肺炎的病原体及内参，难以满足临床上对这三种病原体同时检测的需要，用以临床考虑是否合并感染，因此该方法值得优化提高从而能够在临床上广泛应用。
荧光定量PCR技术发展日新月异，美国AlleLogicBiosciences公司推出了最新一代荧光定量探针—AllGlo探针，它拥有普通TaqMan、TaqMan-MGB及MolecularBeacon探针所有优点。本研究通过检测AllGlo特异性探针的荧光增量得知检测结果，能在一个PCR反应中同时检测EBV、MP、HCMV及内参，灵敏度、特异性和重复性都达到了97%。本研究所建立的多重实时荧光PCR方法灵敏度可以达到101Copies/Test，最高可达108Copies/Test。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种检测小儿肺炎三种病原体及内参的四重荧光定量PCR试剂盒，由DNA提取液、四重荧光PCR反应液、内参溶液、1个阴性质控品、1个强阳性质控品、1个弱阳性质控品、5个浓度的阳性定量标准品组成。其中四重荧光PCR反应液为四组引物、探针以及qPCR反应缓冲液（含Mg2+）、四种核苷酸单体（dNTPs）、HotStartTaqDNA聚合酶等成分构成的混合液。阴性质控品为灭菌注射用水。强、弱阳性质控品为由EBV、MP、HCMV、GAPDH等量混合的阳性质粒样品，强阳性质控品浓度107Copies/μl，弱阳性质控品浓度103Copies/μl。5个阳性定量标准品分别为浓度103Copies/μl、104Copies/μl、105Copies/μl、106Copies/μl、107Copies/μl的由EBV（EB病毒）、MP（肺炎支原体）、HCMV（人巨细胞病毒）、GAPDH（甘油醛-3-磷酸脱氢酶，Glyceraldehyde3-phosphatedehydrogenase）等量混合质粒样品。内参溶液为GAPDH质粒样品。
所述的引物及其特异性定量PCR荧光探针序列如下：
EBV：
上游引物：GCTACGCCTTCCAGAATGAC
下游引物：TAGAGGCCTAGGTCCACAGT
探针：MAR-CGCCCTACACTAGCCTGCTGGAG-MAR
MP：
上游引物：AAGCAGTTTGTGGAGAATCAGC
下游引物：AGACGAGGTGGTCTTGGACA
探针：URA-AGCCAGCTTACCTCATCGCCGG-URA
HCMV：
上游引物：GCTCACGGTCCGCTATGT
下游引物：GCAGGATGATGCGAGAACG
探针：NEP-CTCGACGTGTACTGCTGCCGCC-NEP
GAPDH：
上游引物：AACGGGAAACTCACTGGCAT
下游引物：ACAGTGGTTGTTGAGGGCAA
探针：JUP-GTGTCCCCACTGCCAATGTGTCAGTCG-JUP
MAR、URA、NEP、JUP是AllGlo探针的四种不同荧光素，
EBV标准品序列：
GCTACGCCTTCCAGAATGACAAGCTGTTGCTCCAGCAGGCTAGTGTAGGGCGGCTCACCTTGGTCAACAAGACCACCATCCTGCTGCGCCCGATGAAGACCACAACTGTGGACCTAGGCCTCTA
MP标准品序列：
AAGCAGTTTGTGGAGAATCAGCTTGGTTTTAAAGATGACTCAAATTCTTCCTTGACAAACTTCAAGAGTCAAGGCTTAACTCAGCCAGCTTACCTCATCGCCGGCCTTGACGTTGTCCAAGACCACCTCGTCT
HCMV标准品序列：
GCTCACGGTCCGCTATGTCCGCTCGTGTTCCAGGGTTGGGCGTACGCCGTGTACCACCAAGGCGACATGGTCCTCATGACGCTCGACGTGTACTGCTGCCGCCAGACCTCCAGCAACACCGTCGTCGCGTTCTCGCATCATCCTGC
GAPDH标准品序列：
AACGGGAAACTCACTGGCATGGCCTTCTGTGTCCCCACTGCCAATGTGTCAGTCGTGGACCTGATCTACCATCTGGAAAAACCTACCAAATATCATGGCATCAAGAAGGTGGTGAAGGAGGCATCAGAGGGCTCCCTCTAGGGCATCCTGGGCTACAACACCGAGCACCAGGTTGTCTCCTTCGACTTCAACAGCGACATCCATTCTTCCACCTTTGATGTTGGGGCTGGCATTGCCCTCAACAACCACTGT252。
本发明肺炎支原体、人巨细胞病毒、EB病毒四重荧光定量PCR联合试剂盒检测方法如下步骤：
（1）引物设计：在基因库中检索获得EB病毒、肺炎支原体、人巨细胞病毒及内参，即EBV、MP、HCMV、GAPDH特异性的保守基因，通过网上序列比对，确定EBV、MP、HCMV、GAPDH的高度保守序列区，作为待检靶基因特异性核酸序列设计特异引物；
（2）荧光探针设计：根据步骤（1）中的三种病原体及内参的待检靶基因特异性核酸序列设计荧光探针；
（3）标准分子的构建：根据步骤（1）确定的特异引物，利用基因克隆技术构建四种分别含有EBV、MP、HCMV、GAPDH高度保守序列区的标准质粒分子；
（4）四重荧光PCR反应液组成：使用步骤（1）中的引物和步骤（2）中的探针及qPCR反应缓冲液（含Mg2+）、四种核苷酸单体（dNTPs）、HotStartTaqDNA聚合酶等成分构成四重荧光PCR反应液；
（5）四重荧光PCR反应的优化和建立：通过100-400nM范围内各个浓度的引物和探针的组合，组成不同的四重荧光定量PCR反应体系，根据反应效率和曲线确定最终的PCR反应体系；
（6）标准曲线制备：使用步骤（5）中的四重荧光PCR反应体系，将已知拷贝数的含有EBV、MP、HCMV、GAPDH目的扩增片段的重组质粒连续10倍倍比稀释，加入到荧光定量PCR主反应液中，综合分析仪器给出的各项数据，设定合理的阈值(Threshold)和基线(Baseline)，进行结果分析，制备标准曲线；
（7）临床标本检测：用已知EBV、MP、HCMV三种病原体和基因载量的临床标本病原体DNA提取液作为模板，进一步用步骤（5）和（6）的方法和条件进行四重荧光定量PCR扩增；
所述的特异性的保守基因，指的是EBV的外膜糖蛋白基因，MP的ORF6基因，HCMV的HAN22基因和GAPDH的人6号染色体上的GAPDHP72基因；
所述的特异性荧光定量PCR引物，指的是长度为20±3Nt的寡核苷酸链，与肺炎支原体、人巨细胞病毒、EB病毒及内参待检靶基因特异性核酸序列完全相同或互补；
所述的特异性荧光定量PCR荧光探针，指的是长度为24±3Nt的寡核苷酸链，与肺炎支原体、人巨细胞病毒、EB病毒及内参待检靶基因特异性核酸序列完全相同或互补，所有探针的5′端和3′端均使用AllGlo探针进行标记，AllGlo探针的每种染料既是报告基团又是粹灭基团；
所述的试剂盒包括如下成分：①DNA提取液；②质控品（阴性、强阳性、弱阳性）及阳性定量标准品；③内参溶液；④四重荧光PCR反应液。
步骤（1）、（2）所述的引物及其特异性定量PCR荧光探针序列如下：
EBV：
上游引物：GCTACGCCTTCCAGAATGAC
下游引物：TAGAGGCCTAGGTCCACAGT
探针：MAR-CGCCCTACACTAGCCTGCTGGAG-MAR
MP：
上游引物：AAGCAGTTTGTGGAGAATCAGC
下游引物：AGACGAGGTGGTCTTGGACA
探针：URA-AGCCAGCTTACCTCATCGCCGG-URA
HCMV：
上游引物：GCTCACGGTCCGCTATGT
下游引物：GCAGGATGATGCGAGAACG
探针：NEP-CTCGACGTGTACTGCTGCCGCC-NEP
GAPDH：
上游引物：AACGGGAAACTCACTGGCAT
下游引物：ACAGTGGTTGTTGAGGGCAA
探针：JUP-GTGTCCCCACTGCCAATGTGTCAGTCG-JUP
MAR、URA、NEP、JUP是AllGlo探针的四种不同荧光素，
EBV标准品序列：
GCTACGCCTTCCAGAATGACAAGCTGTTGCTCCAGCAGGCTAGTGTAGGGCGGCTCACCTTGGTCAACAAGACCACCATCCTGCTGCGCCCGATGAAGACCACAACTGTGGACCTAGGCCTCTA
MP标准品序列：
AAGCAGTTTGTGGAGAATCAGCTTGGTTTTAAAGATGACTCAAATTCTTCCTTGACAAACTTCAAGAGTCAAGGCTTAACTCAGCCAGCTTACCTCATCGCCGGCCTTGACGTTGTCCAAGACCACCTCGTCT
HCMV标准品序列：
GCTCACGGTCCGCTATGTCCGCTCGTGTTCCAGGGTTGGGCGTACGCCGTGTACCACCAAGGCGACATGGTCCTCATGACGCTCGACGTGTACTGCTGCCGCCAGACCTCCAGCAACACCGTCGTCGCGTTCTCGCATCATCCTGC
GAPDH标准品序列：
AACGGGAAACTCACTGGCATGGCCTTCTGTGTCCCCACTGCCAATGTGTCAGTCGTGGACCTGATCTACCATCTGGAAAAACCTACCAAATATCATGGCATCAAGAAGGTGGTGAAGGAGGCATCAGAGGGCTCCCTCTAGGGCATCCTGGGCTACAACACCGAGCACCAGGTTGTCTCCTTCGACTTCAACAGCGACATCCATTCTTCCACCTTTGATGTTGGGGCTGGCATTGCCCTCAACAACCACTGT252。
所述的待检靶基因特异性核酸序列，指的是针对每一种病原体及内参基因所特有的一段基因序列。
所述的四重荧光定量PCR反应体系，指的是由四组引物、探针以及qPCR反应缓冲液（含Mg2+）、四种核苷酸单体（dNTPs）、HotStartTaqDNA聚合酶等成分构成的混合液。
所述的标准分子，指的是利用基因克隆技术构建的人工重组质粒，每种质粒只重组一种特异待检靶基因序列。
所述的四重荧光定量PCR反应标准曲线，指的是不同稀释度标准质粒分子用四重荧光定量PCR反应液进行检测所得，标准曲线的r2均大于0.99，扩增效率在1.02-1.06之间，满足荧光定量PCR标准曲线的要求。
本发明根据肺炎支原体、人巨细胞病毒、EB病毒及内参特异性基因的保守基因，登录GeneBank获取相关序列，应用Clustalw软件对所有序列比对分析，挑选最保守的基因序列用PrimerPremiers5.0软件设计引物，登录NCBI通过BLAST程序比对分析，三种病原体和内参各筛选出一对特异性最强的引物和相应的特异探针，用自制的不同浓度的标准分子（EBV、MP、HCMV、GAPDH靶基因质粒克隆载体）作为模板，在ABI7500荧光定量PCR仪中（能够同时检测5种荧光）进行单、四重荧光定量PCR实验，优化四重荧光定量PCR反应体系，确定该方法的灵敏度、特异性、重复性等，制备标准曲线，最后用该方法检测25份临床标本，同时与临床实验室在用的单重TaqMan方法检测结果进行比较，分析四重荧光定量PCR方法的可靠性。
本发明是一种临床常见引起小儿肺炎三种病原体的早期、快速、简便而有效的四重实时荧光定量PCR检测方法，涉及的病原体和内参包括EBV、MP、HCMV和GAPDH，由于采用AllGlo荧光素标记探针，使其检测灵敏度大大提高，达到10-100个拷贝的病原体分子，对于单个检测样本检测时间约为1个小时，操作简便，并且可以特殊进行大批量的样本分析检测，较现有的单重荧光定量PCR技术在检测通量方面有了极大提高，较血清特异性抗体检测在检测灵敏度、特异性、定量等方面均有很大的提高或改进，对引起小儿肺炎临床常见3种病原体的感染和联合感染的流行监控、快速鉴定、疗效判断等方面具有很大帮助，其应用前景看好。
本发明可以简便快速地在一个反应管中同时、快速地检测临床常见引起小儿肺炎三种病原体的感染，对小儿急性呼吸道感染引起的肺炎的早期诊断和防治、阻断传染源、减少EBV、MP、HCMV感染及合并感染、监测临床疗效均有很大的临床价值。采用本发明提供的方法，解决了现有引起小儿肺炎临床常见3种病原体的检测方法要么不能检测多重感染、要么不能定量、要么特异性较差或者成本高、操作繁琐等诸多缺陷，实现了单管PCR同时检测三种病原体和内参，而且能够定量检测，操作简单快速，灵敏度高，特异性好，重复性好，结果准确可靠。
本发明的一个重要特色是以人管家基因GAPDH作为内参，全程监控检测质量，包括标本处理、核酸提取以及PCR反应、结果分析等。本发明采用AllGlo探针技术，设计了四对特异引物和相应的探针，应用四重荧光定量PCR技术同时检测三种病原体和内参，并对该技术反应条件进行了优化，建立了一种基于AllGlo探针技术的单管四重荧光定量PCR同时检测三种病原体和内参的方法，适合于小儿急性呼吸道感染引起的肺炎的快速早期诊断和防治，为引起小儿肺炎临床常见3种病原体的感染及合并感染的病程监测和疗效判断提供指导，应用前景广阔。
附图说明
图1a是EB病毒在四重荧光定量PCR中的标准曲线扩增图。
图1b是相应的标准曲线（斜率为-3.183，截距为37.781，R2为0.998）。
图2a是肺炎支原体在四重荧光定量PCR中的标准曲线扩增图。
图2b是相应的标准曲线（斜率为-3.285，截距为39.003，R2为0.992）。
图3a是人巨细胞病毒在四重荧光定量PCR中的标准曲线扩增图。
图3b是相应的标准曲线（斜率为-3.236，截距为38.050，R2为0.998）。
图4a是内参在四重荧光定量PCR中的标准曲线扩增图。
图4b是相应的标准曲线（斜率为-3.178，截距为37.831，R2为0.995）。
注：上述模板为EBV、MP、HCMV、内参等量混合质粒，浓度(Copies/μl)为107、106、105、104、103，平行3管。（其中内参在浓度为103Copies/μl为平行2管）
图5是EB病毒在四重荧光定量PCR中的敏感性实验扩增图。
图6是肺炎支原体在四重荧光定量PCR中的敏感性实验扩增图。
图7是人巨细胞病毒在四重荧光定量PCR中的敏感性实验扩增图。
图8是内参在四重荧光定量PCR中的敏感性实验扩增图。
注：上述模板为EBV、MP、HCMV、内参等量混合质粒，浓度(Copies/μl)为108、107、106、105、104、103、102、101，平行3管。（其中内参在浓度为108、103Copies/μl为平行2管）
图9是EB病毒（EBV）、肺炎支原体（MP）、人巨细胞病毒（HCMV）及内参在四重荧光定量PCR中的特异性实验扩增图（EBV、MP、HCMV、内参等量混合质粒模板浓度为107Copies/μl，平行2管）。
图10是EB病毒（EBV）、肺炎支原体（MP）、人巨细胞病毒（HCMV）及内参在四重荧光定量PCR中的特异性实验扩增图（EBV、MP、HCMV、内参等量混合质粒模板浓度为104Copies/μl，平行2管）。
具体实施方式
本发明结合附图和实施例作进一步的说明。
实施例1
一种检测小儿肺炎三种病原体及内参的四重荧光定量PCR试剂盒，由DNA提取液、四重荧光PCR反应液、内参溶液、1个阴性质控品、1个强阳性质控品、1个弱阳性质控品、5个阳性定量标准品组成，其中四重荧光PCR反应液为四组引物、探针以及qPCR反应缓冲液（含Mg2+）、四种核苷酸单体（dNTPs）、HotStartTaqDNA聚合酶等成分构成的混合液。阴性质控品为灭菌注射用水。强、弱阳性质控品为由EBV、MP、HCMV、GAPDH等量混合的阳性质粒样品，强阳性质控品浓度107Copies/μl，弱阳性质控品浓度103Copies/μl。阳性定量标准品分别为浓度103Copies/μl、104Copies/μl、105Copies/μl、106Copies/μl、107Copies/μl的由EBV（EB病毒）、MP（肺炎支原体）、HCMV（人巨细胞病毒）、GAPDH（甘油醛-3-磷酸脱氢酶，Glyceraldehyde3-phosphatedehydrogenase）等量混合质粒样品。内参溶液为GAPDH质粒样品。
所述的引物及其特异性定量PCR荧光探针序列如下：
EBV：
上游引物：GCTACGCCTTCCAGAATGAC
下游引物：TAGAGGCCTAGGTCCACAGT
探针：MAR-CGCCCTACACTAGCCTGCTGGAG-MAR
MP：
上游引物：AAGCAGTTTGTGGAGAATCAGC
下游引物：AGACGAGGTGGTCTTGGACA
探针：URA-AGCCAGCTTACCTCATCGCCGG-URA
HCMV：
上游引物：GCTCACGGTCCGCTATGT
下游引物：GCAGGATGATGCGAGAACG
探针：NEP-CTCGACGTGTACTGCTGCCGCC-NEP
GAPDH：
上游引物：AACGGGAAACTCACTGGCAT
下游引物：ACAGTGGTTGTTGAGGGCAA
探针：JUP-GTGTCCCCACTGCCAATGTGTCAGTCG-JUP
MAR、URA、NEP、JUP是AllGlo探针的四种不同荧光素。
标准品序列：
EBV：
GCTACGCCTTCCAGAATGACAAGCTGTTGCTCCAGCAGGCTAGTGTAGGGCGGCTCACCTTGGTCAACAAGACCACCATCCTGCTGCGCCCGATGAAGACCACAACTGTGGACCTAGGCCTCTA
MP：
AAGCAGTTTGTGGAGAATCAGCTTGGTTTTAAAGATGACTCAAATTCTTCCTTGACAAACTTCAAGAGTCAAGGCTTAACTCAGCCAGCTTACCTCATCGCCGGCCTTGACGTTGTCCAAGACCACCTCGTCT
HCMV：
GCTCACGGTCCGCTATGTCCGCTCGTGTTCCAGGGTTGGGCGTACGCCGTGTACCACCAAGGCGACATGGTCCTCATGACGCTCGACGTGTACTGCTGCCGCCAGACCTCCAGCAACACCGTCGTCGCGTTCTCGCATCATCCTGC
GAPDH标准品序列：
AACGGGAAACTCACTGGCATGGCCTTCTGTGTCCCCACTGCCAATGTGTCAGTCGTGGACCTGATCTACCATCTGGAAAAACCTACCAAATATCATGGCATCAAGAAGGTGGTGAAGGAGGCATCAGAGGGCTCCCTCTAGGGCATCCTGGGCTACAACACCGAGCACCAGGTTGTCTCCTTCGACTTCAACAGCGACATCCATTCTTCCACCTTTGATGTTGGGGCTGGCATTGCCCTCAACAACCACTGT252。
实施例2
肺炎支原体、人巨细胞病毒、EB病毒四重荧光定量PCR联合检测方法及其试剂盒包括如下步骤：
（1）引物设计：在基因库中检索获得EB病毒、肺炎支原体、人巨细胞病毒及内参，即EBV、MP、HCMV、GAPDH特异性的保守基因，通过网上序列比对，确定EBV、MP、HCMV、GAPDH的高度保守序列区，作为待检靶基因特异性核酸序列设计特异引物；
（2）荧光探针设计：根据步骤（1）中的三种病原体及内参的待检靶基因特异性核酸序列设计荧光探针；
（3）标准分子的构建：根据步骤（1）确定的特异引物，利用基因克隆技术构建四种分别含有EBV、MP、HCMV、GAPDH高度保守序列区的标准质粒分子；
（4）四重荧光PCR反应液组成：使用步骤（1）中的引物和步骤（2）中的探针及qPCR反应缓冲液（含Mg2+）、四种核苷酸单体（dNTPs）、HotStartTaqDNA聚合酶等成分构成四重荧光PCR反应液；
（5）四重荧光PCR反应的优化和建立：通过100-400nM范围内各个浓度的引物和探针的组合，组成不同的四重荧光定量PCR反应体系，根据反应效率和曲线确定最终的PCR反应体系；
（6）标准曲线制备：使用步骤（5）中的四重荧光PCR反应体系，将已知拷贝数的含有EBV、MP、HCMV、GAPDH目的扩增片段的重组质粒连续10倍倍比稀释，加入到荧光定量PCR主反应液中，综合分析仪器给出的各项数据，设定合理的阈值(Threshold)和基线(Baseline)，进行结果分析，制备标准曲线；
（7）临床标本检测：用已知EBV、MP、HCMV三种病原体和基因载量的临床标本病原体DNA提取液作为模板，进一步用步骤（5）和（6）的方法和条件进行四重荧光定量PCR扩增；
所述的特异性的保守基因，指的是EBV的外膜糖蛋白基因，MP的ORF6基因，HCMV的HAN22基因和GAPDH的人6号染色体上的GAPDHP72基因；
所述的特异性荧光定量PCR引物，指的是长度为20±3Nt的寡核苷酸链，与肺炎支原体、人巨细胞病毒、EB病毒及内参待检靶基因特异性核酸序列完全相同或互补；
所述的特异性荧光定量PCR荧光探针，指的是长度为24±3Nt的寡核苷酸链，与肺炎支原体、人巨细胞病毒、EB病毒及内参待检靶基因特异性核酸序列完全相同或互补，所有探针的5′端和3′端均使用AllGlo探针进行标记，AllGlo探针的每种染料既是报告基团又是粹灭基团；
所述的试剂盒包括如下成分：①DNA提取液；②质控品（阴性、强阳性、弱阳性）及阳性定量标准品；③内参溶液；④四重荧光PCR反应液。
步骤（1）、（2）所述的引物及其特异性定量PCR荧光探针序列及标准品序列同实施例1。
所述的待检靶基因特异性核酸序列，指的是针对每一种病原体及内参基因所特有的一段基因序列。
所述的四重荧光定量PCR反应体系，指的是由四组引物、探针以及qPCR反应缓冲液（含Mg2+）、四种核苷酸单体（dNTPs）、HotStartTaqDNA聚合酶等成分构成的混合液。
所述的标准分子，指的是利用基因克隆技术构建的人工重组质粒，每种质粒只重组一种特异待检靶基因序列。
所述的四重荧光定量PCR反应标准曲线，指的是不同稀释度标准质粒分子用四重荧光定量PCR反应液进行检测所得，标准曲线的r2均大于0.99，扩增效率在1.02-1.06之间，满足荧光定量PCR标准曲线的要求。
实施例3
1.三种病原体（EBV、MP、HCMV）和内参目的基因质粒克隆载体的构建：
采用T-A载体克隆方案，将四种目的基因PCR产物经过电泳确认扩增片段分子量后，扩增片段经2%琼脂糖凝胶回收纯化，克隆至pMD-19T质粒中,16℃连接30分钟，将连接产物转化至感受态大肠埃希菌DH5α中，取适量涂布于LB/Amp/X-Gal/IPTG平板，37℃培养过夜，筛选阳性菌落，接种至LB肉汤培养基，37℃220rpm振荡培养过夜，经回收、抽提、纯化、重组质粒，并在英骏（上海）生物公司测序验证，序列经BLAST比对后完全正确的目的质粒用紫外分光光度计定量后，用1×TE（pH8.0）缓冲液稀释到109拷贝/μl作为储存液，–20℃保存备用。
2.样本要求：
2.1适用标本类型：痰液、分泌物拭子等
2.2标本采集：
2.2.1痰液：使用一次性吸痰器，患儿取仰头平卧位，将吸痰管缓缓插入咽喉部，调节负压，将气管深部分泌物（在雾化吸入后效果较好）缓缓吸入储液瓶中，反复数次，储液瓶中分泌物即为标本，密封送检；吸取的分泌物亦尽快送检，以免干燥无法分析化验。或患者早上起床后用清水漱口，不要刷牙，从呼吸道深部用力咳出新鲜痰液于专用塑料痰盒中送检。
2.2.2分泌物拭子：采用无菌棉拭子，包括鼻部、咽部、喉部标本。患者宜清水漱口，用压舌板将舌向下向外压，无菌棉拭子越过舌根到达咽后壁或悬雍垂后侧或咽喉部发红、灰白色可疑假膜部位，反复涂抹数次后小心退出，置于无菌试管内塞紧塞子送检。
2.3标本保存和运送：标本可立即用于测试，也可保存于-20℃待测，保存期为6个月。标本运送时应采用0℃冰壶。
3.DNA模板提取：
3.1阴性质控品处理：向阴性质控品管中加入等量DNA提取液和5μl内参溶液充分混匀，100℃恒温处理10分钟，12000rpm离心5分钟，备用。
3.2标本处理
3.2.1痰液：痰液中加入4倍体积的生理盐水，用1ml的枪头反复吹打后置4℃冰箱过夜，使痰液充分液化。用枪头或吸管混匀后吸取1ml至1.5ml离心管中，12000rpm离心5分钟。去上清，沉淀中加入50μlDNA提取液和5μl内参溶液充分混匀，100℃恒温处理10分钟，12000rpm离心5分钟，备用。
3.2.2分泌物拭子：加灭菌生理盐水1.5ml到无菌玻璃管，充分震荡混匀，挤干棉拭子，立即将液体全部转移至1.5ml离心管中，12000rpm离心5分钟。去上清，沉淀加灭菌生理盐水1ml混匀，12000rpm离心5分钟。去上清，沉淀中加入50μlDNA提取液和5μl内参溶液充分混匀，100℃恒温处理10分钟，12000rpm离心5分钟，备用。
3.3EBV、MP、HCMV、GAPDH弱阳性质控品处理（同阴性质控品）
3.4EBV、MP、HCMV、GAPDH强阳性质控品处理（同阴性质控品）
3.5EBV、MP、HCMV、GAPDH阳性定量标准品处理：8000rpm离心数秒，备用。
注：DNA提取液——50mmol/LNaOH，10mmol/LTris-HCl，pH8.0，体积分数为1%TritonX-100，体积分数为1%NP-40，0.5mmol/LEDTApH8.0。
4.AllGlo探针四重荧光定量PCR：
4.1引物及探针
查阅相关的专业文献，根据文献报道获取EBV、MP、HCMV和内参特异性保守基因，登录GeneBank获取相关序列，应用Clustalw软件对所有序列比对分析，挑选最保守的基因序列用PrimerPremiers5.0软件设计引物，登录NCBI通过BLAST程序比对分析，每种病原体及内参筛选出一对特异性最强的引物和相应的特异探针（见表1）。
EBV、MP、HCMV和内参单管多重荧光定量PCR引物和相应的AllGlo探针分别由上海英骏生物技术有限公司和上海辉睿生物科技有限公司合成。为了确保多重荧光定量PCR的特异性和灵敏度，所有的引物和探针均与GenBank里的扩增靶序列进行BLAST，所有引物和探针的Tm值几乎一致。为了增加与相应病原体和内参扩增靶序列杂交的特异性，每条探针与非特异杂交序列至少有9个碱基不互补配对。采用ABI7500荧光定量PCR仪（能够同时检测5种荧光）进行多重荧光定量PCR实验。
探针采用美国AlleLogicBiosciences公司推出的最新一代荧光定量探针—
AllGlo探针。
MAR、URA、NEP、JUP均为不同波长的AllGlo探针标记荧光素。
4.2单重荧光定量PCR条件优化
采用四个引物探针比例对荧光定量PCR进行优化：50μlPCR反应体系，包括自制qPCR反应液25μl[qPCR反应缓冲液（含Mg2+）20μl、4种dNTP混合液4μl，10U/μlHotStartTaqDNA聚合酶1μl]，104Copies/μl质粒模板4μl，引物（上、下游）与相应探针分别加1μl、2μl（200nM﹕400nM），0.5μl、1μl（100nM﹕200nM），1μl、1μl（200nM﹕200nM），1μl、0.5μl（200nM﹕100nM），用双蒸水补至50μl，所有引物探针应用浓度均为10μM，每种引物探针比例均平行做三管，同时用灭菌注射用水做对照。于ABI7500荧光定量PCR仪扩增，循环条件：95℃30s，95℃5s、60℃34s（40cycles）。荧光信号的收集定为FAM（EB病毒）、ROX（肺炎支原体）、CY5（人巨细胞病毒）、VIC（内参）。实时分析软件计算扩增Ct值，以扩增Ct值统计实验结果。以获得最低的Ct值和较高的荧光强度增加值时的引物探针浓度比例为最佳。
4.3四重荧光定量PCR条件优化
根据单重荧光定量PCR条件优化实验所得结果，选择引物探针浓度比例为200nM﹕200nM和200nM﹕100nM两种比例进行四重PCR，PCR反应体系及扩增条件同上，将四种引物和探针加入同一管中，然后各管分别加入一种104Copies/μl的质粒模板4μl，阴性对照加灭菌注射用水进行单目的基因多重PCR扩增，用双蒸水补至50μl，每个反应平行做3管。另外，加入一种104Copies/μl的EBV、MP、HCMV和内参1:1:1:1混合的质粒模板4μl，阴性对照加灭菌注射用水进行多目的基因多重PCR扩增，用双蒸水补至50μl，每个反应平行做3管。以获得最低的Ct值和较高的荧光强度增加值时的引物探针浓度比例作为四重PCR标准曲线制作和其他实验的最终扩增条件。
4.4四重荧光定量PCR的特异性、敏感性试验
将已知拷贝数的含EBV、MP、HCMV和内参目的扩增片段的重组质粒，使用时连续10倍倍比稀释至浓度在101Copies/μl~108Copies/μl之间作为单基因多重荧光定量PCR的标准品；同时，将EBV、MP、HCMV和内参重组质粒1:1:1:1混合后进行10倍倍比稀释成101Copies/μl~108Copies/μl之间，作为多基因多重荧光定量PCR的标准品。取不同载量的标准品4μl作为四重荧光定量PCR的模板，同时用灭菌注射用水做对照实验，对各稀释度模板按照步骤（4.3）确立的反应体系和扩增条件同时进行荧光PCR检测，所有检测标本至少检测三次，扩增完成后用仪器自带的软件自动分析结果，从而确定该方法的最低检出限，评估肺炎支原体、人巨细胞病毒、EB病毒四重荧光定量PCR联合检测方法及其试剂盒的检测灵敏度。
4.5四重荧光定量PCR标准曲线制备
将109Copies/μlEBV、MP、HCMV和内参重组质粒等量混合均匀，稀释成含以上四种质粒（Copies/μl）103、104、105、106、107作为制备标准曲线的标准品，按照步骤（4.3）确立的反应体系和扩增条件同时进行荧光PCR检测，所有检测标本至少检测三次，扩增完成后用仪器自带软件分析结果，制备标准曲线。
4.6四重荧光定量PCR的重复性试验
将已知拷贝数的EBV、MP、HCMV和内参重组质粒混合液(104Copies/μl)平均分成10份，-20℃冷冻保存作为模板，按制备标准曲线的四重荧光定量PCR的反应体系和扩增条件进行扩增，同时按照步骤(4.5)制备标准曲线，每周检测一次，根据标准曲线仪器自动给出定量检测结果，连续5周，最后统计软件分析5次检测结果的重复性（CV%）。
4.7结果判定
4.7.1分析条件设定：根据仪器所带分析软件自动分析结果，阈值设定原则
以阈值线刚好覆盖阴性对照品扩增线和仪器噪音进行调整。
4.7.2质控标准：阴性质控品在FAM、ROX、CY5检测通道无扩增曲线和Ct值，在VIC检测通道扩增曲线有对数增长期；阳性定量参考品均为阳性，Ct值≤37，且0.97≤|r|≤1；阳性质控品全部阳性，Ct值应与标准曲线的相应标准品的Ct值相对应，并且出现典型的扩增曲线，如强阳性质控品定量参考值在106~108Copies/μl范围，弱阳性质控品定量参考值在103~105Copies/μl范围；以上要求需在同一次实验中同时满足，否则实验视为无效，需重新进行。
4.7.3结果描述及判定
A.阴性：在FAM、ROX、CY5检测通道扩增曲线无明显对数增长期或Ct值等于40，在VIC检测通道扩增曲线有对数增长期。
B.阳性及定量判断：在FAM、ROX、CY5检测通道出现典型的扩增曲线且Ct值≤37判定为阳性，且根据标准曲线自动获取定量值，表示样品中存在EBV、MP、HCMV病原体颗粒。
C.有效原则：Ct值>37的样品定量结果不可靠，需重做实验。无Ct值为阴性，有Ct值但仍>37需重新取标本复查。
4.8实施例2检测结果
4.8.1四重荧光定量PCR条件优化结果：EBV、MP、HCMV和内参标准分子(104Copies/μl)在四重荧光定量PCR体系中进行扩增后，当引物探针比例为(nM))200:200时，EBV、MP、HCMV、内参的Ct值分别为25-26、25-26、25-26、24-26；当引物探针比例为(nM)200:100时，EBV、MP、HCMV、内参的Ct值分别为24-25、25-26、24-25、25-26。
4.8.2四重荧光定量PCR的特异性、敏感性试验结果：EBV、MP、HCMV和内参标准分子在四重荧光定量PCR体系中进行扩增后，其特异性均为100%（见附图9、10）。EBV、MP、HCMV和内参在四重荧光定量PCR体系中检测灵敏度均为101Copies/μl（见附图5-8）。
4.8.3四重荧光定量PCR标准曲线制备结果：EBV、MP、HCMV和内参标准分子的标准曲线在经过优化的四重荧光定量PCR反应体系进行制备，它们的标准曲线的r2分别为0.998、0.992、0.998、0.995，扩增效率(Efficiency)分别为1.06、1.02、1.04、1.06（见附图1-4）。
4.8.4四重荧光定量PCR的重复性试验结果：相同的EBV、MP、HCMV和内参标准分子混合液(104Copies/μl)在四重荧光定量PCR体系检测5次，检测数据经对数转换后，EBV、MP、HCMV和内参5次检测的CV均小于3%，详见表2。
实施例4
1.临床标本检测
1.1本试剂盒检测
取25份临床阳性和阴性（EBV、MP、HCMV）标本。若该份标本仅有一种阳性病原体，则将每份DNA提取样本平均分成3份，1份标本用AllGlo探针单重荧光定量PCR分别检测EBV、MP、HCMV，1份标本用AllGlo探针多重荧光定量PCR单管同时检测EBV、MP、HCMV；若该份标本为临床两种或三种阳性病原体混合物，则将每份DNA提取样本平均分成2份，1份标本用AllGlo探针多重荧光定量PCR单管同时检测EBV、MP、HCMV，剩余样品置-70℃冷冻保存（以备必要时复查用）。进一步验证四重荧光定量PCR方法的特异性。在每一个检测试验中采用同管等量的DNA模板，平行两管，只有当所有平行试验结果一致时，才确定该份DNA样品的检测结果，否则需重新进行检测。
1.2现有诊断试剂检测：
上述标本与临床目前在用的EBV、MP、HCMVTaqMan单探针单重荧光定量PCR（达安分子诊断公司）技术检测结果进行比较（表3）。
1.3临床标本检测结果：25份临床标本采用三种方法检测，其结果见表3。
<110>杭州市第一人民医院
<120>检测小儿肺炎三种病原体的四重荧光定量PCR试剂盒
<160>16
<210>1
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据EB病毒（EBV）外膜糖蛋白基因设计的PCR检测上游引物序列
<400>1
GCTACGCCTTCCAGAATGAC20
<210>2
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据EB病毒（EBV）外膜糖蛋白基因设计的PCR检测下游引物序列
<400>2
TAGAGGCCTAGGTCCACAGT20
<210>3
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据EB病毒（EBV）外膜糖蛋白基因设计的AllGlo荧光定量检测探针序列
<400>3
CGCCCTACACTAGCCTGCTGGAG23
<210>4
<211>124
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据EB病毒（EBV）外膜糖蛋白基因设计的荧光定量检测标准品序列
<400>4
GCTACGCCTTCCAGAATGACAAGCTGTTGCTCCAGCAGGCTAGTGTAGGGCGGCTCACCTTGGTCAACAAGACCACCATCCTGCTGCGCCCGATGAAGACCACAACTGTGGACCTAGGCCTCTA124
<210>5
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据肺炎支原体（MP）ORF6基因设计的PCR检测上游引物序列
<400>5
AAGCAGTTTGTGGAGAATCAGC22
<210>6
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据肺炎支原体（MP）ORF6基因设计的PCR检测下游引物序列
<400>6
AGACGAGGTGGTCTTGGACA20
<210>7
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据肺炎支原体（MP）ORF6基因设计的AllGlo荧光定量检测探针序列
<400>7
AGCCAGCTTACCTCATCGCCGG22
<210>8
<211>133
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据肺炎支原体（MP）ORF6基因设计的荧光定量检测标准品序列
<400>8
AAGCAGTTTGTGGAGAATCAGCTTGGTTTTAAAGATGACTCAAATTCTTCCTTGACAAACTTCAAGAGTCAAGGCTTAACTCAGCCAGCTTACCTCATCGCCGGCCTTGACGTTGTCCAAGACCACCTCGTCT133
<210>9
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据人巨细胞病毒（HCMV）HAN22基因设计的PCR检测上游引物序列
<400>9
GCTCACGGTCCGCTATGT18
<210>10
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据人巨细胞病毒（HCMV）HAN22基因设计的PCR检测下游引物序列
<400>10
GCAGGATGATGCGAGAACG19
<210>11
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据人巨细胞病毒（HCMV）HAN22基因设计的AllGlo荧光定量检测探针序列
<400>11
CTCGACGTGTACTGCTGCCGCC22
<210>12
<211>146
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据人巨细胞病毒（HCMV）HAN22基因设计的荧光定量检测标准品序列
<400>12
GCTCACGGTCCGCTATGTCCGCTCGTGTTCCAGGGTTGGGCGTACGCCGTGTACCACCAAGGCGACATGGTCCTCATGACGCTCGACGTGTACTGCTGCCGCCAGACCTCCAGCAACACCGTCGTCGCGTTCTCGCATCATCCTGC146
<210>13
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据内参（GAPDH）人6号染色体上的GAPDHP72基因设计的PCR检测上游引物序列
<400>13
AACGGGAAACTCACTGGCAT20
<210>14
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据内参（GAPDH）人6号染色体上的GAPDHP72基因设计的PCR检测下游引物序列
<400>14
ACAGTGGTTGTTGAGGGCAA20
<210>15
<211>27
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据内参（GAPDH）人6号染色体上的GAPDHP72基因设计的AllGlo荧光定量检测探针序列
<400>15
GTGTCCCCACTGCCAATGTGTCAGTCG27
<210>16
<211>252
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据内参（GAPDH）人6号染色体上的GAPDHP72基因设计的荧光定量检测标准品序列
<400>16
AACGGGAAACTCACTGGCATGGCCTTCTGTGTCCCCACTGCCAATGTGTCAGTCGTGGACCTGATCTACCATCTGGAAAAACCTACCAAATATCATGGCATCAAGAAGGTGGTGAAGGAGGCATCAGAGGGCTCCCTCTAGGGCATCCTGGGCTACAACACCGAGCACCAGGTTGTCTCCTTCGACTTCAACAGCGACATCCATTCTTCCACCTTTGATGTTGGGGCTGGCATTGCCCTCAACAACCACTGT252

Claims (2)

1.一种检测小儿肺炎三种病原体的四重荧光定量PCR试剂盒，该试剂盒由DNA提取液、四重荧光PCR反应液、内参溶液、阴性质控品、强阳性质控品、弱阳性质控品、五个浓度的阳性定量标准品组成，其特征在于，其中四重荧光PCR反应液为四组引物、探针以及含Mg2+的qPCR反应缓冲液、四种核苷酸单体、HotStartTaqDNA聚合酶构成的混合液，阴性质控品为灭菌注射用水，强、弱阳性质控品为EBV、MP、HCMV、GAPDH等量混合的阳性质粒样品，五个浓度阳性定量标准品是由lEBV、MP、HCMV、GAPDH等量混合的质粒样品，浓度分别为103Copies/μl、104Copies/μl、105Copies/μl、106Copies/μl、107Copies/μl，内参溶液为GAPDH质粒样品，
所述的引物及其特异性定量PCR荧光探针序列如下：
EBV：
上游引物：GCTACGCCTTCCAGAATGAC
下游引物：TAGAGGCCTAGGTCCACAGT
探针：MAR-CGCCCTACACTAGCCTGCTGGAG-MAR
MP：
上游引物：AAGCAGTTTGTGGAGAATCAGC
下游引物：AGACGAGGTGGTCTTGGACA
探针：URA-AGCCAGCTTACCTCATCGCCGG-URA
HCMV：
上游引物：GCTCACGGTCCGCTATGT
下游引物：GCAGGATGATGCGAGAACG
探针：NEP-CTCGACGTGTACTGCTGCCGCC-NEP
GAPDH：
上游引物：AACGGGAAACTCACTGGCAT
下游引物：ACAGTGGTTGTTGAGGGCAA
探针：JUP-GTGTCCCCACTGCCAATGTGTCAGTCG-JUP
MAR、URA、NEP、JUP是AllGlo探针的四种不同荧光素
EBV标准品序列：
GCTACGCCTTCCAGAATGACAAGCTGTTGCTCCAGCAGGCTAGTGTAGGGCGGCTCACCTTGGTCAACAAGACCACCATCCTGCTGCGCCCGATGAAGACCACAACTGTGGACCTAGGCCTCTA
MP标准品序列：
AAGCAGTTTGTGGAGAATCAGCTTGGTTTTAAAGATGACTCAAATTCTTCCTTGACAAACTTCAAGAGTCAAGGCTTAACTCAGCCAGCTTACCTCATCGCCGGCCTTGACGTTGTCCAAGACCACCTCGTCT
HCMV标准品序列：
GCTCACGGTCCGCTATGTCCGCTCGTGTTCCAGGGTTGGGCGTACGCCGTGTACCACCAAGGCGACATGGTCCTCATGACGCTCGACGTGTACTGCTGCCGCCAGACCTCCAGCAACACCGTCGTCGCGTTCTCGCATCATCCTGC
GAPDH标准品序列：
AACGGGAAACTCACTGGCATGGCCTTCTGTGTCCCCACTGCCAATGTGTCAGTCGTGGACCTGATCTACCATCTGGAAAAACCTACCAAATATCATGGCATCAAGAAGGTGGTGAAGGAGGCATCAGAGGGCTCCCTCTAGGGCATCCTGGGCTACAACACCGAGCACCAGGTTGTCTCCTTCGACTTCAACAGCGACATCCATTCTTCCACCTTTGATGTTGGGGCTGGCATTGCCCTCAACAACCACTGT；
其中强阳性质控品浓度107Copies/μl，弱阳性质控品浓度103Copies/μl。
2.根据权利要求1所述的一种检测小儿肺炎三种病原体的四重荧光定量PCR试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒保存于-20℃。
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