CN105543414A - 一种呼吸道合胞病毒a/b亚型多重荧光定量pcr检测引物组和探针组及其试剂盒和制备方法 - Google Patents

一种呼吸道合胞病毒a/b亚型多重荧光定量pcr检测引物组和探针组及其试剂盒和制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种呼吸道合胞病毒A/B亚型多重荧光定量PCR检测引物组和探针组及其试剂盒和制备方法。所述引物组序列如SEQ？ID？NO：1-4所示，所述探针组序列如SEQ？ID？NO：5-6所示。本发明还提供了一种呼吸道合胞病毒A/B亚型多重荧光定量PCR检测试剂盒，包括反应管、酶混合物、引物组和探针组，所述引物组的序列如SEQ？ID？NO：1-4所示，所述探针组的序列如SEQ？ID？NO：5-6所示。该引物组和探针组及其试剂盒能实现呼吸道合胞病毒A/B亚型的简便分型，具有特异性高、灵敏度高、快速、操作简单方便、成本低廉等多种优点。

Description

一种呼吸道合胞病毒A/B亚型多重荧光定量PCR检测引物组和探针组及其试剂盒和制备方法
技术领域
本发明属于分子生物学检测技术领域，具体涉及一种呼吸道合胞病毒A/B亚型多重荧光定量PCR检测引物组和探针组及其试剂盒和制备方法。
背景技术
呼吸道感染一直是困扰人类最常见、发生率最高的疾病，是引起老人和儿童因病死亡最多病因，也是新发和突发传染病的最主要病源因素。每年急性呼吸道感染在发展中国家导致四至五百万的儿童死亡，死亡的主要病因是肺炎。其中呼吸道合胞病毒(RSV,respiratorysyncytialvirus)是最常见的致儿童肺炎的病原体之一。
RSV是属于副粘病毒科的负链RNA病毒，可表达11种蛋白。它可以感染有纤毛的气道上皮细胞并快速的导致细胞损伤，是儿童中最重要的导致毛细支气管炎和肺炎的病原体。在北京，48％的病毒性肺炎和58％的毛细支气管炎系由RSV引起(1980～1984)，在美国，20％～25％的婴幼儿肺炎和50％～75％的毛细支气管炎由RSV引起。根据我们呼吸疾病国家重点实验室对广州地区2009年7月至2012年6月三年的监测结果发现在14岁以下儿童急性呼吸道疾病患者中RSV阳性率最高，占病原阳性患者的32.5％。
RSV根据其抗原性的差异分为A(RSV-A)和B(RSV-B)两个主要的抗原亚型，两种亚型独立传播。对于两种亚型RSV感染患者的临床特征的研究一直是RSV感染研究的重要的方向，对其的研究将为RSV感染的治疗及疫苗的开发提供路径，具有极为重要的意义。
鉴于RSV感染的严重性，急需对其进行有效的防控与治疗。而在进行防控和治疗的过程中，首先最关键瓶颈就是准确、实用的快速检测鉴定技术。
就目前情况，对RSV-A/B亚型分型检测主要以下几种方法：病毒分离；抗原-抗体反应；普通RT-PCR/巢式PCR；单重荧光定量PCR。相比较几种方法，前两种方法为经典方法，但存在要求条件高、周期长、灵敏度不高的问题；PCR方法是近些年来所开发的针对病原体核酸的检测方法，克服了前面两种方法中存在的周期长、灵敏度不高的问题，特别是荧光定量PCR方法的引进，解决了PCR方法容易产生假阳性的问题，使其得到了快速的发展，该方法具有高特异性、高灵敏度、周期短等多种优点。但目前开发的RSV-A/B检测试剂基本都为单重荧光定量PCR检测试剂，操作繁琐、费时耗力，同时由于单重试剂无法对样品采集与样品核酸提取成功与否进行有效监控，具有一定的局限性。
发明内容
为克服上述技术缺陷，本发明提供了一种呼吸道合胞病毒A/B亚型多重荧光定量PCR检测引物组和探针组及其试剂盒和制备方法。该引物组和探针组及其试剂盒能实现呼吸道合胞病毒A/B亚型的简便分型，具有特异性高、灵敏度高、快速、操作简单方便、成本低廉等多种优点。
本发明所述引物组序列如SEQIDNO：1-4所示，所述探针组序列如SEQIDNO：5-6所示。
本发明还提供了一种呼吸道合胞病毒A/B亚型多重荧光定量PCR检测试剂盒，包括反应管、酶混合物、引物组和探针组，所述引物组的序列如SEQIDNO：1-4所示，所述探针组的序列如SEQIDNO：5-6所示。
本发明还提供了一种呼吸道合胞病毒A/B亚型多重荧光定量PCR检测试剂盒的制备方法，其制备方法包括：
(1)步骤一：制备引物
制备RSV-A、RSV-B的特异性引物及阳性对照beta-actin的特异性引物；
RSV-A、RSV-B的特异性引物序列如SEQIDNO：1-4所示；
阳性对照beta-actin的特异性引物序列如SEQIDNO：7-8所示；
(2)步骤二：制备探针
制备RSV-A、RSV-B的特异性探针及阳性对照beta-actin的特异性探针，其中探针分别采用FAM-BHQ1、Texasred-BHQ2、JOE-BHQ1标记；
RSV-A、RSV-B的特异性探针序列如SEQIDNO：5-6所示；
阳性对照beta-actin的特异性探针序列如SEQIDNO：9所示；
(3)步骤三：制备RT-PCR反应体系
RT-PCR缓冲液：PrimeScript一步法RT-PCR试剂盒中的RT-PCR缓冲液；
引物使用量：7-15pmol；
探针使用量：0.5-5pmol；
上述引物探针缓冲液混合物的配制：18μl/反应
酶混合物：2μl；
模板：5μl；
反应总体积：25μl。
与现有技术相比，本方法采用多重荧光PCR的方法对RSV-A/B亚型进行同时检测，通过加入beta-actin内对照检测监测样品采集及提取情况，具有特异性高、灵敏度高、快速、操作简单方便、成本低廉等多种优点，可作为RSV-A/B亚型病毒检测的试剂，用于科研及临床应用。
附图说明
图1RSV-A/B多重检测试剂中RSV-A灵敏度图谱；
图2RSV-A/B多重检测试剂中RSV-B灵敏度图谱；
图3RSV-A/B多重检测试剂中Beta-actin灵敏度图谱；
图4RSV-A/B多重检测试剂标准曲线。
具体实施方式
为使本发明更加容易理解，下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围，下列实施例中未提及的具体实验方法，通常按照常规实验方法进行。
实施例1：RSV-A、RSV-B及内参beta-actin引物探针设计及特异性实验
1、引物探针
本方法采用taqman探针技术。通过Genebank中RSV-A、RSV-B的基因序列及beta-actin基因序列资料，分别对RSV-A、RSV-B及beta-actin进行引物探针设计，其中探针分别采用FAM-BHQ1、Texasred-BHQ2、JOE-BHQ1标记。表1为RSV-A、RSV-B及beta-actin引物及探针序列表。
表1
2、对照样品
实验采用培养分离的阳性株或临床株进行，阳性株来源于广州呼吸疾病研究所、呼吸疾病国家重点实验。RSV-A、RSV-B作为阳性对照，同时使用流感A、流感B、副流感1、副流感2、副流感3、腺病毒ADV、鼻病毒HRV、偏肺病毒HMP、冠状病毒229E、OC43、肺炎支原体MP、肺炎衣原体CP作为阴性对照，使用E.coli作为beta-actin阴性对照。
3、制备模板
实验分别取100μl培养物标本，通过常规RNA/DNA提取方法提取，得到50μl核酸产物，使用DEPC水对核酸提取产物100倍稀释后作为模板(其中冠状病毒及偏肺病毒产物稀释10倍)。
4、反应体系
使用‘PrimeScript一步法RT-PCR试剂盒(Ver.2)’(TAKARA‘PrimeScriptOneStepRT-PCRKitVer.2’)中的RT-PCR缓冲液进行试剂配制，其中
引物使用量为7-15pmol
探针使用量为0.5-5pmol
反应总体积为25μl；
配制试剂体积18μl/反应(预留2μl用于添加酶混合物；预留5μl用于添加模板)。
5、RSV-A、RSV-B和beta-actin单重荧光PCR反应
为验证所设计的引物和探针的特异性，首先设计单重荧光PCR反应，对引物和探针进行评估，即分别检测RSV-A、RSV-B和beta-actin三组引物及相应探针单独反应的特异性。在八排管中分别加入18μLRSV-A、RSV-B和beta-actin的单重反应液，最后放置于荧光定量PCR仪中反应。
反应条件如下：50℃30分钟，94℃2分钟，热循环为94℃10秒，55℃35秒，共40个循环。
表2为RSV-A、RSV-B及beta-actin单重试剂特异性实验结果。可见单重RSV-A、RSV-B和beta-actin试剂检测70株阳性病毒样品的情况，其中RSV-A15株、RSV-B15株、流感A8株(H3N24株、H1N14株)、流感B8株，另外有副流感1、副流感2、副流感3、腺病毒ADV、鼻病毒HRV、偏肺病毒HMP、冠状病毒229E、OC43、肺炎支原体MP、肺炎衣原体CP各2株、同时有E.coliTOP102株、E.coliDH5а2株作为阴性对照。实验结果见表2所示：
表2
单重试剂检测结果 RSV-A RSV-B beta-actin
阳性 15 15 66
阴性 55 55 4
总计 70 70 70
实验结果中，阳性结果与预期完全符合，与其他常见呼吸道病原体流感A、流感B、副流感1、副流感2、副流感3、腺病毒ADV、鼻病毒HRV、偏肺病毒HMP、冠状病毒229E、OC43、肺炎支原体MP、肺炎衣原体CP等无交叉反应，RSV-A、RSV-B之间亦无交叉反应，特异性高。
实施例二：RSV-A/B多重试剂的特异性实验
为检验所设计的引物探针是否特异，配制RSV-A、RSV-B、beta-actin三重检测试剂并使用实验室中的多种阳性病毒株进行验证，具体实施如下：使用PrimeScriptOneStepRT-PCRKitVer.2试剂盒(TAKARA)的一步法RT-PCR试剂作为三重试剂反应试剂进行配制。
反应总体积为25μl；其中：
引物使用7-15pmol，
探针使用0.5-5pmol，
配制试剂体积18μl/反应(预留2μl用于添加酶混合物；5μl模板)。
反应条件如下：50℃30分钟，94℃2分钟，热循环为94℃10秒，55℃35秒，共40个循环。荧光收集分别为FAM/Texasred/JOE。仪器为ABI7500荧光定量PCR仪(AppliedBiosystems)。
分别使用单阳性模板(RSV-A或RSV-B各两例分别标记为A1/A2)；双阳性模板(RSV-A和RSV-B混合模板标记为A1/B1和A2/B2)对多重检测试剂进行实验，同时使用单重荧光PCR试剂进行对比。实验结果见表3，表3是RSV-A/B多重检测试剂特异性实验结果，可见各种模板情况下多重检测试剂与单重检测的对比结果。
表3
从表3的实验数据可看出，多重检测试剂的特异性与单重相比基本没有什么差异，同时从CT值的表现来看，多重检测试剂与单重检测基本一致。
实施例三：RSV-A/B多重检测试剂的灵敏性实验
为进一步检验试剂的灵敏性，使用体外转录含有目标片段的RNA作为灵敏度检测的模板，具体操作如下：
1.使用带有T7启动子序列的引物进行PCR，扩增含有目标区域的核酸片段，见表4，表4为RSV-A、RSV-B及beta-actin体外转录目标片段扩增用引物列表。
表4
2.使用TranscriptAidT7HighYieldTranscriptionKit(Thermo)并以上一步中得到的还有T7启动子序列的PCR产物为模板，体外转录获得目标片段RNA，根据试剂盒说明书方法去除DNA，并使用Trizol纯化获得目标RNA片段；
3.使用高灵敏度的nanodrop分光光度计(NanodropTechnologies)检测所获得RNA的浓度，并根据片段长度-分子量计算得出其单位体积中的拷贝数；
4.10倍梯度稀释RNA模板，使用12个梯度(5×1011—5拷贝)进行多重试剂的灵敏度测试。
实验图图谱见图1、2、3、4所示。图1RSV-A/B多重检测试剂中RSV-A灵敏度图谱，图2RSV-A/B多重检测试剂中RSV-B灵敏度图谱，图3RSV-A/B多重检测试剂中Beta-actin灵敏度图谱，图4RSV-A/B多重检测试剂标准曲线。从实验结果中得出，RSV-A/B多重检测试剂具有很好的灵敏度，扩增模板浓度跨度大，其中RSV-A在50—5×1010拷贝模板具有良好的线性(R2＝0.9973)；RSV-B在500—5×1011拷贝模板具有良好的线性(R2＝0.9984)；beta-actin在500—5×1010拷贝模板具有良好的线性(R2＝0.9989)，同时从三者标准曲线中看出，扩增效率基本一致，有利于结果的判读。
实施例四：RSV-A/B多重检测试剂临床标本检测实验
使用单重和RSV-A/B多重检测试剂对2014年3月-5月785份咽拭子临床标本(标本来源于广州医科大学附属第一医院、广州呼吸疾病研究所、呼吸疾病国家重点实验室)，同时进行病毒培养分离鉴定。结果见表5，表5为785份临床咽拭子使用RSV-A/B单重、多重和病毒分离检测的结果。
表5
从上面的实验表明，本实验所研发的RSV-A/B多重检测试剂，灵敏度高于病毒培养鉴定，可以用于科研及临床工作，用一管反应检测RSV-A/B，达到灵敏、快速、准确、节约的目的。
最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。

Claims (3)

1.一种呼吸道合胞病毒A/B亚型多重荧光定量PCR检测引物组和探针组，其特征在于，所述引物组序列如SEQIDNO：1-4所示，所述探针组序列如SEQIDNO：5-6所示。
2.一种呼吸道合胞病毒A/B亚型多重荧光定量PCR检测试剂盒，包括反应管、反应混合物、引物组和探针组，其特征在于，所述引物组的序列如SEQIDNO：1-4所示，所述探针组的序列如SEQIDNO：5-6所示。
3.一种呼吸道合胞病毒A/B亚型多重荧光定量PCR检测试剂盒的制备方法，其特征在于，其制备方法包括：
(1)步骤一：制备引物
制备RSV-A、RSV-B的特异性引物及阳性对照beta-actin的特异性引物；
所述RSV-A、RSV-B的特异性引物序列如SEQIDNO：1-4所示；
所述阳性对照beta-actin的特异性引物序列如SEQIDNO：7-8所示；
(2)步骤二：制备探针
制备RSV-A、RSV-B的特异性探针及阳性对照beta-actin的特异性探针，其中探针分别采用FAM-BHQ1、Texasred-BHQ2、JOE-BHQ1标记；
所述RSV-A、RSV-B的特异性探针序列如SEQIDNO：5-6所示；
所述阳性对照beta-actin的特异性探针序列如SEQIDNO：9所示；
(3)步骤三：制备RT-PCR反应体系
RT-PCR缓冲液：PrimeScript一步法RT-PCR试剂盒中的RT-PCR缓冲液；
引物使用量：7-15pmol；
探针使用量：0.5-5pmol；
上述引物探针缓冲液混合物的配制：18μl/反应
酶混合物：2μl；
模板：5μl；
反应总体积：25μl。
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