CN113789368B - 核酸检测试剂盒、反应体系及方法 - Google Patents

核酸检测试剂盒、反应体系及方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开一种核酸检测试剂盒、反应体系及方法。该检测方法包括以下步骤：提供环状单链DNA分子模板；使待检测的核酸作为一次引物，然后在含有链置换酶和dUTP的反应溶液中进行第一恒温滚环扩增；通过切刻酶将扩增产物切割为适于作为二次引物的片段；最后进行第二恒温滚环扩增。本发明能够在短时间内大量扩增，有效保障了检测灵敏性。本发明的检测方法不仅简化了核酸检测的步骤，节约时间，而且扩增过程只涉及两个温度，无需专业设备以及复杂的热循环过程，常温或者简单的水浴就可完成，能够在2小时内完成检测。另外，整个反应可以在同一反应管中进行，有效避免了各步骤间的纯化，进一步提高了实验效率。

Description

核酸检测试剂盒、反应体系及方法
技术领域
本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及一种核酸检测的试剂盒、反应体系及方法。
背景技术
核酸检测是包括新冠肺炎病毒在内的病毒重要检测手段。传统的核酸检测试剂盒需要专业人员、场所和设备，并且检测时间较久。因此，开发一种简易、可自我检测、设备要求低并且快速检测的试剂盒对于全民核酸检测是必不可少的。
现在最常用的核酸检测步骤是检测机构收到样本后，对样本进行核酸提取。病毒RNA需要首先逆转录为cDNA，再进行扩增检测。PCR扩增和检测使用批准产品说明书中指定的荧光定量PCR仪，通过荧光定量PCR所得到的样本Ct值的大小，判断患者样本中是否含有新型冠状病毒。
例如，CN111349719A，公开了一种用于新型冠状病毒检测的特异引物及快速检测方法，包括步骤：对采集样本进行灭活，并提取病毒RNA；将经所述步骤S1提取质检合格的病毒RNA反转进行cDNA合成；使用特异引物进行片段扩增形成PCR反应产物样品；对所述PCR反应产物样品进行标识，并构建测序文库；所述测序文库进行纳米孔测序操作。该过程繁琐耗时，并且需要专门的安全等级实验室和专业人员才能完成，限制了检测能力。
截至目前，有一些方法围绕等温扩增进行改进，如LAMP运用多对引物进行滚换扩增，运用CRISPR/Cas技术进行超低频检测等。例如，CN111549177A公开了一种用于检测SARS-CoV-2的gRNA，该gRNA包括与Cas核酸酶相互作用的框架核酸片段，以及与靶核酸结合的特异性核酸片段，特异性核酸片段包括序列表所示的核酸片段。
基于CRISPR/Cas技术从一定程度上简化了核酸检测的过程，但根本的一点在于，这些方法都需要先提取病毒RNA，逆转录后再进行操作，这一步骤的专业性和耗时是限制核酸检测走入平常百姓家的最大制约。
发明内容
为了解决现有技术中核酸检测过程繁琐耗时、检测灵敏度不高的问题，本发明提供一种核酸，特别是RNA检测的试剂盒、反应体系及方法。本发明的检测方法直接利用核酸，如病毒RNA作为特制环骨架的扩增引物，并在恒温下进行等温扩增，无需核酸的提取，在RNA的情况下无需反转录，扩增过程只涉及两个温度。另外，本发明的反应体系中按比例掺入dUTP作为二次扩增引物的切割位点，从而可以实现痕量RNA的检测。至少基于此完成了本发明。具体地，本发明包括以下内容。
本发明的第一方面，提供一种核酸检测方法，其包括以下步骤：
(1)提供环状单链DNA分子模板的步骤；
(2)使待检测核酸，如病毒RNA打断得到片段，如30-40bp小片段，或者设计专门引物作为一次引物，然后在含有链置换酶和dUTP的反应溶液中进行第一恒温滚环扩增得到扩增产物的步骤；
(3)通过切刻酶将所述扩增产物切割为适于作为二次引物片段的步骤；和
(4)在足以使切刻酶失活的温度下进行第二恒温滚环扩增的步骤。
根据本发明的核酸检测方法，优选地，所述反应溶液进一步包含dTTP，且dUTP与dTTP的摩尔比为1:3-10。还优选地，dUTP与dTTP的摩尔比为1:4-9。进一步优选地，dUTP与dTTP的摩尔比为1:5-8。
根据本发明的核酸检测方法，优选地，所述二次引物的长度为20-50bp。进一步优选地，二次引物的长度为30-50bp。更优选地，二次引物的长度为30-40bp。
根据本发明的核酸检测方法，优选地，所述第一恒温滚环扩增的温度为50-70℃，和/或所述足以使切刻酶失活的温度为50-70℃。还优选地，所述第一恒温滚环扩增的温度为60-70℃，和/或所述足以使切刻酶失活的温度为60-70℃。进一步优选地，所述第一恒温滚环扩增的温度为60-65℃，和/或所述足以使切刻酶失活的温度为60-65℃。
优选地，本发明中，第二恒温滚环扩增的温度可以与第一恒温滚环扩增的温度相同，也可以不同。更优选地，第二恒温滚环扩增的温度为50-70℃。
根据本发明的核酸检测方法，优选地，所述环状单链DNA分子通过下述方法制备：
a.单链DNA设计合成，得到具有特定序列的单链DNA，将所述单链DNA进行5’端磷酸化修饰得到经磷酸化修饰的单链DNA；
b.将所述经磷酸化修饰的单链DNA经环化连接酶环化扩增后得到环状单链DNA分子。
根据本发明的核酸检测方法，优选地，所述单链DNA为100bp。
根据本发明的核酸检测方法，优选地，所述步骤a中的特定序列的单链DNA具有如SEQ ID No.4-11所示的序列。
根据本发明的核酸检测方法，优选地，所述核酸包括源自病毒的RNA，如源自SARS-COVID2的RNA。
根据本发明的核酸检测方法，优选地，所述步骤a中，单链DNA设计合成包括以下步骤：
通过NCBI下载基因组，包括参考基因组以及RNA病毒基因组，在基因组中过滤掉RNA病毒的序列；以k＝16将基因组序列文件切kmer得到包含16碱基的短序列集合；从短序列集合中挑选出在RNA病毒中存在，但在其他集合中不存在的短序列，作为候选k-mer；在参考基因组上选择连续的序列，使该序列中的每一个k-mer(k＝16)都在候选k-mer中；将序列按照首尾相连成100bp环，检查该环的连接处的特异性，如果每个连接处都能保证衔接k-mer(k＝16)都在候选k-mer中，则输出该环。
优选地，所述步骤(2)中，进行环化扩增的体系为：
100bp单链DNA(100ng/ul):1ul；
CircLigaseTM10X Reaction Buffer(CL4111K):2ul；
CircLigaseTMssDNA Ligase(100U):1ul；
T4 Polynucleotide Kinase(500U):1ul；
l ATP(1mM):1ul；
H2O:14ul；
Total:20ul。
优选地，进行环化扩增的条件为37℃15min、60℃4h。
优选地，所述步骤(2)中，进行核酸外切酶酶切扩增的体系为：环化扩增的体系加入Exo I：1ul、Exo III：1ul。
优选地，进行核酸外切酶酶切扩增的条件为37℃3h、90℃4min。
将酶切后的产物使用MinElute Reaction Cleanup Kit(QIAGEN)纯化后-20℃保存待用。
本发明的第二方面，提供用于核酸检测的试剂盒，其包含环状单链DNA分子、切刻酶、链置换酶和三磷酸脱氧核苷混合物，其中所述三磷酸脱氧核苷混合物包含dTTP、dUTP、dCTP、dGTP和dATP，且dUTP与dTTP的摩尔比为1:3-10，优选1:4-9，还优选为1:4-8。
根据本发明所述的用于核酸检测的试剂盒，优选地，所述环状单链DNA分子和三磷酸脱氧核苷混合物以溶解于同一缓冲液的方式设置，所述切刻酶和链置换酶分别以单独存放方式设置。
优选地，所述试剂盒还可包括用于维持适于切刻酶和链置换酶酶活性pH的缓冲液。
本发明的第三方面，提供一种用于核酸检测的反应体系，其包含缓冲液和溶解于所述缓冲液的环状单链DNA分子、链置换酶和三磷酸脱氧核苷混合物，其中三磷酸脱氧核苷混合物包含dTTP、dUTP、dCTP、dGTP和dATP，且dUTP与dTTP的摩尔比为1:3-10。还优选地，dUTP与dTTP的摩尔比为1:4-9。进一步优选地，dUTP与dTTP的摩尔比为1:5-8。
本发明通过滚换扩增方法，短时间内能大量扩增，有效保障了检测灵敏性，该方法在恒温条件下进行，并且简化核酸如病毒RNA处理过程，只需加热打断，或者设计相应的引物，作为后续滚换扩增的引物。本发明还涉及一种“二次点火”的信号放大方法，可进一步降低检测浓度。
本发明的检测方法不仅简化了核酸如RNA病毒的检测步骤，节约时间，而且扩增过程只涉及两个温度，无需专业设备以及复杂的热循环过程，常温或者简单的水浴就可完成，能够在2小时内完成检测。另外，整个反应可以在同一反应管中进行，有效避免了各步骤间的纯化，提高了实验效率。
附图说明
图1为由环骨架合成、RNA引物的打断以及基于环骨架的扩增示意图。
图2为环化酶处理单链DNA分子后的电泳图(图中从左至右的泳道依次表示：环化酶处理、环化酶+Exo消化、Control和Maker)。
图3和图4为荧光检测结果(1表示酶体系+dUTP；2表示环骨架+酶体系+dUTP；3表示引物+酶体系+dUTP；4表示环骨架+人基因组打断DNA(1ng)+酶体系+dUTP；5表示环骨架+引物+酶体系+dNTP；6表示环骨架+引物+酶体系+dUTP)。
图5为RNA不同打断条件的电泳图。
图6为相同打断条件下对应的人基因组DNA的电泳图。
图7和图8为滚换扩增不同反应条件得到的DNA电泳图。
图9为使用玉米提取RNA的电泳图。
图10-11为待检测RNA进行打断后通过滚换扩增后的荧光检测结果。
具体实施方式
现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为具体公开了该范围的上限和下限以及它们之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。
本文所用术语“DNA”是指由脱氧核糖核苷酸组成的聚合物。DNA是脱氧核糖核酸的常用缩写。它是由核苷酸组成的聚合物。这些核苷酸通常是脱氧腺苷单磷酸、脱氧胸苷单磷酸、脱氧鸟苷单磷酸和脱氧胞苷单磷酸单体，它们本身由糖部分(脱氧核糖)、碱基部分和磷酸部分组成，并通过特征性的骨架结构聚合。通常，骨架结构由第一核苷酸的糖部分即脱氧核糖和第二相邻单体的磷酸部分之间的磷酸二酯键形成。单体的特定顺序，即与糖/磷酸骨架相连的碱基的顺序，被称为DNA序列。DNA可以是单链或双链的。在双链形式中，第一链的核苷酸通常与第二链的核苷酸杂交，例如通过A/T碱基配对和G/C碱基配对杂交。
本文所用术语“RNA”是指由核糖核苷酸组成的聚合物，RNA是核糖核酸的常用缩写。它是即由核苷酸组成的聚合物。这些核苷酸通常是腺苷单磷酸单体、尿苷单磷酸单体、鸟苷单磷酸单体和胞苷单磷酸酯单体，它们沿着“骨架”相互连接。骨架是由第一单体的糖部分即核糖和第二相邻单体的磷酸部分之间的磷酸二酯键形成的。单体的特定顺序称为RNA序列。通常，RNA可以通过DNA序列例如在细胞内部的转录而获得。在病毒中，尤其是RNA病毒中，其RNA可以是单链(ssRNA single-stranded RNA)，也可以是双链(dsRNA double-stranded RNA)。
本文所用术语“环状单链DNA分子”，有时也称为骨架环，是指用于本发明滚环扩增的模板。该骨架环优选由具有特定序列的单链DNA(5’端磷酸化修饰)经环化酶催化下形成。通常骨架环是根据待检测的RNA序列而人为设计，其通常并非天然分子。优选地，骨架环的序列不与样本背景中的核酸序列相同或互补。
本文所用术语“滚环扩增”，有时也称为滚换扩增，是指以环状DNA为模板，通过一个短的与部分环状模板互补的引物，本发明中，该引物包括DNA，优选为RNA。在酶催化下，上游引物延伸到下游引物结合点并置换下游引物，在短时间内得到大量单链DNA，此单链DNA包含成百上千个重复的模板互补片段(如图1所示)。本发明中，第一恒温滚环扩增过程中采用掺入dUTP方式引入切割位点，通过切刻酶(或切割酶)特异性识别和删除扩增的核酸片段中的尿嘧啶核苷酸，从而实现序列长度的可控。用于滚环反应的酶包括链置换酶，该酶为具有强的持续性和链置换活性的聚合酶，尤其是具有5’→3’的聚合酶活性和强链置换活性，但不具有5’→3’核酸外切酶活性，例如Phi29DNA聚合酶、野生型Bst DNA聚合酶或经优化的Bst DNA聚合酶。当使用优化的Bst DNA聚合酶时，其具有耐高浓度扩增抑制剂和显著增强的反转录酶活性。
实施例1
本实施例为骨架环的设计合成以及滚环等温扩增进行检测的方法，具体如下。
1.骨架环DNA设计合成
以SEQ ID NO.1所示序列作为待测RNA分子(该序列包含COVID-19病毒ORF1ab和N基因mRNA)，以人类GRch38参考基因组、人类宿主细菌、真菌、病毒基因组为参考；在以人类为宿主的微生物基因组中过滤掉待测RNA的序列。
SEQIDNO.1：AGUUGACUUCGCAGUGGCUAACUAACAUCUUUGGCACUGUUUAUGAAAAACUCAAACCCGUCCUUGAUUGGCUUGAAGAGAAGUUUAAGGAAGGUGUAGAGACCCUGUGGGUUUUACACUUAAAAACACAGUCUGUACCGUCUGCGGUAUGUGGAAAGGUUAUGGCUGUAGUUGUGAUCAACUCCGCGAACCCAUGCUUCAGUCAGCUGAUGCACAAUCGUUUUUACUCCAGGCAGCAGUAGGGGAACUUCUCCUGCUAGAAUGGCUGGCAAUGGCGGUGAUGCUGCUCUUGCUUUGCUGCUGCUUGACAGAUUGAACCAGCUUGAGAGCAAAAUGUCUGGUAAA。
以k＝16bp将上述下载的5类基因组序列文件(待测RNA、人类、以人为宿主的细菌、真菌以及过滤后的病毒基因组序列)切k-mer，得到5个一连串包含16碱基的短序列集合。
从上述短序列集合中挑选出在新冠病毒中存在，但在其他4个集合中不存在的短序列，作为候选k-mer。
在参考基因组上选择连续的20bp序列，使该20bp序列中的每一个k-mer(k＝16)都在候选k-mer中。
将序列按照1-2-3-4-5-1首尾相连成100bp环，检查该环的连接处(1-2、2-3、3-4、4-5、5-1)的特异性，如果每个连接处都能保证衔接k-mer(k＝16)都在候选k-mer中，则输出该环。合成交由Invitrogen,Life Technologies完成。具体序列如SEQ ID NO.2和3所示。
SEQ ID No.2:GACTGAAGCATGGGTTCGCGGCTACACCTTCCTTAAACTTCGAGTTGATCACAACTACAGCCCACATACCGCAGACGGTACCCAAAGATGTTAGTTAGCC；
SEQ ID No.3:GAGTTGATCACAACTACAGTCCACATACCGCAGACGGTACTTAGTTAGCCACTGCGAAGTCAACTGCATGGGTTCGCGGAGTTGGGAGTTGAT CACAACTACAGCC。
2.合成DNA5’端做磷酸化修饰，用H2O稀释至100ng/ul，浓度标定用Qubit ssDNAAssay Kitfor use with the Qubit 2.0 Fluorometer。catalog#：Q10212-kit完成。
3.骨架环的制备
3.1环化扩增
3.1.1环化扩增体系：
100bp单链DNA(100ng/ul):1ul
CircLigaseTM10X Reaction Buffer(CL4111K):2ul
CircLigaseTMssDNA Ligase(100U):1ul
T4 Polynucleotide Kinase(500U):1ul
1ATP(1mM):1ul
H2O:14ul
Total:20ul。
3.1.2环化扩增所用仪器：PCR仪(BiometraTAdvanced 96SG)。
3.1.3环化扩增条件：在PCR仪内反应60℃4h、25℃1h。上述体系反应完成后90℃4min，立即置于冰上。
3.2核酸外切酶酶切
3.2.1核酸外切酶：Exo I：Exonuclease I(NEB,M0293S)；
Exo III：Exonuclease III(NEB,M0206S)。
3.2.2核酸外切酶体系：
在上述环化扩增体系中加入Exo I：1ul、Exo III：1ul。
3.2.3酶切条件：
在PCR仪内反应37℃3h、90℃4min，立即置于冰上。
3.2.4产物纯化
使用MinElute Reaction Cleanup Kit(QIAGEN)，将上述酶切产物与300ulBuffer ERC充分混匀，然后转移至MinElute column中，置于离心机中13000rpm 1min，倒掉收集管中液体，然后加入750ul Buffer PE(Buffer PE需提前按要求加入无水乙醇)，13000rpm离心1min，充分晾干后分别两次在MinElute column中加入10ul Buffer PE洗脱，收集到干净的1.5ml离心管中。
3.3骨架环检测：
3.3.1所用仪器：BIO-RAD Mini-Tetra电泳槽，catalog#：1658000；TBE：Solarbio，catalog#：T1050-500ml；Low Range ssRNA Ladder，NEB，catalog#：N0364S；QubitTM3 Fluorometer，ThermoFish，catalog#：Q33216；Qubit ssDNA Assay Kit,for usewith the Qubit 2.0 Fluorometer，catalog#：Q10212-kit。
用Qubit标定骨架环的浓度，取20ng骨架环，加入loading buffer，使用10％核酸变性预制胶(Solarbio,NG01010-S-10块)进行检测(200V,60min)，检测结果如图2所示。
4.RNA引物合成
由于病毒检测需要生物安全二级实验室，本实验室没有该安全级别，故该实施例使用合成的短链RNA作为RNA打断后的代替品进行实验。短链RNA的序列为：
1.GGCUAACUAACAUCUUUGGGUACCGUCUGC
2.CGGUAUGUGGACUGUAGUUGUGAUCAACUC
5.滚换扩增
5.1滚换扩增体系：
rCutSmart Buffer:2.5ul
Bst3.0 DNA Polymerase(8,000U/ml)(NEB,M0374L):1ul
dNTP mix(C:G:A:T:U＝1:1:1:7/8:1/8):0.5ul
骨架环DNA(5ng/ul):1ul
RNA引物(8.5ng/ul)：1ul
H2O：19ul
Total：25ul。
5.2滚换扩增反应条件：65℃20min，冷却后加入USER Enzyme(1000U/ml)(NEB,M5505S):1.5ul、T4 Polynucleotide Kinase(500U)(NEB,M02 01S):0.5ul，在37℃15min、65℃20min条件下反应。
按照实验步骤设置对照进行实验：
1.酶体系+掺入dUTP
2.环骨架+酶体系+掺入dUTP
3.引物+酶体系+掺入dUTP
4.环骨架+人基因组打断DNA(1ng)+酶体系+掺入dUTP
5.环骨架+RNA引物+酶体系+dNTP
6.环骨架+RNA引物+酶体系+掺入dUTP
6.荧光检测：
SYBR GOLD NUCLEIC ACID(Invitrogen,S11494)用TE buffer稀释10倍，取2ul稀释液加入反应体系，在BIO-RAD ChemiDoc XRS+Imaging System下用紫外成像。
最终结果如图3和图4所示，只有环骨架与引物的组合会特异性扩增出结果，掺入dUTP的体系会发生二次点火扩增，产量为390ng，比单纯的滚换扩增产量增加一倍。
实施例2
本实施例用于实验对单链DNA引物的检测能力。
使用COVID-19病毒全基因组作为待检测对象，使用本专利的骨架环设计方法，设计如下8条100bp的单链DNA分子制备成环骨架，其序列如SEQ ID No.4-11：
SEQ ID No.4:AGATCTCATATACCGAGCAGAAGTGACGCTACAGTTGTTTACGTCGCGAACCTGTAAAACTGTATGCCCCTCCGTTAAGCCGGACGAAACCTAGATGTGC；
SEQ ID No.5:CGGACGAAACCTAGATGTGCGATGCTATGTCACGAGTGACGAGATCTCATATACCGAGCAGAACGTTCCGTGTACCAAGCTACACCCCTCTTAGTGTCAA；
SEQ ID No.6:ACGTCGCGAACCTGTAAAACTGTATGCCCCTCCGTTAAGCTGAATAGGACACGGGTCATCAAACATCCGTAATAGGACCTAAGTGACGCTACAGTTGTTT；
SEQ ID No.7:CGGACGAAACCTAGATGTGCAGATCTCATATACCGAGCAGAACACCGTGTAACTATGTTAGACTACACGTCTCTTTAGGTGTTGTGTGGTAGTACTCAAA；
SEQ ID No.8:GACTACACGTCTCTTTAGGTTGTATGCCCCTCCGTTAAGCTAAAGACACGAACCGTTCAATTGGCGTATACGCGTAATATGATGCTATGTCACGAGTGAC；
SEQ ID No.9:ACGTCGCGAACCTGTAAAACTGTATGCCCCTCCGTTAAGCGTCACAGCGTCCTAGATGGTTGCACGTACATGTCTTATAGTGTATACGACATCAGTACTA；
SEQ ID No.10:AACACCGTGTAACTATGTTAACGTCGCGAACCTGTAAAACAAACGTTTAGCTAGTCCAATAGTCGTAACAATTAGTATGCAGCGTGCATAGCAGGGTCAG；
SEQ ID No.11:AGAACGTTCCGTGTACCAAGAGATCTCATATACCGAGCAGAAACACGCCAAGTAGGAGTATAGACTATATATCGTAAACGAGCTACACTACGTGCCCGCC。
受制于新冠病毒的采集和检测需要生物安全二级实验室，故该测试例使用TM值为65℃的八条单链DNA引物作为测试，其序列如SEQIDNo.12-19所示：
SEQ ID No.12：CGGAGGGGCATACAGTTTTACAGGTTCGCG；
SEQ ID No.13：TAGATGTGCGATGCTATGTCACGAG；
SEQ ID No.14：AGGTCCTATTACGGATGTTTGATGACCCGT；
SEQ ID No.15：ACCTAAAGAGACGTGTAGTCTAACATAGTT；
SEQ ID No.16：ATATTACGCGTATACGCCAATTGAACGGTT；
SEQ ID No.17：CTATAAGACATGTACGTGCAACCATCTAGG；
SEQ ID No.18：GCATACTAATTGTTACGACTATTGGACTAG；
SEQ ID No.19：CGTTTACGATATATAGTCTATACTCCTACT。
投入3ng环状DNA以及10uM DNA引物，按以下条件设置实验条件：
1.5’端磷酸化DNA引物60度反应1h；
2.3’端磷酸化DNA引物60度反应1h；
3.5’端磷酸化引物control；
4.3’端磷酸化引物control。
实验结果如图7所示，反应1产出ssDNA1850ng。
实施例3
本实施例用于摸索RNA打断的条件。
RNA打断和镁离子浓度、温度和反应时间有关。
使用玉米B73为材料提取RNA，RNA结果如图9所示。在进行多项测试后，结果如图5所示，在镁离子浓度为4mM，95℃下反应30分钟以上，能够得到较好的打断结果，作为干扰项的人基因组DNA在同等条件下还处于较大片段(如图6所示)。
实施例4
本实施例采用以下合成的100nt待检测RNA进行打断后扩增检测，
RNA序列如下：
SEQ ID No.20：GUUGGUUGGAAGACCGAACUUGUCACUGGCUAGUGGCAAAGUUAGAGGAGUUCCUGCCAUCGAAUUGGAACAAAUGUACACGGAGUCGAGCUCAACCCGC。
相对于合成骨架环的DNA序列：
SEQ ID No.21：GCGGGTTGAGCTCGACTCCGTGTACATTTGTTCCAATTCGATGGCAGGAACTCCTCTAACTTTGCCACTAGCCAGTGACAAGTTCGGTCTTCCAACCAAC。
按实验步骤制作骨架环。
RNA打断体系如下：
100mM Tris(pH 8.0)
4mM MgCl2。
打断时间：将含有待检测RNA在打断体系中进行95℃30min处理。
按滚环扩增的实验步骤进行扩增反应，并按照实验步骤设置对照进行实验。
1.酶体系+掺入dUTP
2.环骨架+酶体系+掺入dUTP
3.RNA打断产物+酶体系+掺入dUTP
4.环骨架+人基因组打断DNA(1ng)+酶体系+掺入dUTP
5.环骨架+RNA打断产物+酶体系+dNTP
6.环骨架+RNA打断产物+酶体系+掺入dUTP
荧光检测结果如图10-11所示。
尽管本发明已经参考示例性实施方案进行了描述，但应理解本发明不限于公开的示例性实施方案。在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的示例性实施方案做多种调整或变化。权利要求的范围应基于最宽的解释以涵盖所有修改和等同结构与功能。
序列表
<110> 中国农业科学院农业基因组研究所
<120> 核酸检测试剂盒、反应体系及方法
<130> BH2110474
<141> 2021-09-15
<160> 21
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 345
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
aguugacuuc gcaguggcua acuaacaucu uuggcacugu uuaugaaaaa cucaaacccg 60
uccuugauug gcuugaagag aaguuuaagg aagguguaga gacccugugg guuuuacacu 120
uaaaaacaca gucuguaccg ucugcgguau guggaaaggu uauggcugua guugugauca 180
acuccgcgaa cccaugcuuc agucagcuga ugcacaaucg uuuuuacucc aggcagcagu 240
aggggaacuu cuccugcuag aauggcuggc aauggcggug augcugcucu ugcuuugcug 300
cugcuugaca gauugaacca gcuugagagc aaaaugucug guaaa 345
<210> 2
<211> 100
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gactgaagca tgggttcgcg gctacacctt ccttaaactt cgagttgatc acaactacag 60
cccacatacc gcagacggta cccaaagatg ttagttagcc 100
<210> 3
<211> 106
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
gagttgatca caactacagt ccacataccg cagacggtac ttagttagcc actgcgaagt 60
caactgcatg ggttcgcgga gttgggagtt gatcacaact acagcc 106
<210> 4
<211> 100
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
agatctcata taccgagcag aagtgacgct acagttgttt acgtcgcgaa cctgtaaaac 60
tgtatgcccc tccgttaagc cggacgaaac ctagatgtgc 100
<210> 5
<211> 100
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
cggacgaaac ctagatgtgc gatgctatgt cacgagtgac gagatctcat ataccgagca 60
gaacgttccg tgtaccaagc tacacccctc ttagtgtcaa 100
<210> 6
<211> 100
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
acgtcgcgaa cctgtaaaac tgtatgcccc tccgttaagc tgaataggac acgggtcatc 60
aaacatccgt aataggacct aagtgacgct acagttgttt 100
<210> 7
<211> 100
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
cggacgaaac ctagatgtgc agatctcata taccgagcag aacaccgtgt aactatgtta 60
gactacacgt ctctttaggt gttgtgtggt agtactcaaa 100
<210> 8
<211> 100
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
gactacacgt ctctttaggt tgtatgcccc tccgttaagc taaagacacg aaccgttcaa 60
ttggcgtata cgcgtaatat gatgctatgt cacgagtgac 100
<210> 9
<211> 100
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
acgtcgcgaa cctgtaaaac tgtatgcccc tccgttaagc gtcacagcgt cctagatggt 60
tgcacgtaca tgtcttatag tgtatacgac atcagtacta 100
<210> 10
<211> 100
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
aacaccgtgt aactatgtta acgtcgcgaa cctgtaaaac aaacgtttag ctagtccaat 60
agtcgtaaca attagtatgc agcgtgcata gcagggtcag 100
<210> 11
<211> 100
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
agaacgttcc gtgtaccaag agatctcata taccgagcag aaacacgcca agtaggagta 60
tagactatat atcgtaaacg agctacacta cgtgcccgcc 100
<210> 12
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
cggaggggca tacagtttta caggttcgcg 30
<210> 13
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
tagatgtgcg atgctatgtc acgag 25
<210> 14
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
aggtcctatt acggatgttt gatgacccgt 30
<210> 15
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
acctaaagag acgtgtagtc taacatagtt 30
<210> 16
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
atattacgcg tatacgccaa ttgaacggtt 30
<210> 17
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
ctataagaca tgtacgtgca accatctagg 30
<210> 18
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
gcatactaat tgttacgact attggactag 30
<210> 19
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
cgtttacgat atatagtcta tactcctact 30
<210> 20
<211> 100
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
guugguugga agaccgaacu ugucacuggc uaguggcaaa guuagaggag uuccugccau 60
cgaauuggaa caaauguaca cggagucgag cucaacccgc 100
<210> 21
<211> 100
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
gcgggttgag ctcgactccg tgtacatttg ttccaattcg atggcaggaa ctcctctaac 60
tttgccacta gccagtgaca agttcggtct tccaaccaac 100

Claims (10)

1.一种核酸检测方法，其特征在于，其包括以下步骤：
(1) 提供环状单链DNA分子模板的步骤，其中所述环状单链DNA分子根据待检测的RNA序列而人为设计，且其序列不与样本背景中的核酸序列相同或互补，通过NCBI下载基因组，包括参考基因组以及RNA病毒基因组，在基因组中过滤掉RNA病毒的序列，以k＝16将基因组序列文件切k-mer得到包含16碱基的短序列集合，从短序列集合中挑选出在RNA病毒中存在，但在其他集合中不存在的短序列，作为候选k-mer，在参考基因组上选择连续的序列，使该序列中的每一个k-mer都在候选k-mer中，将序列按照首尾相连成100bp环，检查该环的连接处的特异性，如果每个连接处都能保证衔接k-mer都在候选k-mer中，则输出该环；
(2) 使待检测的核酸打断得到的片段作为一次引物，然后在含有链置换酶和dUTP的反应溶液中进行第一恒温滚环扩增得到扩增产物的步骤；
(3) 通过切刻酶将所述扩增产物切割为适于作为二次引物片段的步骤，其中所述切刻酶为特异性识别和删除扩增的核酸片段中的尿嘧啶核苷酸的酶；和
(4) 在足以使切刻酶失活的温度下进行第二恒温滚环扩增的步骤。
2.根据权利要求1所述的核酸检测方法，其特征在于，所述反应溶液进一步包含dTTP，且dUTP与dTTP的摩尔比为1:3-10。
3.根据权利要求1所述的核酸检测方法，其特征在于，所述二次引物的长度为20-50bp。
4.根据权利要求1所述的核酸检测方法，其特征在于，所述第一恒温滚环扩增的温度为50-70℃，和/或所述足以使切刻酶失活的温度为50-70℃。
5.根据权利要求1所述的核酸检测方法，其特征在于，所述环状单链DNA分子通过下述方法制备：
a. 单链DNA设计合成，得到含有待检测的核酸序列的单链DNA，将所述单链DNA进行5’端磷酸化修饰得到经磷酸化修饰的单链DNA；
b. 将所述经磷酸化修饰的单链DNA经环化连接酶环化扩增后得到环状单链DNA分子。
6.根据权利要求1所述的核酸检测方法，其特征在于，所述核酸为RNA和/或单链DNA。
7.根据权利要求6所述的核酸检测方法，其特征在于，所述RNA包括真核生物RNA、原核生物RNA和病毒RNA。
8.一种用于根据权利要求1-7任一项所述核酸检测方法的试剂盒，其特征在于，其包含环状单链DNA分子、切刻酶、链置换酶和三磷酸脱氧核苷混合物，其中所述三磷酸脱氧核苷混合物包含dTTP、dUTP、dCTP、dGTP和dATP，且dUTP与dTTP的摩尔比为1:3-10。
9.根据权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，所述环状单链DNA分子和三磷酸脱氧核苷混合物以溶解于同一缓冲液的方式设置，所述切刻酶和链置换酶分别以单独存放方式设置。
10.一种用于根据权利要求1-7任一项所述核酸检测方法的反应体系，其特征在于，其包含缓冲液和溶解于所述缓冲液的环状单链DNA分子、链置换酶和三磷酸脱氧核苷混合物，其中三磷酸脱氧核苷混合物包含dTTP、dUTP、dCTP、dGTP和dATP，且dUTP与dTTP的摩尔比为1:3-10。
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