CN114686565A

CN114686565A - 一种用于高通量靶向测序的单管嵌套多重pcr扩增方法

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Publication number: CN114686565A
Application number: CN202111667388.7A
Authority: CN
Inventors: 朱钧; 白冰; 杨楚烜; 姚志华; 金鑫
Original assignee: Beijing Mokobio Life Science Co ltd
Current assignee: Beijing Mokobio Life Science Co ltd
Priority date: 2020-12-31
Filing date: 2021-12-31
Publication date: 2022-07-01

Abstract

本发明涉及高通量测序领域，具体涉及一种用于高通量靶向测序的单管嵌套多重PCR扩增方法，即利用不同引物差异熔解温度(Tm)，通过设定两组不同PCR反应阶段，实现单管嵌套多重PCR反应。PCR产物经过接头连接最终完成扩增子文库构建。本发明利用嵌套PCR提高了传统PCR的灵敏度和特异性，同时克服了传统嵌套PCR易交叉污染的缺点，该方法应用于扩增子文库构建时可极大提高检测灵敏性、特异性及建库效率，特别适用病毒耐药突变基因或其他低核酸含量样本的高通量测序分析。

Description

一种用于高通量靶向测序的单管嵌套多重PCR扩增方法

技术领域

本发明涉及高通量测序领域，具体涉及一种用于高通量靶向测序的单管嵌套多重PCR扩增方法。

背景技术

聚合酶链式反应(PCR)是一种用于体外扩增特定DNA的分子生物学技术，巢式PCR(又称为嵌套式PCR)，是一种变异的聚合酶链式反应，使用两对PCR引物扩增完整的片段，其扩增的灵敏性和特异性显著提高。但是传统的嵌套式PCR需要中途开启反应管盖分两轮进行，存在交叉污染的缺点。

中国专利文献CN1858219A公开了一种单管原位嵌套式聚合酶链式反应方法及其应用，其通过控制退火温度实现单管原位嵌套式PCR。具体地，其通过设置内套引物和外套引物，内套引物与目标基因顺序有错配或在5端带一段非基因专一顺序；内套引物与原始模板的最高允许退火温度低于第一轮反应的退火温度，而内套引物与匹配模板的解链温度高于外套引物的最高允许退火温度。控制第一轮PCR循环的退火温度使外套引物能退火扩增但内套引物不能退火扩增。提高第二轮PCR循环的退火温度使外套停止退火扩增而内套引物能退火扩增。在第一和第二轮之间有二至若干循环退火温度低于二者的过渡阶段,使内套引物能与原始模板退火扩增形成匹配模板启动第二轮反应。然而，现有的单管嵌套PCR灵敏度和特异性难以令人满意，且存在容易交叉污染的缺点，难以应用于高通量靶向测序。

发明内容

因此，本发明要解决的技术问题在于克服现有技术中的单管嵌套PCR方法灵敏度和特异性难以令人满意，且存在容易交叉污染的缺点，难以应用于高通量靶向测序，从而提供一种用于高通量靶向测序的单管嵌套多重PCR扩增方法，该方法应用于扩增子文库构建时可极大提高检测灵敏性、特异性及建库效率，特别适用病毒耐药突变基因或其他低核酸含量样本的高通量测序分析。

为此，本发明提供了如下的技术方案：

一种单管嵌套多重PCR扩增方法，包括至少一组外套引物和至少一组内套引物；所述外套引物为基因特异性引物；内套上游引物包括基因特异性引物序列1，内套下游引物包括基因特异性引物序列2；所述外套引物的Tm值>60℃，内套引物的基因特异性引物序列1和2的Tm值低于(＜)外套引物的Tm值5-20℃；

PCR扩增反应包括至少一轮PCR扩增反应，用于目的基因的靶向富集扩增；

所述PCR扩增反应包括两组不同退火温度的PCR反应阶段；第一阶段的退火温度≥60℃；第二阶段的退火的温度低于(＜)第一阶段的退火温度5-20℃。

可选的，内套引物的基因特异性引物序列1和2的Tm值低于(＜)外套引物的Tm值5-15℃。

可选的，所述PCR扩增反应包括两组不同退火温度的PCR反应阶段；第一阶段的退火温度≥60℃；第二阶段的退火的温度低于(＜)第一阶段的退火温度5-10℃。

可选的，所述内套引物浓度是外套引物浓度的5-20倍；

可选的，所述内套引物浓度是外套引物浓度的5-10倍。

可选的，所述内套引物浓度是外套引物浓度的5倍。

可选的，第一阶段的扩增循环数为5-20个循环，第二阶段的扩增循环数为15-30个循环。

可选的，第一阶段的扩增循环数为10-20个循环，第二阶段的扩增循环数为15-30个循环。

可选的，第一阶段的扩增循环数为20个循环，第二阶段的扩增循环数为15-30个循环。

可选的，所述PCR扩增反应还包括另一轮PCR扩增反应，用于扩增子文库。

可选的，包括建库方案(A)，将单管多重嵌套PCR扩增产物通过另一轮PCR扩增反应，添加测序通用接头序列和测序引物结合位点，用于构建扩增子测序文库。

可选的，所述的另一轮PCR扩增反应包括第二轮扩增引物组，所述第二轮扩增引物组的上游引物包括按照5’到3’的方向依次为接头序列1、index序列、通用引物序列1；第二轮扩增引物组的下游引物包括按照5’到3’的方向依次为接头序列2、通用引物序列2。

可选的，内套上游引物由5’到3’的方向依次包括通用引物序列1和基因特异性引物序列1；内套下游引物由5’到3’的方向依次包括为通用引物序列2和基因特异性引物序列2；内套引物的基因特异性引物序列1和2的Tm值低于(＜)完整内套引物的Tm值15-20℃，完整内套引物Tm值高于(＞)外套引物至少5℃。

可选的，内套上游引物由5’到3’的方向依次包括通用引物序列1和基因特异性引物序列1；内套下游引物由5’到3’的方向依次包括为通用引物序列2和基因特异性引物序列2；内套引物的基因特异性引物序列1和2的Tm值低于完整内套引物的Tm值17.5℃，完整内套引物Tm值高于外套引物至少5℃。

可选的，包括建库方案(B)，上述单管多重嵌套PCR扩增产物可以通过DNA连接酶添加测序通用接头序列和测序引物结合位点，用于构建扩增子测序文库。

可选的，接头连接方式可以通过平端连接，TA连接或粘端连接。单管多重嵌套PCR扩增产物的粘性末端可以通过在上述内套引物5’端加入含修饰核苷酸、切口酶识别位点(Nicking enzyme)、内切酶识别位点、化学修饰、可光解碱基等中的一种或多种的序列；优选地，所述修饰核苷酸包括dUTP，dITP，RNA碱基中的一种或多种。

可选的，测序接头可为平端，T-overhang,或与上述粘性末端匹配的序列；如本领域公知的，用于连接酶链接的5’末端可以磷酸化。

可选的，包括第一轮PCR扩增反应体系，以总体积25μl为例：

10x Buffer for Hot start KOD DNA polymerase，2.5μl；

MgSO₄，25mM，1.5μl；

dNTPs，每种碱基2nM，2.5μl；

内套上游引物，每种10μM，0.75μl；

内套下游引物，每种10μM，0.75μl；

外套上游引物，每种0.25μM，0.75μl；

外套下游引物，每种0.25μM，0.75μl；

模板DNA，2μl；

KOD Hot start DNA polymerase，1U/μl，0.5μl；

PCR用水补足至25μl。

所述的方法，包括第一轮PCR扩增反应程序：

第一步在95℃下持续2分钟；

第二步在95℃下持续20秒，60℃下持续10秒，70℃持续2分钟；20个循环；

第三步在95℃下持续20秒，50℃下持续10秒，70℃持续15秒；30个循环；

第四步在70℃下持续1分钟；

保持在10℃。

可选的，包括第二轮PCR扩增反应体系，以25μl为计；

10x Buffer for Hot start KOD DNA polymerase，2.5μl；

MgSO₄，25mM，1.5μl；

dNTPs，每种碱基2nM，2.5μl；

第二轮扩增上游引物，10μM，0.75μl；

第二轮扩增下游引物，10μM，0.75μl；

模板DNA，1μl；

KOD Hot start DNA polymerase，1U/μl，0.5μl；

PCR用水补足至25μl。

10、根据权利要求1-9任一项所述的方法，其特征在于，包括第二轮PCR扩增反应程序：

第一步在95℃下持续2分钟；

第二步在95℃下持续20秒，55℃下持续10秒，77℃持续15秒；18个循环；

第三步在70℃下持续1分钟；

保持在10℃。

本发明技术方案，具有如下优点：

1.本发明提供的一种用于高通量靶向测序的单管嵌套多重PCR扩增方法，包括至少一组外套引物和至少一组内套引物；所述外套引物为基因特异性引物；内套上游引物包括基因特异性引物序列1，内套下游引物包括基因特异性引物序列2；所述外套引物的Tm值>60℃，内套引物的基因特异性引物序列1和2的Tm值低于外套引物的Tm值5-20℃；PCR扩增反应包括至少一轮PCR扩增反应，用于目的基因的靶向富集扩增；所述PCR扩增反应包括两组不同退火温度的PCR反应阶段；第一阶段的退火温度≥60℃；第二阶段的退火的温度低于第一阶段的退火温度5-10℃；

通过联合控制内套引物中基因特异性序列、(和/或构建文库时的完整内套引物)、外套的引物的熔解温度Tm，以及将目的基因的靶向富集扩增的PCR扩增反应中配合设置两组不同退火温度的PCR反应阶段，即可高特异性、高灵敏度的扩增目的基因，实现目的基因的靶向富集，且无交叉污染，进而可极大提高文库的构建效率，提高文库检测的灵敏性和特异性，可广泛应于核酸样本的高通量测序分析，尤其是适用病毒耐药突变基因或其他低核酸含量样本的高通量测序分析。

附图说明

为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1是本发明实施例1中设计的引物的位置图；

图2是本发明实施例1中退火温度对PCR反应影响的实验结果；图中a图为单独外套引物在退火温度为60℃时的PCR反应检测结果；图中b图为单独内套引物1分别在退火温度为60℃和54℃时的PCR反应检测结果；图中c图为单独内套引物2分别在退火温度为60℃和54℃时的PCR反应检测结果；

图3是本发明实施例2中第二阶段退火温度对PCR反应影响的实验结果；

图4是本发明实施例5中单管多重嵌套PCR反应体系中加入5copy质粒的qPCR图；

图5是本发明实施例5中单管多重嵌套PCR反应体系中加入5copy质粒的线性回归图；

图6是本发明实施例6中Illumina测序结果用于计算两种质粒比例的测量值并利用随机抽样方法检测不同测序深度对测量值的影响结果。

具体实施方式

提供下述实施例是为了更好地进一步理解本发明，并不局限于所述最佳实施方式，不对本发明的内容和保护范围构成限制，任何人在本发明的启示下或是将本发明与其他现有技术的特征进行组合而得出的任何与本发明相同或相近似的产品，均落在本发明的保护范围之内。

实施例中未注明具体实验步骤或条件者，按照本领域内的文献所描述的常规实验步骤的操作或条件即可进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规试剂产品。

实施例1

本实施例提供了一种单管嵌套多重PCR扩增乙肝病毒基因组DNA的引物设计，具体如下：

(1)引物设计

以HBV type B DNA乙肝病毒B型基因组DNA(登录号为AY220698.1Hepatitis Bvirus strain 536207，序列如SEQ ID NO.1所示)设计引物，设计外套引物Out_Primer_F/R，扩增片段包括两个靶区，分别设计内套引物Inner_Primer_F1/R1，Inner_Primer_F2/R2。根据如下原则设计引物：外套引物的Tm值(溶解温度)高于内套引物；外套引物的Tm值>60℃，内套引物的Tm值低于外套引物的Tm值5-15℃。设计的引物见下表1，设计的引物的位置如图1所示。

表1、引物以及Tm值

(2)配置PCR反应体系

表2、PCR反应体系

(3)退火温度对PCR的影响

1)外套引物组

按照上述表2配置的PCR反应体系(此时上游引物和下游引物为外套引物组)按照如下PCR程序进行：第一步在95℃下持续2分钟；第二步35个循环(95℃持续20秒，60℃持续10秒，70℃持续2分钟)；第三步70℃持续2分钟，保持在10℃。平行两次

平行两次实验获得的扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，结果见图2a，获得所需的3.2kb片段，可知外套引物组在60℃退火温度下PCR能够有效反应。

2)内套引物组1分别在退火温度为60℃或54℃下的反应

按照上述表2配置的PCR反应体系(此时上游引物和下游引物为内套引物组1，即Inner_Primer_F1和Inner_Primer_R1)按照如下PCR程序进行：第一步在95℃下持续2分钟；第二步35个循环(在95℃下持续20秒，60℃(或54℃)下持续10秒，70℃持续15秒)；第三步在70℃下持续1分钟，保持在10℃。每个退火温度平行试验两次。

将上述获得的扩增产物进2％琼脂糖行凝胶电泳，结果见图2b，图2b中泳道1和2为退火温度54℃时的检测结果，泳道3和4为退火温度60℃时的检测结果，说明当退火温度为60℃时，内套引物组1不会产生特异性PCR产物，当退火温度为54℃时，内套引物组1获得特异性PCR产物。

3)内套引物组2在退火温度为60℃或54℃下的反应

按照上述表2配置的PCR反应体系(此时上游引物和下游引物为内套引物组2，即Inner_Primer_F2和Inner_Primer_R2)按照如下PCR程序进行：第一步在95℃下持续2分钟；第二步35个循环(在95℃下持续20秒，60℃(或54℃)下持续10秒，70℃持续15秒)；第三步在70℃下持续1分钟，保持在10℃。每个退火温度平行试验两次。

将上述获得的扩增产物进行2％琼脂糖凝胶电泳，结果见图2c，图2c中泳道1和泳道2为退火温度54℃时的检测结果，泳道3和泳道4为退火温度60℃时的检测结果，说明当退火温度为60℃时，内套引物组2不会产生特异性PCR产物，当退火温度为54℃时，内套引物组2获得特异性PCR产物。

实施例2

本实施例提供了一种单管嵌套多重PCR扩增乙肝病毒基因组DNA的方法，包括：

(1)、利用实施例1设计的引物配制如下表3的PCR反应体系

表3、PCR反应体系

(2)内套引物组的退火温度的优化

按照上述表3配置的PCR反应体系分别按照如下1)-3)进行：

1)、PCR程序1

第一步在95℃下持续2分钟；

第二步20个循环(在95℃下持续20秒，60℃下持续10秒，70℃持续2分钟)；

第三步30个循环(在95℃下持续20秒，50℃下持续10秒，70℃持续15秒)；

第四步在70℃下持续1分钟；

保持在10℃。

2)、PCR程序2

第一步在95℃下持续2分钟；

第三步30个循环(在95℃下持续20秒，52℃下持续10秒，70℃持续15秒)；

第四步在70℃下持续1分钟；

保持在10℃。

3)、PCR程序3

第一步在95℃下持续2分钟

第三步30个循环(在95℃下持续20秒，54℃下持续10秒，70℃持续15秒)；

第四步在70℃下持续1分钟；

保持在10℃。

每个PCR程序平行两次试验，将上述各个PCR程序的扩增产物进行凝胶电泳，结果见图3(图中泳道1、2为内套引物组1、2退火温度为50℃的结果，泳道3、4为内套引物组1、2退火温度为52℃的结果，泳道3、4为内套引物组5、6退火温度为54℃的结果)，结果发现，当第二阶段扩增的退火温度为50℃时，PCR结果最佳。

实施例3

本实施例提供了一种单管嵌套多重PCR扩增子文库的构建方法，包括如下步骤：

(1)引物设计

利用实施例1中的引物扩增HBV type B DNA乙肝病毒B型基因组DNA构建文库，在内套引物Inner_Primer_F1 Inner_Primer_F2的5’端加入通用序列1(GCGTCAGATGTGTATAAGAGACAG)，和Inner_Primer_R1，Inner_Primer_R2的5’端加入通用序列2(CGTGTGCTCTTCCGATCT)。并设计了第二轮扩增的引物(2nd_round PCR_Primer_F，2nd_round PCR_Primer_R)。设计的引物如下表4。

表4.引物列表

上述序列中的NNNNNNNN表示index序列。

(2)配制PCR反应体系并PCR扩增(平行两次实验)

第1轮的PCR反应体系如下表5。

表5.第1轮的的PCR反应体系

按照上表配制第一轮PCR反应体系并进行如下第一轮的PCR扩增程序：

第一步在95℃下持续2分钟；

第三步15个循环(在95℃下持续20秒，50℃下持续10秒，70℃持续15秒)；

第四步在70℃下持续1分钟；

保持在10℃；

取上述PCR程序的扩增产物配制第2轮PCR反应体系如下表6。

表6.第2轮PCR反应体系

按照上表配制第二轮PCR反应体系并进行如下第二轮的PCR扩增程序：

第一步在95℃下持续2分钟；

第二步18个循环(在95℃下持续20秒，55℃下持续10秒，77℃持续15秒)；

第三步在70℃下持续1分钟；

保持在10℃。

(3)纯化

将获得的第二轮PCR扩增反应产物采用RNA Clean up XP beads(0.8x)纯化，然后溶解于10μl的水中。

(4)文库定量和测序

文库定量采用Kapa Quantification kit进行定量，定量后采用Illumina测序，测序结果如下表7所示。

表7.测序结果

上述结果表明，通过本发明的单管嵌套多重PCR扩增的子文库具有高特异性。

实施例4

本实施例提供了一种单管嵌套多重PCR结合DNA连接酶的扩增子文库的构建方法，包括如下步骤：

(1)引物设计

利用实施例1中的引物扩增HBV type B DNA乙肝病毒B型基因组DNA构建文库，在内套引物Inner_Primer_F1 Inner_Primer_F2的5’端加入通用序列3(AGATCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAG)，和Inner_Primer_R1，Inner_Primer_R2的5’端加入通用序列4(AGATCGCTCTTCCGATCT)。扩增产物通过连接互补的粘性双链测序接头构建测序子文库。引物和接头(上游接头的接头上链的序列参见SEQ ID NO.18，上游接头的接头下链的序列参见SEQ ID NO.19，下游接头的接头上链的序列参见SEQ ID NO.20，下游接头的接头下链的序列参见SEQ ID NO.21所示)列表如下：

表8.引物列表

表9.接头列表

上述序列中的NNNNNNNN表示index序列。

(2)实验步骤：

A.单管多重嵌套PCR

表10.第1轮的PCR反应体系

第一步在95℃下持续2分钟；

第四步在70℃下持续1分钟；

保持在10℃；

将上述获得的PCR产物进行纯化。

B DNA连接酶法介导测序文库构建

用限制性内切酶Bbvl和Earl处理纯化的PCR产物，按照下表11配制反应体系。

表11.反应体系

按照上表7配制的反应体系置于一个热循环器上于37℃孵育30分钟。

然后在65℃下孵育20分钟，使酶丧失活性。

使用HiPrep PCR磁珠(1.2x)纯化反应混合液，并洗脱在15μl水中。

接头连接，接头制备按照下表12配制反应体系。

表12.接头的制备

按照上表12制备的反应体系在82℃下，于热循环器中孵育2分钟。

以0.1℃/3秒的速率冷却至25℃。

退火程序：

82℃，2分钟；

570x{82℃，3秒，-0.1℃/周期}

4℃保温。

连接反应，连接反应体系见下表13。

表13.连接反应体系

组分	容量
		10倍T4 DNA连接酶缓冲液(NEB)	2μl
纯化的酶切PCR产物	15μl
		上游接头(10μM)	1μl
下游接头(10μM)	1μl
		T4 DNA连接酶(NEB，200U/μl)	1μl
总体积	20μl

按照上表13配制连接反应体系得到反应混合液，通过移液器上下轻轻混合反应混合液，并进行短暂的离心。在室温下孵育15分钟。使用HiPrep PCR磁珠(1x)纯化连接混合物，并洗脱在10μl水中。

测量文库浓度

取1μl纯化的连接产物，制备系列10倍稀释液(1：10到1：10000)。

用Kapa文库定量试剂盒测定1：10000的稀释液的浓度。

用水调节文库的浓度至4nM。

在Illumina测序平台进行测序。

测序结果

Illumina双端测序原始.fastq文件经过PEAR软件组装为完整被测区段。每一组装后的测序结果与目标区段序列相比较，由正确配对引物产生的符合预期读长的序列认定为中靶(on-target)，中靶率为中靶序列数在总读取数中的占比，结果为总读取数554265，中靶率97.0％。

实施例5单管多重嵌套PCR扩增建库的灵敏度

HBV B亚型质粒(pHBV1.3_B，中科院上海巴斯德研究所提供)用做模板检测本发明的单管多重嵌套PCR扩增方法的检测下限(LOD)。质粒浓度首先调整为5×10⁸copy/uL,然后通过10倍梯度稀释达到5copy/uL.PCR grade水用做空白阴性对照。单管多重嵌套PCR按照实施例4中方法进行，并在PCR反应体系中加入Sybr Green,用于实时监测PCR扩增曲线。图4显示在单管多重嵌套PCR反应体系中加入5copy质粒，仍与空白对照有明显Ct差异。利用5-50000模板分子数的线性回归r²为0.9985，线性回归图见图5。

实施例6单管多重嵌套PCR的偏差性验证

HBV B亚型质粒(pHBV1.3_B，中科院上海巴斯德研究所提供)HBV D亚型质粒(pHBV1.3_D，中科院上海巴斯德研究所提供)混合实验用来验证单管多重嵌套PCR中潜在扩增偏差(skewing)。两种质粒的混合比例为0.5％，1％，2％，10％，20％，50％，80％，90％，98％，99％，99.5％(摩尔比)。单管多重嵌套PCR建库按照实施例4中方法进行.Illumina测序结果用于计算两种质粒比例的测量值，并利用随机抽样方法检测不同测序深度对测量值的影响(图6)。在1,000x-16,000x测序深度时，测量值和实际值的相关性(r)均大于0.999。

显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。

序列表

<110> 北京美康基因科学股份有限公司

<120> 一种用于高通量靶向测序的单管嵌套多重PCR扩增方法

<150> 2020116295681

<151> 2020-12-31

<160> 21

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 3215

<212> DNA

<213> 乙肝病毒B型基因组DNA(Hepatitis B virus strain)

<400> 1

aactccacca ctttccacca aactcttcaa gatcccagag tcagggccct gtactttcct 60

gctggtggct ccagttcagg aacagtgagc cctgctcaaa atactgtctc tgccatatcg 120

tcaatcttat cgaaaactgg ggaccctgta ccgaacatgg agaacatcgc atcaggactc 180

ctaggacccc tgctcgtgtt acaggcgggg tttttcttgt tgacaaaaat cctcacaata 240

ccacagagtc tagactcgtg gtggacttct ctcaattttc tagggggaac acccgtgtgt 300

cttggccaaa attcgcagtc ccaaatctcc agtcactcac caacctgttg tcctccaatt 360

tgtcctggtt atcgctggat gtatctgcgg cgttttatca tattcctctg catcctgctg 420

ctatgcctca tcttcttgtt ggttcttctg gactatcaag gtatgttgcc cgtttgtcct 480

ctaattccag gatcatcaac aaccagcacc ggaccatgca aaacctgcac gactcctgct 540

caaggaacct ctatgtttcc ctcatgttgc tgtacaaaac ctacggacgg aaactgcacc 600

tgtattccca tcccatcatc ttgggctttc gcaaaattcc tatgggagtg ggcctcagtc 660

cgtttctctt ggctcagttt actagtgcca tttgttcagt ggttcgtagg gctttccccc 720

actgtctggc tttcagttat atggatgatt tggttttggg ggccaagtct gtacaacatc 780

ttgagtccct ttatgccgct gttaccaatt ttcttttgtc tttgggtata catttaaacc 840

ctcacaaaac aaaaagatgg ggatattccc ttaactttat gggatatgta attgggagtt 900

ggggcacatt gccacaggaa catattgtac aaaaaatcaa aatatgtttt aggaaacttc 960

ctgtaaacag gcctattgat tggaaagtct gtcaacgaat tgtgggtctt ttggggtttg 1020

ccgccccttt cacgcaatgt ggatatcctg ctttaatgcc tttatatgca tgtatacaag 1080

caaaacaggc ttttattttc tcgccaactt acaaggcctt tctgagtaaa cagtatttga 1140

acctttaccc cgttgctcgg caacggcctg gtctgtgcca agtgtttgct gacgcaaccc 1200

ccactggttg gggcttggcc ataggccatc agcgcatgcg tggcaccttt gtgtctcctc 1260

tgccgatcca tactgcggaa ctcctagccg cttgttttgc tcgcagcagg tctggggcaa 1320

aactcatcgg gactgacaat tctgtcgtgc tctcccgcaa gtatacatca tttccatggc 1380

tgctaggctg tgctgccaac tggatcctgc gcgggacgtc ctttgtttac gtcccgtcgg 1440

cgctgaatcc cgcggacgac ccctcccggg gccgcttggg gctctaccgc ccgcttctcc 1500

gcctgttgta ccgaccgacc acggggcgca cctctcttta cgcggactcc ccgtctgtgc 1560

cttctcatct gccggaccgt gtgcacttcg cttcacctct gcacgtcgca tggaaaccac 1620

cgtgaacgcc cacaggaacc tgcccaaggt cttgcataag aggactcttg gactttcagc 1680

aatgtcaacg accgaccttg aggcatactt caaagactgt gtgtttactg agtgggagga 1740

gttgggggag gaggttaggt taatgatctt tgtactagga ggctgtaggc ataaattggt 1800

gtgttcacca gcaccatgca actttttcac ctctgcctaa tcatctcatg ttcatgtcct 1860

actgttcaag cctccaagct gtgccttggg tggctttggg gcatggacat tgacccgtat 1920

aaagaatttg gagcttctgt ggagttactc tcttttttgc cttctgactt ctttccttct 1980

attcgagatc tcctcgacac cgcctctgct ctgtatcggg aggccttaga gtctccggaa 2040

cattgttcac ctcaccatac ggcactcagg caagctattc tgtgttgggg tgagttaatg 2100

aatctagcca cctgggtggg aagtaatttg gaagatccag catccaggga attagtagtc 2160

agctatgtca acgttaatat gggcctaaaa atcagacaac tattgtggtt tcacatttcc 2220

tgtcttactt ttgggagaga aactgttctt gaatatttgg tgtcttttgg agtgtggatt 2280

cgcactcctc ccgcatatag accgccaaat gcccctatct tatcaacact tccggaaact 2340

actgttgtta gacgaagagg caggtcccct agaagaagaa ctccctcgcc tcgcagacga 2400

aggtctcaat cgccgcgtcg cagaagatct caatctcggg aatctcaatg ttagtattcc 2460

ttggacacac aaggtgggaa actttacggg gctttattct tctacggtac cttgctttaa 2520

tcctaaatgg caaactcctt cttttcctga cattcatttg caggaggaca ttgttgatag 2580

atgtaagcaa tttgtggggc cccttacagt aaatgaaaac aggagactta aattaattat 2640

gcctgctagg ttttatccca atgttactaa atatttgccc ttagataaag ggatcaaacc 2700

gtattatcca gagtatgtag ttaatcatta cttccagacg cgacattatt tacacactct 2760

ttggaaggcg gggatcttat ataaaagaga gtccacacgt agcgcctcat tttgcgggtc 2820

accatattct tgggaacaag atctacagca tgggaggttg gtcttccaaa cctcgaaaag 2880

gcatggggac aaatctttct gtccccaatc ccctgggatt cttccccgat catcagttgg 2940

accctgcatt caaagccaac tcagaaaatc cagattggga cctcaacccg cacaaggaca 3000

actggccgga cgccaacaag gtgggagtgg gagcattcgg gccagggttc acccctcccc 3060

atgggggact gttggggtgg agccctcagg ctcagggcct actcacaact gtgccagcag 3120

ctcctcctcc tgcctccacc aatcggcagt taggaaggca gcctactccc ttatctccac 3180

ctctaaggga cactcatcct caggccatgc agtgg 3215

<210> 2

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列 Out_Primer_F(Artificial Sequence Out_Primer_F)

<400> 2

cacctctgcc taatcatctc atgttcatgt cc 32

<210> 3

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列 Out_Primer_R(Artificial Sequence Out_Primer_R)

<400> 3

agttgcatgg tgctggtgaa cacac 25

<210> 4

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列 Inner_Primer_F1(Artificial Sequence Inner_Primer_F1)

<400> 4

attcttggga acaagatcta c 21

<210> 5

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列 Inner_Primer_R1(Artificial Sequence Inner_Primer_R1)

<400> 5

tgaactggag ccaccag 17

<210> 6

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列 Inner_Primer_F2(Artificial Sequence Inner_Primer_F2)

<400> 6

cacctgtatt cccatccca 19

<210> 7

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列 Inner_Primer_R2(Artificial Sequence Inner_Primer_R2)

<400> 7

cgttgacaga ctttccaatc aat 23

<210> 8

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列 Inner_Primer_F1 with a universal tail(Artificial SequenceInner_Primer_F1 with a universal tail)

<400> 8

gcgtcagatg tgtataagag acagattctt gggaacaaga tctac 45

<210> 9

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列 Inner_Primer_R1 with a universal tail(Artificial SequenceInner_Primer_R1 with a universal tail)

<400> 9

cgtgtgctct tccgatcttg aactggagcc accag 35

<210> 10

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列 Inner_Primer_F2 with a universal tail(Artificial SequenceInner_Primer_F2 with a universal tail)

<400> 10

gcgtcagatg tgtataagag acagcacctg tattcccatc cca 43

<210> 11

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列 Inner_Primer_R2 with a universal tail(Artificial SequenceInner_Primer_R2 with a universal tail)

<400> 11

cgtgtgctct tccgatctcg ttgacagact ttccaatcaa t 41

<210> 12

<211> 70

<212> DNA

<213> 人工序列 2nd_round PCR_Primer_F(Artificial Sequence 2nd_round PCR_Primer_F)

<220>

<221> misc_feature

<222> (30)...(37)

<223> n =a或g或c或t

<400> 12

aatgatacgg cgaccaccga gatctacacn nnnnnnntcg tcggcagcgt cagatgtgta 60

taagagacag 70

<210> 13

<211> 66

<212> DNA

<213> 人工序列 2nd_round PCR_Primer_R(Artificial Sequence 2nd_round PCR_Primer_R)

<220>

<221> misc_feature

<222> (25)...(32)

<223> n =a或g或c或t

<400> 13

caagcagaag acggcatacg agatnnnnnn nngtgactgg agttcagacg tgtgctcttc 60

cgatct 66

<210> 14

<211> 54

<212> DNA

<400> 14

agatcggcag cgtcagatgt gtataagaga cagattcttg ggaacaagat ctac 54

<210> 15

<211> 35

<212> DNA

<400> 15

agatcgctct tccgatcttg aactggagcc accag 35

<210> 16

<211> 52

<212> DNA

<400> 16

agatcggcag cgtcagatgt gtataagaga cagcacctgt attcccatcc ca 52

<210> 17

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列 Inner_Primer_R2 with a universal tail (Artificial SequenceInner_Primer_R2 with a universal tail )

<400> 17

agatcgctct tccgatctcg ttgacagact ttccaatcaa t 41

<210> 18

<211> 56

<212> DNA

<213> 人工序列上游接头接头上链(Artificial Sequence上游接头接头上链)

<220>

<221> misc_feature

<222> (30)...(37)

<223> n =a或g或c或t

<400> 18

aatgatacgg cgaccaccga gatctacacn nnnnnnntcg tcggcagcgt cagatg 56

<210> 19

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列上游接头接头下链(Artificial Sequence上游接头接头下链)

<400> 19

tacacatctg acgctgccga cga 23

<210> 20

<211> 64

<212> DNA

<213> 人工序列下游接头接头上链(Artificial Sequence下游接头接头上链)

<220>

<221> misc_feature

<222> (33)...(40)

<223> n =a或g或c或t

<400> 20

atcggaagag cacacgtctg aactccagtc acnnnnnnnn atctcgtatg ccgtcttctg 60

cttg 64

<210> 21

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列下游接头接头下链(Artificial Sequence下游接头接头下链)

<400> 21

gtgactggag ttcagacgtg tgctcttcc 29

Claims

1.一种单管嵌套多重PCR扩增方法，其特征在于，包括至少一组外套引物和至少一组内套引物；所述外套引物为基因特异性引物；内套上游引物包括基因特异性引物序列1，内套下游引物包括基因特异性引物序列2；所述外套引物的Tm值>60℃，内套引物的基因特异性引物序列1和2的Tm值低于外套引物的Tm值5-20℃；

所述PCR扩增反应包括两组不同退火温度的PCR反应阶段；第一阶段的退火温度≥60℃；第二阶段的退火温度低于第一阶段的退火温度5-20℃。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述内套引物浓度是外套引物浓度的5-20倍。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，第一阶段的扩增循环数为5-20个循环，第二阶段的扩增循环数为15-30个循环。

4.根据权利要求1-3任一项所述的方法，其特征在于，所述PCR扩增反应还包括另一轮PCR扩增反应，用于扩增子文库；

可选的，所述单管多重嵌套PCR扩增产物通过DNA连接酶添加测序通用接头序列和测序引物结合位点，用于构建扩增子测序文库。

5.根据权利要求1-4任一项所述的方法，其特征在于，所述的另一轮PCR扩增反应包括第二轮扩增引物组，所述第二轮扩增引物组的上游引物包括按照5’到3’的方向依次为接头序列1、index序列、通用引物序列1；第二轮扩增引物组的下游引物包括按照5’到3’的方向依次为接头序列2、通用引物序列2。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，内套上游引物由5’到3’的方向依次包括通用引物序列1和基因特异性引物序列1；内套下游引物由5’到3’的方向依次包括为通用引物序列2和基因特异性引物序列2；内套引物的基因特异性引物序列1和2的Tm值低于完整内套引物的Tm值17.5℃，完整内套引物Tm值高于外套引物至少5℃。

7.根据权利要求1-6任一项所述的方法，其特征在于，包括第一轮PCR扩增反应体系，以总体积25μl为例：

10x Buffer for Hot start KOD DNA polymerase，2.5μl；

MgSO₄，25mM，1.5μl；

dNTPs，每种碱基2nM，2.5μl；

内套上游引物，每种10μM，0.75μl；

内套下游引物，每种10μM，0.75μl；

外套上游引物，每种0.25μM，0.75μl；

外套下游引物，每种0.25μM，0.75μl；

模板DNA，2μl；

KOD Hot start DNA polymerase，1U/μl，0.5μl；

PCR用水补足至25μl。

8.根据权利要求1-7任一项所述的方法，其特征在于，包括第一轮PCR扩增反应程序：

第一步在95℃下持续2分钟；

第四步在70℃下持续1分钟；

保持在10℃。

9.根据权利要求1-8任一项所述的方法，其特征在于，包括第二轮PCR扩增反应体系，以25μl为计；

10x Buffer for Hot start KOD DNA polymerase，2.5μl；

MgSO₄，25mM，1.5μl；

dNTPs，每种碱基2nM，2.5μl；

第二轮扩增上游引物，10μM，0.75μl；

第二轮扩增下游引物，10μM，0.75μl；

模板DNA，1μl；

KOD Hot start DNA polymerase，1U/μl，0.5μl；

PCR用水补足至25μl。

10.根据权利要求1-9任一项所述的方法，其特征在于，包括第二轮PCR扩增反应程序：

第一步在95℃下持续2分钟；

第三步在70℃下持续1分钟；

保持在10℃。