CN116200537A - 一种呼吸道合胞病毒a型全基因组测序方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种呼吸道合胞病毒A型全基因组测序方法，该方法针对呼吸合胞病毒A型进行设计覆盖基因全长的引物，引物共有25对，其中在第1对引物中添加了一条正向引物序列，引物选自于由SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.51表示的寡核苷酸序列。上述引物组合对呼吸道合胞病毒A型具有特异性，且对于呼吸合胞病毒A型的亚型具有通用性，上述引物组合可实现在一个PCR反应体系中进行多重PCR一步扩增呼吸道合胞病毒A型的全基因组，灵敏度高，可快速构建呼吸道合胞病毒基因组文库，并适用于二代测序和三代测序。

Description

一种呼吸道合胞病毒A型全基因组测序方法

技术领域

本发明属于生物医药领域，涉及一种呼吸道合胞病毒A型全基因组测序方法。

背景技术

呼吸道合胞病毒(Respiratory syncytial virus,RSV)是婴幼儿急性呼吸道感染的主要病原体，引起的疫情通常爆发于冬季和春季。呼吸道合胞病毒属于副粘病毒科，是一种单链负义RNA病毒，基因组由10个基因组成，从3＇端到5＇端基因组序列依次为NS1-NS2-N-P-M-SH-G-F-M2-L。基于G蛋白基因序列，将呼吸道合胞病毒分为A和B两种分型，其中A型被细分为14个亚型。在特定地区特定流行病期间，RSVA和RSV B交替流行。有研究表明RSV A型中的GA2亚型为优势亚型，RSV A型似乎在世界各地均比RSV B型占优势。呼吸道合胞病毒最显著的特征之一是其再感染率高，在同一流行期间，或连续或非连续流行中，可发生同一型或同一亚型病毒二次感染(同源再感染)和不同型或不同亚型病毒(异源再感染)，异源再感染比同源再感染更容易发生。根据有关文献报道，估计2019年全球有3300万RSV相关急性下呼吸道感染事件发生，360万RSV相关急性下呼吸道感染住院病例，26300RSV相关急性下呼吸道感染住院死亡病例，其中在0-5岁婴幼儿中，有660万RSV相关急性下呼吸道感染事件发生，140万RSV相关急性下呼吸道感染住院病例，13300RSV相关急性下呼吸道感染住院死亡病例。2％的0-5岁和3.6％的28天-5岁的婴幼儿的死亡可归因于RSV。截至目前，尚无安全有效的RSV感染治疗药物上市，但有4种抗RSV药物正在临床开发阶段。同样尚无安全有效RSV疫苗上市，但已有疫苗进入后期临床开发阶段，包括单克隆抗体nirsevimab、两种母体疫苗(RSV MAT和RSVpreF)和另一种单克隆抗体MK-1654。

目前对呼吸道合胞病毒的检测方法包括病毒分离、抗原检测、抗体检测、核酸检测以及基因测序。其中病毒分离相较困难，且敏感性低。目前主要针对病毒G、F基因片段进行测序分型，全基因组测序相较其他检测方式来说能够获得病毒的全基因组序列，从而起到分型鉴定、溯源以及变异分析等作用，能更全面地了解RSV的进化过程和病理生物学，并识别基因组可变区和保守区，认识其遗传多样性，以指导诊断工具和疫苗的开发。目前市面上一些RSVA型的引物的扩增效率差、多重PCR扩增时引物之间影响大影响了对RSV A基因组的检测，因此开发一种全基因组测序的方法具有重要的意义。

发明内容

为了弥补现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种检测呼吸道合胞病毒A型全基因组的测序方法，通过对NCBI数据库获取的RSV A型全基因组进行比对，找取其中具有特异性且保守性较高的区域，设计并优化筛选能够覆盖RSV A型全基因组的通用引物并将引物按照二代测序或三代测序的建库方案进行建库。为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明的第一方面提供了一种呼吸道合胞病毒A型全基因组扩增引物组，其特征在于，所述引物组包括长度为20-30bp的用于扩增不同基因的寡核苷酸片段。

进一步，所述引物组包括25对引物。

进一步，所述25对引物的序列如SEQ ID NO.2-51所示。

进一步，所述引物组还包括1条正向引物。

进一步，所述正向引物的序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明的第二方面提供了一种用于呼吸道合胞病毒A型全基因组检测的引物组，所述引物组在本发明第一方面所述的引物组的基础上，将其中一个或多个引物中的一个或多个碱基替换为简并碱基。

本发明的第三方面提供了一种检测呼吸道合胞病毒A型全基因组的多重PCR检测产品，所述产品包括本发明第一方面或本发明第二方面所述的引物组。

进一步，所述产品包括芯片、核酸膜条、试剂盒。

进一步，所述试剂盒还包括PCR扩增缓冲液、扩增酶、cDNA/DNA模板。

进一步，所述扩增酶包括DNA聚合酶和/或RNA聚合酶。

进一步，所述DNA聚合酶包括Taq DNA聚合酶、Pfu DNA聚合酶、KOD DNA聚合酶、Q5高保真DNA聚合酶、Q5热启动超保真DNA聚合酶、Phanta高保真DNA聚合酶、VAHTS HiFi DNA聚合酶。

进一步，所述扩增酶包括Q5高保真DNA聚合酶和/或Q5热启动超保真DNA聚合酶。

进一步，所述试剂盒包括Q5热启动超保真DNA聚合酶及相适配的扩增缓冲液、cDNA/DNA模板。

进一步，所述试剂盒还包括反转录的反应体系。

进一步，所述反转录的反应体系包括引物。

进一步，所述引物为随机引物。

进一步，所述反转录的反应体系还包括反转录缓冲液、反转录酶、核糖核酸酶抑制剂。

进一步，所述反转录缓冲液包括M-MLV反转录缓冲液、

ⅢReverseTranscriptase Buffer、/>

V Buffer、SSIV RT Buffer。

进一步，所述反转录缓冲液选自SSIV RT Buffer。

进一步，所述反转录酶包括M-MLV RT酶、HIV RT酶、ASLV RT酶、RSV RT酶、AMV RT酶、MCAV RT酶、REV-A RT酶、UR2AV RT酶、YAV RT酶、RAV RT酶、MAV RT酶、SSIV RT酶。

进一步，所述反转录酶包括SSIV RT酶。

进一步，所述反转录的反应体系还包括DTT。

进一步，所述反转录的反应体系包括随机引物、SSIV RT Buffer、SSIV RT酶、核糖核酸酶抑制剂、DTT。

本发明的第四方面提供了一种针对呼吸道合胞病毒A型全基因组的扩增方法，所述方法包括使用本发明第一方面或第二方面所述的引物组进行扩增。

进一步，所述引物分成Pool-1和Pool-2两组。

进一步，所述Pool-1引物包括SEQ ID NO.1-3、6-7、10-11、14-15、20-21、24-25、28-29、32-33、38-39、42-43、46-47、50-51所示的引物，Pool-2引物包括SEQ ID NO.4-5、8-9、12-13、16-19、22-23、26-27、30-31、34-37、40-41、44-45、48-49所示的引物。

进一步，所述方法为PCR扩增方法。

进一步，所述PCR扩增的试剂还包括PCR扩增缓冲液、扩增酶、cDNA/DNA模板。

进一步，所述扩增酶包括DNA聚合酶和/或RNA聚合酶。

进一步，所述DNA聚合酶包括Taq DNA聚合酶、Pfu DNA聚合酶、KOD DNA聚合酶、Q5高保真DNA聚合酶、Q5热启动超保真DNA聚合酶、Phanta高保真DNA聚合酶、VAHTS HiFi DNA聚合酶。

进一步，所述扩增酶包括Q5高保真DNA聚合酶和/或Q5热启动超保真DNA聚合酶。

进一步，所述PCR扩增的试剂包括引物组、Q5热启动超保真DNA聚合酶及相适配的扩增缓冲液、cDNA/DNA模板。

进一步，所述PCR扩增的反应条件为：步骤一98℃30s循环1次，步骤二98℃15s、63℃5min循环5次，步骤三98℃15s、65℃4min循环22-30次，步骤四72℃2min循环1次，步骤五4℃Hold循环1次。

进一步，所述方法还包括对扩增产物进行磁珠纯化。

进一步，所述方法还包括从待测样本中提取呼吸道合胞病毒的核酸。

进一步，所述方法还包括对病毒核酸进行反转录，获得反转录产物。

进一步，所述反转录的反应体系包括引物。

进一步，所述引物为随机引物。

进一步，所述反转录的反应体系还包括反转录缓冲液、反转录酶、核糖核酸酶抑制剂。

进一步，所述反转录缓冲液包括M-MLV反转录缓冲液、

ⅢReverseTranscriptase Buffer、/>

V Buffer、SSIV RT Buffer。

进一步，所述反转录缓冲液选自SSIV RT Buffer。

进一步，所述反转录酶包括M-MLV RT酶、HIV RT酶、ASLV RT酶、RSV RT酶、AMV RT酶、MCAV RT酶、REV-A RT酶、UR2AV RT酶、YAV RT酶、RAV RT酶、MAV RT酶、SSIV RT酶。

进一步，所述反转录酶包括SSIV RT酶。

进一步，所述反转录的反应体系还包括DTT。

进一步，所述反转录的反应体系包括随机引物、SSIV RT Buffer、SSIV RT酶、核糖核酸酶抑制剂、DTT。

进一步，所述反转录的反应条件为：步骤一42℃50min循环1次，步骤二72℃10min循环1次，步骤三5℃Hold循环1次。

本发明第五方面提供了一种呼吸道合胞病毒A型全基因组测序的方法，所述方法包括使用本发明第一方面或第二方面所述的引物组进行扩增获得扩增产物，使用扩增产物构建文库进行测序。

进一步，所述文库包括二代测序文库、三代测序文库。

进一步，所述二代测序文库选择TruePrep DNA Library Prep Kit V2 forIllumina、TruePrep Index Kit V2 for Illumina构建文库。

进一步，所述三代测序文库选择Ligation sequencing kit和Native BarcodingExpansion 1-12构建文库。

进一步，所述方法还包括对文库进行质检。

本发明第六方面提供了本发明第一方面或第二方面所述的引物组在呼吸道合胞病毒A型全基因组扩增或测序中的应用。

本发明的优点和有益效果：

本发明通过对NCBI数据库获取的RSV A型全基因组进行比对，找取其中具有特异性且保守性较高的区域，设计了能够覆盖RSV A型全基因组的通用引物。本发明通过对引物序列及扩增条件如引物浓度、反应条件等进行调整优化，使得各引物对的扩增效率相当，减少多重PCR扩增时引物之间的相互影响，使得RSV A型基因组98％以上的区域在两个不同引物池中进行多重PCR。对PCR产物纯化回收后，按照二代测序或三代测序的建库方案进行建库，实现RSVA型在不同平台的全基因组测序。该方法较宏基因组测序法极大地提高了测序效率。

附图说明

图1是在二代测序中CT值约为25的RSV A临床样本的全基因组序列覆盖度分布图；

图2是在二代测序中CT值约为32的RSV A临床样本的全基因组序列覆盖度分布图；

图3是在三代测序中CT值约为25的RSV A临床样本的全基因组序列覆盖度分布图；

图4是在三代测序中CT值约为32的RSV A临床样本的全基因组序列覆盖度分布图。

图5是使用初步设计的引物对CT值约为25的RSV A临床样本进行扩增获得的全基因组序列覆盖度分布图。

图6是使用初步设计的引物对CT值约为32的RSV A临床样本进行扩增获得的全基因组序列覆盖度分布图。

图7是在宏基因组测序中CT值约为25的RSV A临床样本的全基因组序列覆盖度分布图。

图8是在宏基因组测序中CT值约为32的RSV A临床样本的全基因组序列覆盖度分布图。

具体的实施方式

下文提供了本说明书中使用的一些术语的定义。除非另有说明，本文中使用的所有技术和科学用语通常具有和本发明所属领域的普通技术人员通常理解的意思相同的意思。

术语“扩增”是指增加样品中靶核酸序列拷贝数的体外方法。示例性的引物延伸反应包括但不限于PCR。除非明确说明，“扩增”指的是单个复制，或算术、对数或指数扩增。扩增反应通常由允许连续变性、退火和引物延伸循环的多轮重复温度循环组成。扩增反应包括聚合酶链式反应(PCR)、逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)、转录介导的扩增(TMA)、连接酶链式反应(LCR)、链置换扩增(SDA)和基于核酸序列的扩增(NASBA)。其中，本发明所述的扩增是PCR反应，PCR需要在扩增前将RNA逆转录成DNA(RT-PCR)。

通常，PCR反应涉及一系列重复20-35次的热循环，所述循环包括变性步骤、引物退火步骤和延伸/延长步骤。PCR反应常常以5-100μl的反应体积在小反应管中于热循环仪中进行。在本发明中，变性步骤在98℃使核酸能够完全变性，这一步骤产生单链DNA；引物退火步骤通常在比引物-靶序列DNA双链体的解链温度低，在4℃的温度下进行，在这一步骤中，寡核苷酸引物特异性结合于单链靶序列；延伸步骤在72℃进行，但这依赖于所用的DNA聚合酶。

术语“扩增引物”或“引物”指的是寡核苷酸，其能够与邻近靶序列的RNA或DNA区位点特异性地退火，并作为合适条件下DNA合成的起始引物，在所述条件下引物延伸产物的合成被诱导，例如，在存在核苷酸和如DNA-依赖性DNA聚合酶的聚合诱导剂，以及合适的温度、pH、金属浓度和盐浓度的情况下。通常，PCR反应使用一对扩增引物，也称为“引物对”，包括“上游”或“正向”(可以用简写“F”表示)引物和“下游”或“反向”引物(可以用简写“R”表示)，其限定了待扩增的RNA或DNA的区域。

术语“扩增引物组”或“引物组”是指多个不同引物或多个不同引物对的混合物，用于在一个扩增反应中同时扩增靶序列上的不同位点。在本发明中，扩增引物组为根据所选择的待检测的呼吸道合胞病毒A型基因设计的特异性针对呼吸道合胞病毒A型全基因组的引物组。

术语“简并碱基”包括，但不限于，不遵循沃森-克里克碱基对规则而是可以结合四种规范碱基A、T/U、C、G)中的至少两种但不是所有四种的核苷酸碱基。“简并碱基”也可以称为“摆动碱基”；这些术语在本发明中可互换使用。

术语“多重PCR”指出于在单个反应中扩增两种或更多种DNA序列的目的，使用超过一套引物在自单一来源(例如个体)获得的核酸上进行的单个PCR反应。

术语“试剂盒”是指用于传递材料的任何传递系统，包括用于研究和临床应用的试剂盒。

本发明中所述的试剂盒包括检测呼吸道合胞病毒A型基因的试剂，以及选自下组的一种或多种物质：容器、使用说明书、阳性对照物、阴性对照物、缓冲剂、助剂或溶剂。试剂盒的组分可以以水介质的形式或以冻干的形式来包装。试剂盒中适当的容器通常至少包括一种小瓶、试管、长颈瓶、宝特瓶、针筒或其它容器，其中可放置一种组分，并且优选地，可进行适当地等分。在试剂盒中存在多于一种的组分时，试剂盒中通常也将包含第二、第三或其它附加的容器，其中分离地放置附加的组分。然而，不同组合的组分可被包含在一个小瓶中。本发明的试剂盒通常也将包括一种用于容纳反应物的容器，密封以用于商业销售。这种容器可包括注模或吹模的塑料容器，其中可保留所需的小瓶。

术语“扩增缓冲液”是指被添加到扩增反应中以控制扩增反应并因此改变扩增反应中至少一个要素的稳定性、活性和/或生命周期(lifecycle)的复合物(混合物、化合物，compound)。扩增缓冲液可以与PCR扩增和RNase H切割活性相容。例如，缓冲液的实例包括含有4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙烷磺酸(HEPES)、3-(N-吗啉代)丙烷磺酸(MOPS)、乙酸盐或磷酸盐的缓冲液，但不限于此。

PCR扩增缓冲液包括大肠杆菌DNA聚合酶I、klenow片段、Bst DNA聚合酶、Phi29DNA聚合酶、逆转录酶、Tth DNA聚合酶、Taq DNA聚合酶、Pfu DNA聚合酶、KOD DNA聚合酶、Q5高保真DNA聚合酶、Q5热启动超保真DNA聚合酶、Phanta高保真DNA聚合酶或VAHTS HiFi DNA聚合酶所适配的缓冲溶液、TruePrep Amplify Buffer，主要成分包括10-500mM Tris-HCl，10-500mM KCl，0.1-100mM醋酸钾、0.1-100mM硫酸铵的混合物，另外包含BSA、Triton X-100等成分，pH在7.5-9.0之间。

术语“扩增酶”是指可以催化现有的DNA或RNA模板产生多核苷酸或核酸的酶，包括TaqDNA聚合酶、Pfu DNA聚合酶、KOD DNA聚合酶、Q5高保真DNA聚合酶、Q5热启动超保真DNA聚合酶、Phanta高保真DNA聚合酶、VAHTS HiFi DNA聚合酶、TruePrepAmplify Enzyme。在本发明中，扩增酶选自Q5热启动超保真聚合酶。

术语“高保真DNA聚合酶”是指掺入错误率低且具有校正活性的DNA聚合酶，以保证目的DNA的忠实复制。术语“高保真”是指错误率小于4.45×10^-6(例如，小于4.0×10^-6、3.5×10^-6、3.0×10^-6、2.5×10^-6、2.0×10^-6、1.5×10^-6、1.0×10^-6、0.5×10^-6)突变/nt/加倍。可以利用本领域已知的测定方法来测量DNA聚合酶的保真性或错误率。

术语“热启动超保真DNA聚合酶”是已被修饰的掺入错误率更低且具有校正活性的DNA聚合酶，通常通过添加不耐热的分子实体以提高所引发DNA多核苷酸可以进行可检测的聚合时的温度。热启动DNA聚合酶可以进行可检测水平的DNA聚合的温度优选接近聚合酶的最佳催化温度。

热启动超保真DNA聚合酶用于延伸和/或扩增。术语“热启动”通常是指当反应混合物保持在第一温度(通常为较低温度)时限制必需反应组分(例如聚合酶)的可用性的手段，直到达到第二温度(通常为较高温度)才能允许必需组分参与反应。热启动反应通常涉及在第一(例如较低)温度下温育，然后升高至允许进行期望反应的第二(例如较高)温度。通过在等于或高于引物杂交(退火)温度的温度下温育反应混合物，可以实现热启动反应的激活。使用等于或高于引物杂交温度的温度可以确保引物结合特异性。恢复酶活性所需的温育时长取决于反应混合物的温度和pH值以及酶的稳定性。可以使用宽范围的温育条件；可以根据经验确定每个反应的最佳条件。可以可选地将溶液加热至第一温度并在第一温度下保持适于核酸聚合酶的热启动活化的第一时间段。

术语“反转录”也称为“逆转录”是以RNA为模板合成DNA的过程，即RNA指导下的DNA合成。此过程中，核酸合成与转录(DNA到RNA)过程与遗传信息的流动方向(RNA到DNA)相反，故称为逆转录。逆转录过程是病毒的复制形式之一，如RNA病毒中的逆转录病毒，DNA病毒中的拟逆转录病毒的复制均需要经过逆转录。逆转录过程在真核细胞中也同样存在，例如逆转座子和端粒DNA的延长均存在逆转录过程，需逆转录酶的催化，端粒酶即为真核细胞中的逆转录酶。逆转录过程的揭示是分子生物学研究中的重大发现，是对中心法则的重要修正和补充。人们通过体外模拟该过程，以样本中提取的RNA为模板，在逆转录酶的作用下，合成出互补的cDNA，构建cDNA文库，并从中筛选特异的目的基因。

术语“反转录产物”也称为“逆转录产物”是指cDNA/DNA模板，该过程需要的原料应该是4种游离的脱氧核苷酸(胞嘧啶脱氧核苷酸、鸟嘌呤脱氧核苷酸、胸腺嘧啶脱氧核苷酸、腺嘌呤脱氧核苷酸)。

术语“反转录酶”指的是经本发明所述的方法或本领域已知的方法测定展现出反转录活性的任何酶。“反转录酶”包括但不限于M-MLV RT酶、HIV RT酶、ASLV RT酶、RSV RT酶、AMV RT酶、MCAV RT酶、REV-A RT酶、UR2AV RT酶、YAV RT酶、RAV RT酶、MAV RT酶、SSIVRT酶。在本发明中，“反转录酶”选自SSIV RT酶。

术语“磁珠纯化”利用利息交换吸附材料吸附核酸，从而将核酸和蛋白质等其细胞中其他物质分离。

术语“全基因组测序”是指确定样品中每个DNA链的DNA序列的实验室过程。所得序列可以称为“原始测序数据”或“读数”。

术语“测序文库”是指包含来自单一生物体的全基因组DNA的DNA片段混合物，其用于测序。

术语“二代测序”也称为高通量测序，相比于第一代以Sanger为代表的测序技术，具有通量高、产量高、准确度高、分析自动化等特点。二代测序的主要特点是，能够同时对输入的序列进行大规模并行测序，并且所得结果为大量的(一般为2千万左右)长度不超过200bp的短序列(454测序仪例外，他的读长大于1kbp，但序列较少，在200万左右)。二代测序通常是指Illumina、Life Technologies和Roche等目前采用的所谓的平行合成测序或连接测序平台。

术语“三代测序”也称为“从头测序技术”，是指单分子测序技术。DNA测序时，不需要经过PCR扩增，实现了对每一条DNA分子的单独测序。主要分为两大技术阵营：第一大阵营是单分子荧光测序，代表性的技术为美国螺旋生物(Helicos)的SMS技术和美国太平洋生物(Pacific Bioscience)的SMRT技术。脱氧核苷酸用荧光标记，显微镜可以实时记录荧光的强度变化。当荧光标记的脱氧核苷酸被掺入DNA链的时候，它的荧光就同时能在DNA链上探测到。当它与DNA链形成化学键的时候，它的荧光基团就被DNA聚合酶切除，荧光消失。这种荧光标记的脱氧核苷酸不会影响DNA聚合酶的活性，并且在荧光被切除之后，合成的DNA链和天然的DNA链完全一样。第二大阵营为纳米孔测序，代表性的公司为英国牛津纳米孔公司。新型纳米孔测序法(nanopore sequencing)是采用电泳技术，借助电泳驱动单个分子逐一通过纳米孔来实现测序的。由于纳米孔的直径非常细小，仅允许单个核酸聚合物通过，而ATCG单个碱基的带电性质不一样，通过电信号的差异就能检测出通过的碱基类别，从而实现测序。

下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细的说明。以下实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。根据本发明的实质对本发明进行的简单改进都属于本发明要求保护的范围。

实施例1多重引物PCR设计

利用公共数据库(NCBI)获得呼吸道合胞病毒A型各种基因型碱基序列，通过生物信息学分析识别基因组头尾及中间的保守区段。不同于过去设计多个引物组通过一代测序的方式完成基因组扩增的方法，本实施例筛选呼吸道合胞病毒A型基因组的保守性较高的区段，并针对该区域设计能够覆盖呼吸道合胞病毒A型全基因组的引物，包含25对引物加一条正向引物，引物的序列包括SEQ ID NO.1-51，保证引物的通用性及扩增的简便性同时又增加扩增的灵敏度和特异性。

实施例2呼吸道合胞病毒临床样本的全基因组二代测序

1、样本的采集

在被检测者知情同意的情况下，使用呼吸道合胞病毒阳性样本12例。针对样本编号1-12的样本类型为咽拭子，CT值为31.767、30.676、24.658、32.053、28.23、29.7、26.1、30.58、32、30.3、26.9、25.7。

2、病毒核酸提取

使用QIAamp Viral RNA Mini Kit提取病毒核酸。具体操作步骤如下：

将含有5.6μg的Carrier RNA的560μl的AVL裂解液加入到140μl的样本中，涡旋振荡15s，彻底混匀，室温孵育10min。

短暂瞬时离心，向上述700μl的样液中加入560μl无水乙醇，涡旋振荡15s，短暂瞬时离心。

吸取上述630μl的样液加入已放置于2ml收集管的column中，8000rpm离心1min，将column置于新的2ml收集管中，丢弃旧管。

重复上一步，过滤完剩余样液。

向column中加入500μl的AW1溶液，8000rpm离心1min，将column放入新的2ml收集管中，丢弃旧管。

向column中加入500μl的AW2溶液，13000rpm离心3min。将收集管中的液体丢弃后，将column按13000rpm空离1min。将column放入新的1.5ml离心管中，丢弃旧管。

向column中加入40μl的AVE溶液，室温孵育1min，8000rpm离心1min，丢弃column，-80℃低温保存样品。

上步也可暂不丢弃column，重复上一步，提高20％的RNA回收率。

3、RT-PCR

使用Super Script IV First-Strand Synthesis System(Thermo FisherScientific)和Q5热启动高保真2XMaster Mix(New EnglandBiolabs)进行反转录和多重PCR扩增。具体步骤如下：

每个样本取11μl核酸溶液，分别向其中加入1μl随机引物和1μl 10mM dNTPs，轻弹混匀，瞬时离心。

PCR仪上65℃，5min；冰浴1min以上。

每个样本管中需加入4μl 5X SSIV反转录缓冲液、1μl 100mM DTT、1μl SSIV反转录酶、1μl Ribonuclease Ihibitor，提前配置7μl预混液，加入13μl上述退货产物中，轻弹混匀，瞬时离心。反转录程序为：步骤142℃50min循环1次，步骤272℃10min循环1次，步骤35℃Hold循环1次。

将SEQ ID NO.1-51引物按照奇偶数对分别混合成两个100μM的引物Pool-1和Pool-2，再将两个引物Pool稀释成10μM。

每个样本分别混合两个PCR管：2.5μl上述反转录产物、12.5μl Q5热启动高保真2XMaster Mix、4μl引物Pool-1或引物Pool-2、6μl Nuclease-Free Water，轻弹混匀，瞬时离心。多重PCR程序为：步骤198℃30s循环1次，步骤298℃15s、63℃5min循环5次，步骤398℃15s、65℃4min循环22-30次，步骤472℃2min循环1次，步骤54℃Hold循环1次。

根据样本的CT值来决定循环数。样本CT值为18-21时，总循环数为27；样本CT值为35时，总循环数为35。

将两个PCR管的PCR产物混合，使用1.5倍体积贝克曼AMpure XP磁珠对混合PCR产物进行纯化，使用80％乙醇清洗，30μl的去核酶水进行洗脱。

4、高通量测序文库构建和验证

使用Qubit 2.0Fluorometer和Qubit dsDNA BR Assay kit(Thermo FisherScientific)对纯化后的PCR产物进行定量。

使用TruePrep DNA Library Prep Kit V2 for Illumina、TruePrep Index KitV2 for Illumina(Vazyme)进行构建文库，按照产商说明书以每个样本5ng DNA起始投入量进行实验。

使用Aligent 2100Bioanalyzer system和High Sensitivity DNA Reagents进行文库质检，验证DNA片段是否在片段筛选大小范围内。使用Qubit2.0 Fluorometer和QubitdsDNA HS Assay kit对文库进行定量。

按照一定比例将文库混合，稀释至4nM，与0.2nM NaCl等比例混合，室温变性5min。若担心变性不彻底，可再将文库浓度稀释至12pM，95℃，2min，进行热变性，冰上2min以上。

使用300-cycle MiSeq Reagent Kit v2在Miseq上进行测序。

5、数据分析

将测序完成后miseq仪器上拆包的fastq文件上传至CLC Genomics Workbench进行分析。12个样本的覆盖度均为100％，平均测序深度为2843.55X至20654.97X。

6、结果

图1、图2分别是本实施例中CT值约为25和32的样本的全基因组序列覆盖度分布图。结果显示测序结果覆盖了RSV A的全基因组序列，其中图1最低测序深度为163.27X，最高测序深度为24475.64X；图2最低测序深度为17.64X，最高测序深度为36650.45X。

实施例3呼吸道合胞病毒临床样本的全基因组三代测序

1、本实施例中针对呼吸道合胞病毒临床样本，与实施例2一致。

2、本实施例中针对病毒核酸提取步骤，与实施例2一致。

3、本实施例针对RT-PCR程序，与实施例2一致。

4、高通量测序文库构建和验证

使用Qubit 2.0 Fluorometer和Qubit dsDNA BR Assay kit(Thermo FisherScientific)对纯化后的PCR产物进行定量。

根据扩增片段长度选择最佳DNA起始投入量为200ng，选择Ligation sequencingkit(SQK-LSK109)和Native Barcoding Expansion 1-12(EXP-NBD104)进行文库构建，其中使用Qubit2.0 Fluorometer和Qubit dsDNA HS Assay kit对DNA产物或文库进行定量。文库建议上样量为100-300ng。

按照产商说明书将样本注入R9.4.1芯片中，将芯片放置于GridION中进行测序。数据分析可使用杭州柏熠科技有限公司的分析软件或其他生物分析软件进行。

5、数据分析

12个样本的覆盖度均为100％，平均测序深度为1073.26X至4796.85X。

6、结果

图3、4分别是本实施例中CT值约为25和32的样本的全基因组序列覆盖度分布图。结果显示测序结果覆盖了RSV A的全基因组序列，其中图3最低测序深度为316.36X，最高测序深度为18827.55X；图4最低测序深度为969.18X，最高测序深度为19756.45X。

实施例4使用其他引物对呼吸道合胞病毒临床样本进行全基因组测序

1、本实施例中针对呼吸道合胞病毒临床样本，为实施例2中的前4个样本。

2、本实施例中针对病毒核酸提取步骤，与实施例2一致。

3、本实施例中呼吸道合胞病毒的引物为初步设计(优化筛选前)的引物。其中，初步设计引物包括实施例1中的部分引物SEQ ID NO.1-3、12-13、18-23、26-27、40-41和表1中的引物。

表1优化筛选前引物序列

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4、本实施例针对RT-PCR程序，与实施例2一致。

5、本实施例针对测序方法，与实施例2一致。

6、数据分析

4个样本的覆盖度为93％至99％，平均测序深度为11630.34X至15090.35X。

7、结果

图5、图6分别是本实施例中CT值约为25和32的样本的全基因组序列覆盖度分布图。结果显示测序结果未能全覆盖RSVA全基因组序列，存在多段测序深度为0的区域，测序效果低于实例1和实例2。

实施例5呼吸道合胞病毒临床样本的宏基因组测序

1、本实施例中针对呼吸道合胞病毒临床样本，为实施例2中的样本3与样本4。

2、本实施例中针对病毒核酸提取步骤，与实施例2一致。

3、高通量测序文库构建和验证

使用Qubit 2.0 Fluorometer和Qubit RNA BR Assay kit对RNA进行定量。从每个样本中取200ng RNA，使用MGISP-100及其配套RNA建库试剂进行构建文库。使用QubitssDNA BR Assay kit对文库进行定量。从每个文库中取40fmol DNA进行混合，使用DNBSEQDNB制备试剂盒(SD)制备DNB。将DNB加载至测序载片，使用高通量测序试剂盒(SE100)于MGISEQ-2000RS上进行测序。

4、数据分析

使用杭州柏熠科技有限公司的分析软件进行分析。2个样本的覆盖率分别为32％和77％。

5、结果

图7、图8分别是本实施例中样本的全基因组序列覆盖度分布图。结果显示测序结果未能全覆盖RSV A全基因组序列，存在多段测序深度为0的区域且测序深度低于20X，测序效果低于实例1和实例2。

上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。

Claims (10)

1.一种呼吸道合胞病毒A型全基因组扩增引物组，其特征在于，所述引物组包括长度为20-30bp的用于扩增不同基因的寡核苷酸片段；

优选地，所述引物组包括25对引物；

优选地，所述25对引物的序列如SEQ ID NO.2-51所示；

优选地，所述引物组还包括1条正向引物；

优选地，所述正向引物的序列如SEQ ID NO.1所示。

2.一种用于呼吸道合胞病毒A型全基因组检测的引物组，其特征在于，所述引物组在权利要求1所述的引物组的基础上，将其中一个或多个引物中的一个或多个碱基替换为简并碱基。

3.一种检测呼吸道合胞病毒A型全基因组的多重PCR检测产品，其特征在于，所述产品包括权利要求1或2所述的引物组。

4.根据权利要求3所述的产品，其特征在于，所述产品包括芯片、核酸膜条、试剂盒；

优选地，所述试剂盒还包括PCR扩增缓冲液、扩增酶、cDNA/DNA模板；

优选地，所述扩增酶包括DNA聚合酶和/或RNA聚合酶；

优选地，所述DNA聚合酶包括Taq DNA聚合酶、Pfu DNA聚合酶、KOD DNA聚合酶、Q5高保真DNA聚合酶、Q5热启动超保真DNA聚合酶、Phanta高保真DNA聚合酶、VAHTS HiFi DNA聚合酶；

优选地，所述扩增酶包括Q5高保真DNA聚合酶和/或Q5热启动超保真DNA聚合酶；

优选地，所述试剂盒包括Q5热启动超保真DNA聚合酶及相适配的扩增缓冲液、cDNA/DNA模板；

优选地，所述试剂盒还包括反转录的反应体系；

优选地，所述反转录的反应体系包括引物；

优选地，所述引物为随机引物；

优选地，所述反转录的反应体系还包括反转录缓冲液、反转录酶、核糖核酸酶抑制剂；

优选地，所述反转录缓冲液包括M-MLV反转录缓冲液、

ⅢReverseTranscriptase Buffer、/>

V Buffer、SSIV RT Buffer；

优选地，所述反转录缓冲液选自SSIV RT Buffer；

优选地，所述反转录酶包括M-MLVRT酶、HIV RT酶、ASLVRT酶、RSV RT酶、AMV RT酶、MCAVRT酶、REV-ART酶、UR2AVRT酶、YAVRT酶、RAVRT酶、MAVRT酶、SSIV RT酶；

优选地，所述反转录酶包括SSIV RT酶；

优选地，所述反转录的反应体系还包括DTT；

优选地，所述反转录的反应体系包括随机引物、SSIV RT Buffer、SSIV RT酶、核糖核酸酶抑制剂、DTT。

5.一种针对呼吸道合胞病毒A型全基因组的扩增方法，其特征在于，所述方法包括使用权利要求1或2所述的引物组进行扩增；

优选地，所述引物分成Pool-1和Pool-2两组；

优选地，所述Pool-1引物包括SEQ ID NO.1-3、6-7、10-11、14-15、20-21、24-25、28-29、32-33、38-39、42-43、46-47、50-51所示的引物，Pool-2引物包括SEQ ID NO.4-5、8-9、12-13、16-19、22-23、26-27、30-31、34-37、40-41、44-45、48-49所示的引物。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述方法为PCR扩增方法；

优选地，所述PCR扩增的试剂还包括PCR扩增缓冲液、扩增酶、cDNA/DNA模板；

优选地，所述扩增酶包括DNA聚合酶和/或RNA聚合酶；

优选地，所述DNA聚合酶包括Taq DNA聚合酶、Pfu DNA聚合酶、KOD DNA聚合酶、Q5高保真DNA聚合酶、Q5热启动超保真DNA聚合酶、Phanta高保真DNA聚合酶、VAHTS HiFi DNA聚合酶；

优选地，所述扩增酶包括Q5高保真DNA聚合酶和/或Q5热启动超保真DNA聚合酶；

优选地，所述PCR扩增的试剂包括引物组、Q5热启动超保真DNA聚合酶及相适配的扩增缓冲液、cDNA/DNA模板；

优选地，所述PCR扩增的反应条件为：步骤一98℃30s循环1次，步骤二98℃15s、63℃5min循环5次，步骤三98℃15s、65℃4min循环22-30次，步骤四72℃2min循环1次，步骤五4℃Hold循环1次；

优选地，所述方法还包括对扩增产物进行磁珠纯化。

7.根据权利要求5或6所述的方法，其特征在于，所述方法还包括从待测样本中提取呼吸道合胞病毒的核酸。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述方法还包括对病毒核酸进行反转录，获得反转录产物；

优选地，所述反转录的反应体系包括引物；

优选地，所述引物为随机引物；

优选地，所述反转录的反应体系还包括反转录缓冲液、反转录酶、核糖核酸酶抑制剂；

优选地，所述反转录缓冲液包括M-MLV反转录缓冲液、

ⅢReverseTranscriptase Buffer、/>

V Buffer、SSIV RT Buffer；

优选地，所述反转录缓冲液选自SSIV RT Buffer；

优选地，所述反转录酶包括M-MLV RT酶、HIV RT酶、ASLV RT酶、RSV RT酶、AMV RT酶、MCAV RT酶、REV-ART酶、UR2AVRT酶、YAV RT酶、RAV RT酶、MAV RT酶、SSIV RT酶；

优选地，所述反转录酶包括SSIV RT酶；

优选地，所述反转录的反应体系还包括DTT；

优选地，所述反转录的反应体系包括随机引物、SSIV RT Buffer、SSIV RT酶、核糖核酸酶抑制剂、DTT；

优选地，所述反转录的反应条件为：步骤一42℃50min循环1次，步骤二72℃10min循环1次，步骤三5℃Hold循环1次。

9.一种呼吸道合胞病毒A型全基因组测序的方法，其特征在于，所述方法包括使用权利要求1或2所述的引物组进行扩增获得扩增产物，使用扩增产物构建文库进行测序；

优选地，所述文库包括二代测序文库、三代测序文库；

优选地，所述二代测序文库选择TruePrep DNA Library Prep Kit V2 for Illumina、TruePrep Index Kit V2 for Illumina构建文库；

优选地，所述三代测序文库选择Ligation sequencing kit和Native BarcodingExpansion 1-12构建文库；

优选地，所述方法还包括对文库进行质检。

10.权利要求1或2所述的引物组在呼吸道合胞病毒A型全基因组扩增或测序中的应用。

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